人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans侵染對人參生理指標(biāo)的影響△

高原，丁萬隆，龍期良，李勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans侵染對人參生理指標(biāo)的影響△

高原，丁萬隆，龍期良，李勇*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京100193)

人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans是為害人參的重要病原菌之一，在東北三省人參產(chǎn)區(qū)每年造成人參減產(chǎn)35%左右，損失極大。本文通過研究接種銹腐菌0d，0.25d，0.5d，1d，4d，7d和12d后人參葉片中丙二醛和脯氨酸含量及人參根系活力生理指標(biāo)變化情況，了解銹腐菌的侵染過程對人參生長的影響。試驗結(jié)果表明，人參葉片中丙二醛和脯氨酸含量變化與銹腐菌侵染進程正相關(guān)，根系活力變化與侵染過程無明顯相關(guān)關(guān)系。

人參銹腐菌；丙二醛；脯氨酸；根系活力

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬多年生藥用植物，常用于治療氣虛、心神不定、驚悸健忘等，具有極高的藥用價值[1]。但是，人參由野生變栽培后病害發(fā)生加劇，其中人參銹腐菌Cylindrocarpondestructans是為害最為嚴(yán)重的病害之一，整個生長季均可導(dǎo)致病害發(fā)生[2]。人參遭受銹腐菌侵染后，參苗會做出應(yīng)答反應(yīng)，某些生理指標(biāo)也會發(fā)生相應(yīng)變化。植物體內(nèi)的膜系統(tǒng)對維持代謝平衡起到重要作用，病原菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物會破壞寄主植物細胞膜蛋白結(jié)構(gòu)進而導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷[3]。脯氨酸是植物抵御逆境脅迫的一類滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，大量研究證明，脯氨酸積累與逆境脅迫程度正相關(guān)[4]。根系最先感受到脅迫，并迅速將脅迫信號傳導(dǎo)至整個植株，以便各個器官做出相應(yīng)的防御反應(yīng)。此外，根系活力也是衡量逆境脅迫的重要指標(biāo)。根系的健康狀況和活力水平直接對植物地上部分的營養(yǎng)狀況和代謝平衡產(chǎn)生影響[5-6]。為此，本文研究了銹腐菌侵染對人參苗葉片中脯氨酸含量、丙二醛含量和根系活力生理指標(biāo)變化的影響，為深入研究抗病機理，控制人參銹腐菌為害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試材料

1.1.1植物材料 供試植物材料為三年生健康人參苗，取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所實驗基地。

1.1.2供試菌株 人參銹腐菌C.destructans由課題組分離保存。

1.1.3供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：鮮土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂17g，蒸餾水1L，pH7.0。

1.2方法

1.2.1病原菌鑒定 病原菌形態(tài)觀察：將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)7d后，顯微鏡觀察菌落形態(tài)。病原菌致病性：采用室內(nèi)盆栽接種。將病原菌孢子懸浮液接種到室內(nèi)盆栽的健康三年生人參苗根部，接種濃度為5.25×106cfu·mL-1，接種量40mL，對照接種等量無菌水，接種后的植株繼續(xù)在室內(nèi)花盆中生長，定期觀察發(fā)病情況。病原菌rDNA-ITS序列分析：挑取足量病原菌菌絲體，在液氮冷卻狀態(tài)下磨成粉末，用真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，DNA提取液直接用于PCR擴增。用真菌rDNA-ITS區(qū)段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTG-ATATGC-3’)擴增病原菌基因組DNA。擴增程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；最后72℃延伸10min[7]。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，參照《真菌鑒定手冊》進行鑒定。

1.2.2植物材料接種方法及樣品采集 選取三年生的健康人參苗，用50%多菌靈溶液浸泡滅菌10min，再用蒸餾水沖洗3次。將人參苗移栽到裝有無菌石英砂的塑料盒中，每盒36株，在16h光照/8h黑暗，25℃室溫環(huán)境下培養(yǎng)，霍格蘭營養(yǎng)液[8]為人參苗提供營養(yǎng)。待人參苗葉片完全展開后，處理組接種濃度為3.9×107cfu·mL-1的病原菌孢子懸浮液250mL，對照組只接種等量霍格蘭營養(yǎng)液。分別從對照組和處理組采集0h，6h，12h，1d，4d，7d和12d的人參葉片和須根，每個處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3測定方法 人參葉片丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[9]：稱取葉片樣品1g，加入少量石英砂和10%三氯乙酸2mL，研磨至勻漿，再加8mL10%三氯乙酸進一步研磨，勻漿以4000×g離心10min。吸取上清液2mL，加入2mL0.6%硫代巴比妥酸溶液，混勻后在沸水浴中反應(yīng)15min，迅速冷卻后再離心。取上清液分別在波長532nm、600nm和450nm處比色，以空白試驗作參比測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算丙二醛含量。

人參葉片脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[10]：稱取葉片樣品0.5g，用3%磺基水楊酸溶液研磨提取，磺基水楊酸最終體積為5mL。勻漿轉(zhuǎn)入玻璃離心管中，在沸水浴中提取10min。冷卻后過濾，濾液即為脯氨酸提取液。吸取2mL提取液，加入2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，在沸水浴中顯色30min。冷卻后，加入4mL甲苯萃取紅色物質(zhì)。靜置后，吸取上層紅色液體于比色杯中，以甲苯為空白對照，用分光光度計在波長520nm處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算脯氨酸含量。

人參根系活力測定采用TTC法[11]：稱取根尖樣品0.5g，放入小燒杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10mL，把根充分浸沒在溶液內(nèi)，在37℃下暗保溫1～2h，之后立即加入1mol·L-1硫酸2mL，終止反應(yīng)。把根取出，吸干水分，放入研缽中，加乙酸乙酯3～4mL充分研磨。將研磨液移入試管，并用少量乙酸乙酯洗滌殘渣3次，最后加乙酸乙酯至總量為10mL，用分光光度計在波長485nm下比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求出TTC還原量，進而計算根系活力。

2 結(jié)果與分析

2.1病原菌鑒定

病原菌形態(tài)：觀察培養(yǎng)的病原菌菌落呈深褐色。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，病原菌孢子為圓柱形，兩端鈍圓，有隔膜，與人參銹腐菌形態(tài)一致[12]。

病原菌致病性：接種14d后觀察發(fā)現(xiàn)，人參苗根部出現(xiàn)病斑，癥狀與田間發(fā)病的人參相同。將發(fā)病部位病原菌進行分離，可得到與原接種菌一致的病原菌。

病原菌分子鑒定：病原菌基因組DNA經(jīng)ITS1和ITS4擴增后得到長度為518bp的擴增條帶，通過與已知序列比對發(fā)現(xiàn)，擴增得到的條帶與人參銹腐菌C.destructans(GenBank：EF607078)的ITS序列同源性為99%，綜合形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定及ITS分析結(jié)果，最終確定本研究所用病原菌為人參銹腐菌C.destructans。

圖1 病原菌菌絲及孢子形態(tài)特征

圖2 病原菌序列與人參銹腐菌C.destructans比對結(jié)果

2.2人參銹腐菌侵染后人參葉片丙二醛含量變化

由圖3可知，對照組人參葉片丙二醛含量變化不大，而處理組人參葉片丙二醛含量變化顯著。接種12h后，丙二醛含量稍有降低，接種4d后，丙二醛含量開始逐漸升高，并在接種12d后達到峰值。此時處理組人參葉片開始出現(xiàn)發(fā)黃，萎蔫等現(xiàn)象。

CK：對照組人參葉片丙二醛含量；XF：處理組人參葉片丙二醛含量**與0點對照相比在P<0.01水平存在極顯著差異，下同圖3 人參葉片丙二醛含量隨病菌接種時間的變化

2.3人參銹腐菌侵染后人參葉片脯氨酸含量變化

由圖4可知，對照組人參葉片脯氨酸含量無明顯變化。處理組人參葉片脯氨酸含量與丙二醛含量的變化趨勢類似，在接種12h后脯氨酸含量稍有降低，從接種4d后脯氨酸含量開始明顯上升，在接種后7d達到峰值，接種后12d時葉片脯氨酸含量與7d時相當(dāng)。

CK：對照組人參葉片脯氨酸含量；XF：處理組人參葉片脯氨酸含量圖4 人參葉片脯氨酸含量隨病菌接種時間的變化

2.4人參銹腐菌侵染后人參根系活力變化

由圖5可知，不同于丙二醛和脯氨酸，對照組與處理組人參根系活力均有明顯變化。對照組人參根系活力在12h時降低，從1d時開始升高至4d時達到峰值，之后略有下降。處理組在接種6h后根系活力明顯升高，接種12h后急劇下降，接種1d后升高達到峰值，至接種12d緩慢降低。

CK：對照組人參苗不同時期根系活力；XF：處理組參苗不同時期根系活力；*：與0點對照相比在P<0.05水平存在顯著差異圖5 人參苗根系活力隨病菌接種時間的變化

3 討論

丙二醛是植物體內(nèi)膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，對植物有一定危害。丙二醛含量變化能反映植物受脅迫的程度[13]。本研究中處理組人參苗在接種12h后丙二醛含量略有降低，說明此時人參根細胞感受到病菌侵染，且已啟動防御反應(yīng)。隨著接種時間延長，人參體內(nèi)代謝平衡被破壞，活性氧累積導(dǎo)致人參內(nèi)膜系統(tǒng)損傷。因此，接種4d后丙二醛含量開始上升，至12d達到最大值，人參葉片外觀出現(xiàn)明顯發(fā)黃萎蔫現(xiàn)象，已無法進行正常的代謝活動。

脯氨酸是植物內(nèi)一種調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量變化能一定程度上反映植物對逆境的適應(yīng)性[14]。另外，脯氨酸在植物體內(nèi)有束水能力，對維持酶活性及細胞膜透性、穩(wěn)定蛋白質(zhì)特性有重要作用[15]。本實驗結(jié)果表明，處理組人參苗葉片脯氨酸含量在接種7d后達到最大值，表明人參苗已感受到環(huán)境的嚴(yán)重脅迫，因此大量合成脯氨酸來調(diào)節(jié)自身代謝以抵抗病原菌侵染[16-17]。接種7～12d后人參葉片脯氨酸含量基本未發(fā)生變化，說明脯氨酸僅能在一定范圍內(nèi)起調(diào)節(jié)作用，這與張景云等[18]的研究結(jié)論一致。

根系作為植物與外界環(huán)境直接接觸的器官，在植物響應(yīng)環(huán)境脅迫中至關(guān)重要。保持較高根系活力是植物響應(yīng)逆境脅迫的體現(xiàn)[19]。本研究中不論對照組還是處理組，人參根系活力變化都相對復(fù)雜，主要因為根系最早感應(yīng)逆境，并做出有利自身的防御反應(yīng)[20-21]。處理組在接種早期(6～24h)根系活力顯著提高，并在接種4d后根系活力達到最大值，說明人參在接種早期就能夠感受到病原菌侵染，并迅速做出防御反應(yīng)。接種12h后對照組和處理組根系活力均急劇降低，推測可能是接種時對照組與處理組分別澆灌250mL霍格蘭營養(yǎng)液和銹腐菌孢子懸浮液，對人參苗根系形成了輕微的淹水脅迫。連洪燕等[22]通過實驗證實植物根系活力隨著淹水脅迫時間延長而下降，因此兩組參苗的根系活力有所降低。處理組在接種4d后根系活力逐漸減弱，推測可能是逆境造成葉片損傷，向根部輸送的光合產(chǎn)物減少，導(dǎo)致根部生理功能減弱[23]。結(jié)合丙二醛、脯氨酸含量變化以及外觀形態(tài)的變化情況，我們發(fā)現(xiàn)銹腐菌侵染人參后，人參根系活力變化要遲于葉片生理指標(biāo)變化，表明生理指標(biāo)變化存在差異可能與植物抵抗病原菌侵染機制密切相關(guān)。

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InfluenceofCylindrocarpondestructansInfectiononPhysiologicalCharactersofPanaxginseng

GAOYuan，DINGWanlong，LONGQiliang，LIYong*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China)

Cylindrocarpondestructansis a destructive pathogen that causing severely rust rot ofPanaxginseng.In northeast region of China，C.destructanscause significantly yield decline approximately35% annually.In the present work，leaves and fibrous roots ofP.ginsengthat infected byC.destructans0，0.25，0.5，1，4，7and12days after inoculation were sampled，and changes on the content of malondialdehyde，proline，and root activity of them were examined.Results showed that the content variation of malondialdehyde and proline in leaves ofP.ginsengwere improved along with the inoculating time，while there has no obvious correlation between variation of root activity andC.destructansinfection.

Cylindrocarpondestructans；malondialdehyde；proline；root activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.011

2015-12-12)

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201407005)；協(xié)和青年基金項目(3332013113)

*

李勇，副研究員，研究方向：藥用植物病害生物防治關(guān)鍵技術(shù)研究；Tel：(010)57833360，E-mail:liyong@implad.ac.cn