心肌纖維化關(guān)鍵基因與通路的研究及有效中藥預(yù)測

周 宙，王 震，劉 楊，王 詠，楊傳華

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟南 250000）

心肌纖維化是多種心臟疾病的病理基礎(chǔ)，當(dāng)心臟損害或心臟負(fù)荷過重時，多種物質(zhì)引起成纖維細(xì)胞活化并且向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，心肌纖維化在心肌重塑過程中發(fā)揮核心作用［1］。嚴(yán)重的心肌纖維化可誘發(fā)心肌肥厚，相對供血不足，室壁硬度增加，心室活動受限，繼而出現(xiàn)心泵血功能障礙，導(dǎo)致心力衰竭。甚至有人提出：如果挽救20%的“有風(fēng)險心肌”即可避免心力衰竭的發(fā)生［2］?！吨袊难芙】蹬c疾病報告2019》表明［3］：當(dāng)前我國心力衰竭患者估算值為890 萬，China-HF 研究入選的2012 年1 月～2015 年9 月全國132 家醫(yī)院13 687 例心力衰竭患者中住院心力衰竭患者的病死率為4.1%。因此心力衰竭的治療依然是當(dāng)前心血管疾病研究的焦點，而改善心肌纖維化是治療心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療心力衰竭雖然已經(jīng)有了一些的進展，但心肌纖維化等因素的發(fā)病機制尚未完全明確，改善心肌纖維化依舊是難以攻克的問題，現(xiàn)有的治療方案療效有限。中醫(yī)治療疾病具有多組分、多靶點、多途徑的優(yōu)勢，對于心力衰竭療效顯著，能夠明顯改善患者的臨床癥狀、提高心功能、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的發(fā)展，但其藥理學(xué)以及分子機制缺乏精確闡述［4-6］。因此，需要深入探索中醫(yī)藥治療心肌纖維化的分子機制，找到潛在的治療靶點，為中醫(yī)藥對心力衰竭的治療提供新的科學(xué)借鑒。

生物信息學(xué)是以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學(xué)。醫(yī)學(xué)研究可以利用生物信息學(xué)對數(shù)據(jù)庫的挖掘分析，從功能基因表達的差異中找到潛在的治療靶點。以生物信息學(xué)多靶點宏觀視角與微觀分子機制相結(jié)合探索治療疾病的分子機制并預(yù)測潛在的中藥，既符合中醫(yī)診療重視整體的理念又有利于實現(xiàn)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究，促進中醫(yī)藥的發(fā)展并逐步走向世界。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取

以“heart failure”“myocardial remodeling”“myo?cardial fibrosis”等為檢索詞，在GEO 數(shù)據(jù)庫［7］檢索相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集，經(jīng)篩選下載芯片編號為GSE59437 的芯片原始文件，本芯片來自于中國首都醫(yī)科大學(xué)重塑相關(guān)心血管疾病重點實驗室，包含了3 例對照組小鼠以及使用血管緊張素Ⅱ干預(yù)7 d所構(gòu)建的小鼠心臟纖維化組織樣本的測序數(shù)據(jù)，測序平臺為：Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array［8］。所有程序經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)動物護理和使用委員會審核，符合美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗室動物護理指南》。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

基于R 語言Bioconductor 庫（http：//www.bio?conductor.org/）中的相關(guān)R 包對基因表達芯片進行處理。使用affyPLM 包對數(shù)據(jù)集進行擬合回歸計算，繪制相對對數(shù)表達（RLE）箱式圖和相對標(biāo)準(zhǔn)差（NUSE）箱式圖。使用affy 包獲取降解數(shù)據(jù)并繪制RNA 降解圖，評估RNA5′～3′降解斜率，予剔除降解嚴(yán)重的不可靠樣本。質(zhì)控后使用affy 包采用穩(wěn)固多芯片平均標(biāo)準(zhǔn)化分析法（robust mulitichip aver?age，RMA）預(yù)處理對照組和模型組數(shù)據(jù)并合并兩組數(shù)據(jù)，將探針?biāo)降臄?shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為基因表達數(shù)據(jù)，基于測序平臺注釋文件進行重新注釋，將探針名轉(zhuǎn)換為基因ID，使用最近鄰居法（k-nearest neighbor，KNN）補充原始數(shù)據(jù)缺失值，讀取基因水平的表達值。

1.3 差異表達基因的篩選

使用R 語言的limma 包，采用貝葉斯方法多重檢驗矯正，對標(biāo)準(zhǔn)化的芯片表達譜進行差異分析。設(shè)置閾值為：|log2FC| >1，P<0.05。 FC（fold change）代表兩組基因表達值間的差異倍數(shù)。使用R 語言進行可視化。

1.4 基因本體論注釋和京都基因與基因組百科全書富集分析

將DEGs 中與人類同源基因?qū)隓AVID 數(shù)據(jù)庫［9］（https：//david.ncifcrf.gov/），蛋白來源物種設(shè)置為“Homo sapiens”進行GO 生物過程（biological process）注釋，以P<0.05 為閾值篩選注釋并將富集最顯著的前10 個注釋進行可視化?；贙EGG 數(shù)據(jù)庫［10］對差異基因進行通路富集，以P<0.05 為閾值獲取富集顯著的信號通路，并對前十條通路進行可視化。

1.5 蛋白?蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并篩選核心基因模塊

將與人類同源的DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫［11］（https：//string-db.org/），將蛋白來源物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“medi?um confidence（>0.4）”，隱藏?zé)o相互作用的蛋白，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，進行蛋白相互作用分析，獲得相互作用數(shù)據(jù)。使用Cytoscape3.8.0 軟件實現(xiàn)PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化，使用分子復(fù)合物檢測（MCODE）插件［12］篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)性強的蛋白互作模塊，設(shè)置參數(shù)為：度值界限（degree cutoff）=2，節(jié)點分?jǐn)?shù)界限（node score cutoff）=0.2，K 核（K-core）=2，最大深度（Max.Depth）=100。

1.6 關(guān)鍵靶點預(yù)測潛在中藥

將篩選出的核心基因?qū)隒oremine Medical 數(shù)據(jù)庫（https：//coremine.com/medical/），以P<0.05為閾值獲得核心基因的相關(guān)中藥，利用Cytoscape進行可視化，并以degree≥3 為閾值獲得具有多靶點的中藥，基于中醫(yī)藥理論知識與現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究進展對預(yù)測中藥進行分析與篩選。

1.7 關(guān)鍵靶點的表達差異驗證

在GEO 數(shù)據(jù)庫獲取芯片GSE59437 所包含的其他3 個樣本：“GSM1436903”、“GSM1436904”、“GSM1436905”，樣本為使用血管緊張素Ⅱ干預(yù)3 d的小鼠纖維化心肌組織，采用上述相同方法對數(shù)據(jù)進行差異表達分析，驗證篩選的關(guān)鍵靶點在此驗組組中是否也發(fā)生顯著性差異表達。

2 結(jié)果

2.1 芯片資料

經(jīng)篩選，芯片編號為GSE59437 的數(shù)據(jù)集中的6個樣本（表1）被納入研究，該芯片的研究人員通過在8～10 周齡的C57BL/6 雄性小鼠植入滲透泵，以1 500 mg/kg/min 的速度在林格氏液（含0.01 mmol/L 乙酸的生理鹽水溶液）中注入血管緊張素Ⅱ，構(gòu)建組織纖維化模型，干預(yù)7 d 后使用TRIzol 法提取心肌組織中的總RNA（3 個樣本），并基于Af?fymetrix 基因芯片小鼠基因組430 2.0 陣列測序平臺對3 個模型組與3 個對照組的心肌組織總RNA 進行測序。

表1 樣本信息Tab 1 Information of sample

2.2 芯片數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制與預(yù)處理

REL 箱式圖顯示各樣本整體表達水平基本一致（比值接近1，對數(shù)值接近0），見圖1A。NUSE 箱式圖顯示所有樣本基因表達標(biāo)準(zhǔn)差基本一致（相對標(biāo)準(zhǔn)差接近1），見圖1B。RNA 降解曲線圖顯示各樣本5′端低于3′端，降解曲線斜率較小，說明樣本降解較少，見圖1C?？梢姳拘酒|(zhì)量較好，符合研究標(biāo)準(zhǔn)。使用RMA 法預(yù)處理數(shù)據(jù)，并將探針序列轉(zhuǎn)換為基因ID，采用KNN 法補充缺失值，共獲取20 744 個基因表達數(shù)據(jù)。

圖1 芯片質(zhì)量分析Fig 1 Quality analysis of chip

2.3 差異基因分析

將模型組數(shù)據(jù)與對照組數(shù)據(jù)對比，使用limma包進行差異分析，獲得滿足閾值（|log2FC|>1，P<0.05）的差異基因共208 個，其中94 個為上調(diào)基因，114 個為下調(diào)基因，使用R 語言的ggplot 包對數(shù)據(jù)進行可視化繪制火山圖（圖2）。根據(jù)差異基因表達量繪制各組差異基因總表達量小提琴圖（圖3A）。根據(jù)差異基因表達異質(zhì)水平進行聚類分析，繪制環(huán)形熱圖（圖3B）。小提琴圖提示模型組與對照組在差異基因表達量方面存在明顯不同，而組內(nèi)表達量趨于一致。環(huán)形熱圖提示模型組與對照組在不同聚類模塊間的表達存在明顯差異，而組內(nèi)各模塊基本相同，提示心肌纖維化的發(fā)生是這些差異基因差異性表達的結(jié)果。

圖2 基因表達火山圖Fig 2 Volcano plot of gene expression

圖3 差異基因表達分析Fig 3 Analysis of differential gene expression

2.4 GO 富集分析

將所有DEGs 導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫，識別其中與人類同源的基因共116 個（見表2）。使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對差異基因中與人類同源的基因進行GO 生物過程（biological process，BP）注釋，獲得富集結(jié)果，將富集具有顯著性（P<0.05）的前十條進行可視化（圖4），氣泡大小反映富集基因數(shù)，越大富集到的基因數(shù)越多；氣泡顏色代表富集顯著性，顏色越深富集越顯著。由圖可見，差異基因主要富集在細(xì)胞外纖維組織（extracellular fibril organization）、細(xì)胞外基質(zhì)組織（extracellular matrix organization）、肌絲滑動（muscle filament sliding）、細(xì)胞基質(zhì)黏附（cell-matrix adhesion）、膠原原纖維組織（collagen fi?bril organization）、脂質(zhì)代謝過程負(fù)調(diào)控（negative regulation of lipid metabolic process）、膽固醇轉(zhuǎn)運的負(fù)調(diào)控（negative regulation of cholesterol transport）、極低密度脂蛋白顆粒清除的負(fù)調(diào)控（negative regu?lation of very-low-density lipoprotein particle clear?ance）、肌肉收縮（muscle contraction）、乳糜微粒殘留清除率（chylomicron remnant clearance）等生物過程。提示這些差異基因與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、膠原纖維沉積以及脂質(zhì)代謝紊亂等密切相關(guān)。

圖4 GO 生物過程富集分析Fig 4 Enrichment analysis of GO biological processes

表2 與人類同源的差異表達基因Tab 2 Differentially expressed genes homologous to human

2.5 KEGG 通路富集分析

對與人同源的DEGs 進行通路富集分析，共得到16 條富集顯著（P<0.05）的通路，使用R 語言對前十條進行可視化（圖5）?？芍@些差異基因主要富集在血小板活化（platelet activation）、催產(chǎn)素信號通路（oxytocin signaling pathway）、胰島素分泌（in?sulin secretion）、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（ECMreceptor interaction）、GnRH 信號通路（GnRH signal?ing pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling path?way）等，提示心肌纖維化是一個涉及多通路的復(fù)雜病理過程。

圖5 KEGG 通路富集分析Fig 5 Enrichment analysis of KEGG pathway

2.6 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因篩選

使用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建同源差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)，最低互作閾值設(shè)置為0.4，隱藏?zé)o互作關(guān)系的獨立蛋白。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 進行可視化，得到的網(wǎng)絡(luò)共有64 個節(jié)點（node）、98 條邊（edge），節(jié)點代表差異基因蛋白，蛋白度值（degree）越高，顏色越深。邊表示蛋白與蛋白間相互作用關(guān)系，蛋白間結(jié)合分?jǐn)?shù)（combined score）越高，連接的邊越粗（圖6A）。使用MCODE 插件篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的模塊（圖6B），最大的模塊由7 個節(jié)點，19 條邊構(gòu)成，MCODE 評分為6.33，該模塊為PPI 網(wǎng)絡(luò)的核心模塊。 提示 CTGF、TIMP1、SPP1、SERPINE1、COL3A1、POSTN、FOS 等蛋白為PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點。

圖6 PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig 6 Network of PPI

2.7 治療心肌纖維化潛在中藥的預(yù)測與篩選

將篩選出的核心基因?qū)隒oremine Medical 數(shù)據(jù)庫，以P<0.05 為閾值獲得核心基因的相關(guān)中藥，使用Cytoscape 軟件進行可視化（圖7），共獲得相關(guān)中藥127 味，其中度值居于前五味的中藥丹參、茺蔚子、黃芪、關(guān)木通、葶藶子度值分別為4、4、4、3、3，可納入分析?；谥嗅t(yī)藥理論分析：丹參、黃芪、葶藶子具有活血化瘀、補氣升陽、行水消腫的作用，在中醫(yī)臨床中常用于心衰、喘證、胸痹等心肌重塑相關(guān)疾病的治療，具有治療心肌纖維化的價值［13，14］。

圖7 靶點相關(guān)中藥預(yù)測Fig 7 Prediction of target related traditional Chinese medicine

2.8 關(guān)鍵靶點的表達差異驗證

采取上述相同方法，對芯片質(zhì)量進行檢驗后（圖8A），進行驗證組與對照組基因表達差異分析并進行可視化（圖8B）。由圖可知，驗證組的數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，差異分析共獲得254 個顯著差異表達基因，在數(shù)據(jù)中查找本文2.6 中篩選的7 個關(guān)鍵靶點的表達情況，結(jié)果顯示，7 個關(guān)鍵靶點在驗證組中表達均具有顯著差異（已在火山圖中標(biāo)注），證實前文對關(guān)鍵靶點篩選的可靠性。

圖8 驗證組分析結(jié)果Fig 8 Analysis results of validation group

3 討論

課題組成員前期研究發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化是一個涉及內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌等多種調(diào)節(jié)途徑的復(fù)雜病理過程，其中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）、內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Endo-MT）、心肌成纖維細(xì)胞增殖均是導(dǎo)致心肌纖維化的重要誘因［6，15］。目前對于心肌纖維化的研究多局限于某一條通路或靶點，得出的結(jié)果不能充分地解釋心肌纖維化的機制，因此在治療方面難有重大突破。高通量測序技術(shù)具有覆蓋全面、測量精準(zhǔn)、篩選便捷等優(yōu)勢，基于此技術(shù)從的基因表達差異探究疾病的發(fā)病機制是一種高效率、多層次的研究手段。

血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）的主要效應(yīng)激素，目前已經(jīng)證實血管緊張素Ⅱ在心肌纖維化、心臟病理性肥大、心力衰竭的過程中發(fā)揮著重要的推動作用，其引起的病理性肥大和心肌間質(zhì)纖維化導(dǎo)致心室壁硬度增加，從而損害心臟的舒縮功能，是多種實驗?zāi)Ｐ秃托牧λソ呋颊叩闹匾ｋU因素，并且研究表明通過拮抗血管緊張素Ⅱ能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的發(fā)展，是心肌纖維化具有價值的治療策略［16，17］，因此本研究選取囊括了血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌纖維化小鼠模型的基因芯片展開研究。

3.1 細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和膠原纖維沉積是心肌纖維化的核心環(huán)節(jié)

對芯片GSE59437 進行預(yù)處理并分析獲得208個差異表達基因，其中與人類同源的基因為116 個。GO 富集提示同源差異基因主要與細(xì)胞外纖維組織、細(xì)胞外基質(zhì)組織、肌絲滑動、細(xì)胞基質(zhì)粘附、膠原原纖維組織、脂質(zhì)代謝過程的負(fù)調(diào)節(jié)、膽固醇轉(zhuǎn)運的負(fù)調(diào)節(jié)、極低密度脂蛋白顆粒清除率的負(fù)調(diào)節(jié)、肌肉收縮、乳糜微殘留間隙等生物過程相關(guān)。既往研究表明，心肌纖維化是以心肌中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白過度沉積為特征的病理過程，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的無序合成，導(dǎo)致了心臟發(fā)生結(jié)構(gòu)性的改變，影響心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)過程，繼而出現(xiàn)以收縮或舒張功能障礙為特征的心力衰竭［18］。心肌細(xì)胞外基質(zhì)主要由Ⅰ型和Ⅲ型原纖維膠原以及少量的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原和其他蛋白（纖維連接蛋白、層黏連蛋白、彈性蛋白等）組成，其中占比約85%的Ⅰ型原纖維膠原是負(fù)責(zé)賦予心肌拉伸強度的厚膠原，占比約11%的Ⅲ型原纖維膠原負(fù)責(zé)基質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)彈性［19］。細(xì)胞外基質(zhì)各成分的相對平衡，以及細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡對于維持心肌結(jié)構(gòu)的完整性至關(guān)重要，急性心肌梗死后，Ⅰ型和Ⅲ型原纖維膠原大量合成，導(dǎo)致心肌纖維化加劇，誘發(fā)心力衰竭的發(fā)生，研究表明心肌梗死患者住院前期Ⅲ型膠原前肽（PⅢNP）的升高（Ⅲ型原纖維膠原合成過程中的標(biāo)記物，提示原纖維膠原大量合成）是隨訪期心源性死亡或心力衰竭發(fā)生的預(yù)測因素［20］。此外，其他生物過程多涉及到脂質(zhì)代謝過程，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過16 周高脂飼養(yǎng)的沙鼠表現(xiàn)出明顯的體型肥胖和高脂血癥，但血糖水平?jīng)]有顯著的變化，病理學(xué)解剖顯示高脂血癥的沙鼠心臟出現(xiàn)結(jié)構(gòu)紊亂，主要包括心肌細(xì)胞肥大、脂質(zhì)沉積、間質(zhì)和血管纖維化、以及浸潤性中性粒細(xì)胞數(shù)量增多，提示脂質(zhì)代謝紊亂所造成的心肌代謝亦推動心肌纖維化的發(fā)展［21］。因此，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、膠原纖維沉積、脂質(zhì)代謝紊亂是治療心肌纖維化的重要環(huán)節(jié)。

3.2 心肌纖維化的發(fā)生是多條通路協(xié)同參與的結(jié)果

KEGG 通路富集表明，差異基因顯著富集的通路主要為：血小板活化、催產(chǎn)素信號通路、ECM 受體相互作用、腫瘤壞死因子-α 等信號通路，提示心肌纖維化涉及到內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、炎癥等多種機制。血小板活化對于原發(fā)性止血過程是必不可少的，但需要注意到，血小板活化在促炎癥中也發(fā)揮重要的作用，其引起的炎癥反應(yīng)能夠促進高血壓介導(dǎo)的心肌纖維化和心力衰竭的發(fā)展［22］。Liu等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，將使用血管緊張素Ⅱ構(gòu)建的高血壓WT 小鼠的血小板經(jīng)靜脈注入同窩未使用血管緊張素Ⅱ處理的WT 小鼠，發(fā)現(xiàn)接受血小板后的WT 小鼠心臟組織中炎癥因子（Mac-2、TGF-β1）陽性細(xì)胞明顯增多，膠原蛋白Ⅰ和TGF-β1 的mRNA表達水平也明顯上調(diào)，組織切片顯示接受血小板后的WT 小鼠心肌纖維化程度高于其他組，提示活化的血小板能夠促進心肌纖維化與炎癥的發(fā)生。既往研究證實催產(chǎn)素具有降壓、負(fù)性心力、調(diào)節(jié)副交感神經(jīng)、舒張血管等保護心臟和改善愈合過程等作用［24］，但最近的研究發(fā)現(xiàn)，心臟中特異性過度表達催產(chǎn)素的轉(zhuǎn)基因小鼠，在出生3 個月后即出現(xiàn)心力衰竭的發(fā)生，并且具有心臟擴張、收縮功能減退、心肌纖維化等現(xiàn)象，提示催產(chǎn)素對于心肌的影響存在雙面性，因此在心血管疾病的預(yù)防與保護中應(yīng)謹(jǐn)慎應(yīng)用催產(chǎn)素，深入研究其保護或加重心肌損壞的機制［25］。整合素家族是連接細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞骨架的異二聚體細(xì)胞黏附分子，是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體的主要組成部分，在調(diào)控增殖、分化、凋亡和細(xì)胞遷移等過程中發(fā)揮重要作用［26］。研究表明在心肌梗死的愈合階段整合素表達不斷升高，而在心肌重塑過程中降低，通過將整合素β1敲除的小鼠心肌梗死模型與模型對照組對比發(fā)現(xiàn)，整合素敲除小鼠的心功能顯著降低，而心肌纖維化和細(xì)胞凋亡水平高于模型對照組，提示整合素在心肌梗死后抗心肌纖維和保護心肌過程發(fā)揮重要作用［27］。腫瘤壞死因子-α（TNF）及其可溶性TNF 受體（TNFRs）是心力衰竭患者死亡率的獨立預(yù)測指標(biāo)，TNF 信號重要通過TNFR1 和TNFR2 兩個細(xì)胞表面受體實現(xiàn)，研究表明與正常野生型（WT）小鼠相比，TNFR1 和TN?FR2 基因敲除的WT 小鼠的4 周心肌梗死后生存率均顯著提高，然而TNFR1 敲除的小鼠表現(xiàn)出對心肌纖維化和收縮功能障礙的明顯改善，而在TN?FR2 敲除的小鼠中這些病理現(xiàn)象被促進，提示在制定治療性的抗TNF 策略時，應(yīng)當(dāng)考慮心力衰竭中TNF 受體的特異性作用［28］。心力衰竭患者的循環(huán)血液中TNF-α 以及多種炎癥因子均處于高水平，這些因子由心臟成纖維細(xì)胞分泌，并通過旁分泌對心肌細(xì)胞產(chǎn)生作用，導(dǎo)致心室重構(gòu)和心力衰竭，此外研究表明在心臟成纖維細(xì)胞單獨培養(yǎng)基中TNF-α水平較低，而在心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞的共同培養(yǎng)基中TNF-α 大量存在，這些發(fā)現(xiàn)表明心肌細(xì)胞與心臟成纖維細(xì)胞間的通訊以及旁分泌作用在心肌纖維化的發(fā)展中具有不可忽視的作用［29］。

3.3 心肌纖維化與多靶點的表達相關(guān)

由PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因篩選可知，PPI 網(wǎng)絡(luò)中包含 CTGF、TIMP1、SPP1、SERPINE1、COL3A1、POSTN、FOS 等7 個基因的模塊具于網(wǎng)絡(luò)核心位置，可能為心肌纖維化的關(guān)鍵模塊。此模塊下的基因主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)合成和成纖維細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)分化等過程［30，31］。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是一種生物學(xué)效應(yīng)廣泛的血管活性物質(zhì)，能夠促進血管生成、細(xì)胞趨化、促進成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成等過程［32］；Chen 等［33］發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化大鼠的心肌組織中CTGF 的表達顯著上調(diào)，而下調(diào)CTGF 的表達后心肌纖維化的水平也隨之受到抑制。心肌損傷時內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Endo-MT）生成膠原蛋白的能力較差，但在內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中分泌大量的CTGF，刺激心臟成纖維細(xì)胞向合成膠原蛋白能力更強的心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進心肌纖維化的發(fā)展［34］，提示心臟內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌對成纖維細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用可能為心肌纖維化的重要驅(qū)動因素?；|(zhì)金屬蛋白激酶（MMP）能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，使其處于動態(tài)平衡，但金屬蛋白激酶-1 抑制劑（TIMP1）能夠抑制MMP 的作用，在心肌纖維化的發(fā)展過程中TIMP1顯著上調(diào)［35］。膠原蛋白Ⅲ（COL3A1）是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，且臨床研究表明，心肌梗死后一個月Ⅲ型前膠原前肽與Ⅰ型前膠原前肽（膠原蛋白Ⅲ和膠原蛋白Ⅰ合成的標(biāo)記物）的比值與左室重構(gòu)有關(guān)［36］。課題組成員前期研究表明，中藥干預(yù)治療心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠模型，能夠顯著改善大鼠心功能，抑制心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展，并且大鼠心臟組織中的CTGF、TIMP1、COL3A1、COL1A1 的mRNA 表達均顯著下調(diào)，提示中藥干預(yù)了這些基因的表達而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用，也佐證了本研究的合理性［6，37］。

3.4 驗證結(jié)果表明核心靶點的篩選具有可靠性

通過將驗證組與對照組進行基因差異表達分析，發(fā)現(xiàn)上述核心靶點在驗證組均差異表達顯著，從火山圖得知7 個核心靶點均發(fā)生了上調(diào)，前文以闡明這些基因在心肌纖維化的發(fā)展過程中均發(fā)揮著促進纖維化的作用，因此驗證結(jié)果與當(dāng)前已有結(jié)論相一致，印證了研究結(jié)果的可靠性。

3.5 丹參、黃芪、葶藶子具有抗心肌纖維化的價值

藥物預(yù)測與篩選獲得與心肌纖維化最為相關(guān)的三味中藥：丹參、黃芪、葶藶子。三味藥物分別基于活血化瘀、補氣升陽、利水消腫治療心肌纖維化。

祖國醫(yī)學(xué)中并無“心肌纖維化”病名，根據(jù)心肌纖維化患者所表現(xiàn)的臨床癥狀，可將其歸納于“心衰”“喘證”“胸痹”等范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為：本病病機可概括為“本虛標(biāo)實”，其中本虛多數(shù)氣虛、陽虛，標(biāo)實多屬痰飲、血瘀。氣虛則無力推動脈中之營血，血行不暢則為瘀；血瘀則停于心間，阻遏氣血之運行且耗傷心氣，因而發(fā)為此本，治療當(dāng)以“益氣溫陽、活血利水”［38］。后世醫(yī)家認(rèn)為：“開鬼門，潔凈府，去菀陳莝”為其治療的宗旨［39］。丹參味苦、微寒，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載其具有“主心腹之邪氣……破癥除瘕，止煩滿，益氣”之功用，此藥用于心肌纖維化時，可除標(biāo)實之瘀血，與黃芪合用可補本虛之氣，標(biāo)本兼治，并且在以往的心肌纖維化治療中已廣泛使用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：丹參中的成分丹參素具有抑制心肌梗死模型SD 大鼠心肌組織中膠原蛋白的表達，改善心肌纖維化［40］。黃芪、葶藶子為治療心力衰竭的常用藥對的，黃芪補氣升陽，振奮衰竭之心氣，正所謂“氣為血之帥”，心氣充沛則瘀阻之血得以散，周身之血得以建運；葶藶子利水消腫，使停留心胸之水飲得去，且亦有瀉肺定喘之功用，二者合用與西醫(yī)所采用的“強心”“利尿”策略不謀而合。前期研究證實，包括黃芪、葶藶子在內(nèi)的鹿芪方治療心力衰竭療效明確，具有抑制RAS 系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)心肌纖維化、改善心功能、下調(diào)CTGF、TIMP1、COL3A1、COL1A1 的mRNA 表達等作用［6，15，37，41，42］。并且基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MC）測得黃芪甲苷和槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽皂甙分別為黃芪和葶藶子的主要成分，藥理學(xué)研究證實黃芪甲苷具有抗心肌纖維化的作用［43］，葶藶子提取物能夠降低腹主動脈束帶引起的大鼠心室總膠原含量，抑制心肌重構(gòu)［44］。因此，丹參、黃芪、葶藶子三味中藥治療心肌纖維化具有豐富的藥理學(xué)研究以及中醫(yī)理論基礎(chǔ)。

心肌纖維化是一個多過程、多通路、多靶點協(xié)同調(diào)控的病理過程，涉及細(xì)胞外基質(zhì)合成、膠原蛋白合成、炎癥反應(yīng)等多生物途徑，通過多種細(xì)胞分泌、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)相關(guān)的通路，對CTGF、TIMP1、SPP1、SERPINE1、COL3A1、POSTN、FOS 等靶點進行調(diào)控。本研究基于生物信息學(xué)對其機制進行挖掘，闡明其發(fā)病的差異基因的有關(guān)功能和參與的通路，驗證結(jié)果顯示篩選的關(guān)鍵靶點具有可靠性。本文還預(yù)測了與心肌纖維化治療有關(guān)的潛在中藥，并與課題組的前期研究相結(jié)合，證明丹參、黃芪、葶藶子三味中藥治療心肌纖維化具有理論與實踐的支撐，因此在臨床治療心肌纖維化的過程中應(yīng)當(dāng)重視這三味中藥的使用。同時筆者發(fā)現(xiàn)，心肌纖維化的發(fā)生可能涉及心肌成纖維細(xì)胞的自分泌或心肌其他細(xì)胞的旁分泌調(diào)節(jié)，而其中的具體機制尚未闡明，課題組將基于該科學(xué)問題進行下一步的研究，明確其發(fā)生機制，為心肌纖維化的深入研究與治療提供更多的研究基礎(chǔ)。

作者貢獻聲明

周宙：完成了課題實施、結(jié)果分析、論文撰寫；王震、劉楊：完成了文獻整理、方案檢查、結(jié)果分析；王詠：完成了論文的審查與修改；楊傳華：完成了課題設(shè)計、研究選擇、最終審核。