人參總蛋白的酶解及氨基酸含量測定△

李紅艷，張江華，張惠，陶震宇，楊靜嫻，康廷國*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600；2.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；3.長春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林 長春 130117)

人參總蛋白的酶解及氨基酸含量測定△

李紅艷1，張江華2，張惠3，陶震宇1，楊靜嫻1，康廷國1*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連116600；2.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連116034；3.長春中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，吉林 長春130117)

目的：比較人參蛋白酶解前后成分的變化，以探討人參蛋白在體內(nèi)發(fā)揮作用的最終活性物質(zhì)。方法：采用胃蛋白、胰蛋白酶及雙酶(胃蛋白酶與胰蛋白酶聯(lián)合)水解人參蛋白，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測蛋白及多肽含量，采用高效液相色譜(HPLC)分析氨基酸組成。結(jié)果：SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后，僅出現(xiàn)分子量5000左右的高濃度、低分子量蛋白條帶；經(jīng)胰蛋白酶水解后，出現(xiàn)多條蛋白帶，但濃度較水解前低；經(jīng)雙酶水解后，蛋白條帶顯示與胃蛋白酶接近。HPLC檢測結(jié)果顯示，人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶水解后，氨基酸種類變化不大，含量明顯減少。結(jié)論：人參蛋白酶解后轉(zhuǎn)變?yōu)槎嚯募吧倭堪被帷?/p>

人參蛋白；胃蛋白酶；胰蛋白酶；氨基酸

人參蛋白是人參主要藥效物質(zhì)之一，目前已被證明具有抗氧化[1-2]、增強(qiáng)免疫[3]、神經(jīng)保護(hù)[4]等藥理活性。這些活性為人參蛋白的抗衰老研究提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)，然而，蛋白質(zhì)為大分子物質(zhì)，目前研究認(rèn)為其只有在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樾‰幕虬被岵拍鼙晃?，因此，盡管作者前期及目前的研究均表明人參蛋白具有一定的體內(nèi)外藥理活性，但關(guān)于人參蛋白在體內(nèi)發(fā)揮藥效的最終物質(zhì)尚有待深入研究。本論文采用體外酶解法，應(yīng)用胃蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶聯(lián)合水解人參蛋白，并測定水解度，同時對水解前后樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測、自由基清除率測定及氨基酸含量分析，比較水解前后樣品中蛋白、氨基酸差異及抗氧化活性差異，為人參蛋白的體內(nèi)藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1材料

人參蛋白，長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心生物工程實驗室提供(純度：70%)；丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)R250、溴酚藍(lán)(德國sigma公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、β-巰基乙醇(美國Genview公司)；TEMED(美國Amresco公司)；胰島素(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.2儀器

Elite-AAK氨基酸分析系統(tǒng)(大連依利特分析儀器有限公司)；Tanon4100型凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；165-8001型小型垂直電泳槽，Powerpac型電泳儀(美國伯樂公司)；AR2140電子分析天平(METTLE公司)；PHS-3E臺式精密算度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1胃蛋白酶酶解

依據(jù)文獻(xiàn)[5-6]，采用單因素試驗考察不同pH(pH1.0、pH1.4、pH1.6、pH1.9)、不同水解時間(1、2、3、4、5h)、不同酶與底物比(1000、2000、3000、4000、5000U·g-1)和不同底物濃度(2%、4%、6%、8%、10%)下人參蛋白的水解度(甲醛滴定法)及自由基清除率(SOD活性，鄰苯三酚自氧化法[7])，優(yōu)選最佳酶解條件。

2.2胰蛋白酶酶解

依據(jù)文獻(xiàn)[8-9]，采用單因素試驗考察不同pH(pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH8.5、pH9.0)、不同水解時間(1、2、3、4、5、6h)、不同酶與底物比(1000、2000、3000、4000、5000U·g-1)和不同底物濃度(2%、4%、6%、8%、10%)下人參蛋白的水解度及自由基清除率[7]，優(yōu)選最佳酶解條件。

2.3雙酶水解

按照優(yōu)選出的酶解條件，于胃蛋白酶水解后，再加入胰蛋白酶進(jìn)行水解。具體做法為：稱取人參蛋白粉1.500g，溶于15mL蒸餾水中，攪拌至充分溶解后，用1mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH至1.6，然后放入恒溫水浴鍋，于37℃溫浴5min，迅速加入適量胃蛋白酶(酶與底物比為3000U·g-1)，振蕩水解3h。水解結(jié)束后，立即100℃滅活10min，待冷卻至室溫后，用1mol·L-1氫氧化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，加入適量胰蛋白酶(酶與底物比為1000U·g-1)，于55℃水解5h，反應(yīng)過程中以0.1mol·L-1NaOH溶液維持溶液pH恒定，酶解液100℃水浴滅活15min，3500r·min-1低溫離心15min后，取上清液，置-20℃冰箱保存，即得雙酶水解液。

2.4SDS-PAGE

上述人參蛋白(0.1 g·mL-1)及其酶解液采用SDS-PAGE進(jìn)行分子量檢測，每個樣品上樣15 μL。采用分離膠濃度為15%、電壓為120 mV；濃縮膠濃度為5%、電壓為90 mV。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R250染色，最后用脫色液甲醇-水-冰乙酸(4.5∶4.5∶1)脫色至背景清晰[10]。

2.5氨基酸檢測

精密稱定人參蛋白凍干粉0.25g，加3mL6mol·L-1鹽酸，110℃水解24h，水解后樣品于80℃水浴蒸干，用衍生緩沖液洗滌蒸發(fā)皿，并轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，備用。另取人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶水解后的上清液各5mL(均相當(dāng)于人參蛋白0.5g水解液)，用少量乙腈反復(fù)多次沉淀以除去未水解的蛋白質(zhì)，分別記作胃蛋白酶水解液、胰蛋白酶水解液和雙酶水解液(避光操作，終體積各8mL)，分別加衍生緩沖液定容至25mL容量瓶。精密量取氨基酸對照品溶液和樣品溶液各5mL，置25mL棕色容量瓶中，加入衍生化試劑5mL，混合，于60℃水浴中避光反應(yīng)1h，反應(yīng)完畢，取出冷卻至室溫，加入平衡緩沖溶液稀釋到刻度，混勻，HPLC進(jìn)樣前用0.45μm濾膜過濾。試劑配制及流動相梯度設(shè)定參照文獻(xiàn)[11]。

3 結(jié)果

3.1胃蛋白酶解條件優(yōu)選

采用不同條件胃蛋白酶水解人參蛋白，并測定水解度和自由基清除率，結(jié)果見圖1a、1b、1c、1d。

圖1 胃蛋白酶不同水解條件下人參蛋白的水解度和自由基清除率測定

圖1結(jié)果表明，人參蛋白在不同pH條件下，經(jīng)胃蛋白酶水解后，水解度與自由基清除率不同。其中，pH1.6時水解度最大，pH1.0時自由基清除率最高，綜合考慮，選擇pH1.6為最適pH(見圖1a)。在pH1.6條件下，分別采用胃蛋白酶水解不同時間，結(jié)果表明，水解3h時，水解度和自由基清除率均最大，因此選擇水解3h為最佳水解時間(見圖1b)。采用不同濃度(酶與底物比)胃蛋白酶，分別于pH1.6條件下水解人參蛋白(底物)3h，結(jié)果表明，胃蛋白酶濃度為2000U·g-1時水解度最大，3000U·g-1時自由基清除率最大，綜合實驗結(jié)果，選擇酶與底物比3000U·g-1(3000∶1)為最佳比例(見圖1c)。采用不同底物即GP濃度，于pH1.6，酶濃度3000U·g-1條件下，水解3h，結(jié)果表明，底物濃度為10%，即GP0.1g·mL-1時，水解度最大；底物濃度為8%時自由基清除率最大。由于10%底物濃度與8%底物濃度比，前者水解度明顯高于后者，而自由基清除率差別不大，故選擇10%為最佳底物濃度(見圖1d)。綜上，胃蛋白酶水解最佳條件為：pH1.6，酶濃度3000U·g-1，底物濃度10%，水解時間3h。

3.2胰蛋白酶水解條件優(yōu)選

采用不同條件胰蛋白酶水解人參蛋白，并測定水解度和自由基清除率，結(jié)果見圖2a、2b、2c、2d。

圖2 胰蛋白酶不同水解條件下人參蛋白的水解度和自由基清除率測定

圖2結(jié)果表明，人參蛋白在不同pH條件下，經(jīng)胰蛋白酶水解后，水解度與自由基清除率不同。其中，pH8.5時水解度及自由基清除率均最高，因此選擇pH8.5為最適pH(見圖2a)。在pH8.5條件下，分別采用胰蛋白酶水解不同時間，結(jié)果表明水解5h時，水解度和自由基清除率均最大，因此選擇水解5h為最佳水解時間(見圖2b)。采用不同濃度胰蛋白酶，分別于pH8.5條件下水解人參蛋白5h，結(jié)果表明，酶濃度1000U·g-1時水解度最大，5000U·g-1時自由基清除率最大，但由于酶與底物比5000U·g-1與1000U·g-1時自由基清除率差別不大，考慮到酶的成本，選擇1000U·g-1(1000∶1)為最佳比例(見圖2c)。進(jìn)一步采用不同底物即GP濃度，于pH8.5、酶濃度1000U·g-1條件下，水解5h，結(jié)果表明，底物濃度為10%時，水解度和自由基清除率均最大，故選擇10%為最佳底物濃度(見圖2d)。綜上，胰蛋白酶水解最佳條件為：pH8.5，酶濃度1000U·g-1，底物濃度10%，水解時間8h。

3.3雙酶水解液制備

按上述優(yōu)選酶解條件，進(jìn)行胃蛋白酶-胰蛋白酶聯(lián)合水解，得雙酶水解液。

3.4SDS-PAGE

將實驗用人參蛋白及各酶水解液分別進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖3。

注：1.Marker；2.人參蛋白；3.胰島素；4.胃蛋白水解液；5.胰蛋白酶水解液；6.雙酶水解液。圖3 各樣品SDS-PAGE圖

由圖3可見，人參蛋白經(jīng)胃蛋白與雙酶水解后，蛋白條帶主要為小分子蛋白，分子量與胰島素相當(dāng)，約5000左右；經(jīng)胰蛋白酶水解后，條帶比較多但濃度都很低，無明顯小分子蛋白生成。

3.5氨基酸檢測

人參蛋白及其胃蛋白酶、胰蛋白酶和雙酶水解液分別進(jìn)行HPLC氨基酸含量分析，結(jié)果見圖4。

注：AA.18種基本氨基酸對照品分離譜圖；GP.人參蛋白；Pepsin.人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后；Trypsin.人參蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后；Two enzymes.人參蛋白經(jīng)雙酶水解后；1.天冬氨酸；2.谷氨酸；3.絲氨酸；4.2,4-二硝基苯酚；5.精氨酸；6.甘氨酸；7.蘇氨酸；8.脯氨酸；9.丙氨酸；10.纈氨酸；11.蛋氨酸；12.半胱氨酸；13.異亮氨酸；14.亮氨酸；15.色氨酸；16.苯丙氨酸；17.組氨酸；18.2，4-二硝基氟苯；19.賴氨酸；20.酪氨酸。圖4 樣品中氨基酸HPLC圖

由圖4可見，與氨基酸對照品(曲線AA)比較可知，人參蛋白(曲線GP)含有17種以上氨基酸，僅15號峰色氨酸未檢測到；人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶水解后(曲線Pepsin)，各氨基酸基本都能檢測到，但含量均比較低，以1、6、8、19號峰，即天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸和賴氨酸含量較高；人參蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后(曲線Trypsin)，各氨基酸也基本都能檢測到，其中1、2、6、7、8、14、19、20號峰即天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、亮氨酸、賴氨酸和酪氨酸含量相對較高；人參蛋白經(jīng)雙酶水解后(曲線Twoenzymes)氨基酸組成與胃蛋白酶和胰蛋白酶相似，除1、2、6、8、14號峰含量相對較高外，9號峰和17號峰即丙氨酸和組氨酸含量也比較高。

4 討論

本實驗采用單因素試驗優(yōu)選確定人參蛋白(GP)酶解方法，通過甲醛滴定法測定水解度，結(jié)果表明，胃蛋白、胰蛋白酶及雙酶水解液水解度均在10%左右。SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，GP經(jīng)胃蛋白酶和雙酶水解后，均生成低分子量蛋白，分子量5000左右，與胰島素相近，但雙酶水解液明顯較胃蛋白酶水解液蛋白濃度低，提示胰蛋白酶的加入使部分低分子量蛋白進(jìn)一步水解成了氨基酸；GP經(jīng)胰蛋白酶水解后有大量蛋白條帶生成，但濃度均比較低，可能是該條件下蛋白發(fā)生了一定的降解，同時與其水解不徹底有關(guān)。HPLC氨基酸檢測結(jié)果表明，人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶水解后，雖然所含的17種氨基酸基本都能檢測到，但濃度均非常低，僅天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、賴氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸和組氨酸濃度稍高，但也遠(yuǎn)不及人參蛋白徹底酸水解所得氨基酸含量高。

綜合比較人參蛋白與各酶解液的SDS-PAGE及氨基酸分離譜圖，可推測人參蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶及雙酶聯(lián)合水解后，大部分轉(zhuǎn)化成了低分子蛋白或多肽，少部分進(jìn)一步水解成了氨基酸。由于食物中的蛋白質(zhì)主要經(jīng)胃液中的胃蛋白酶(在胃酸參與下)進(jìn)行初步分解，再進(jìn)入小腸經(jīng)胰液、膽汁、小腸液和腸機(jī)械性消化而被吸收。所以，本實驗研究結(jié)果提示，人參蛋白在體內(nèi)可能以多肽和(或)氨基酸的形式被吸收。

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EnzymolysisofGinsengTotalProteinsandDeterminationofAminoAcidContent

LIHongyan1，ZHANGJianghua2，ZHANGHui3，TAOZhenyu1，YANGJingxian1，KANGTingguo1*

(1.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China；2.DalianPolytechnicUniversity，Dalian116034，China；3.AffiliatedHospitalofChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130021，China)

Objective：The final active substances of ginseng proteins functioning in vivo were explored by comparing the component changes in ginseng proteins before and after enzymolysis.Methods：The ginseng proteins were hydrolyzed by pepsin，trypsin and double enzymes (pepsin and trypsin)，the protein and peptide content was detected by SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)，and the amino acid composition was analyzed by HPLC.Results：The results of SDS-PAGE showed that ginseng proteins were hydrolyzed into high concentration and low molecular weight (around5000) proteins by pepsin，lower concentration proteins by trypsin，and proteins by double enzymes similar to those of pepsin hydrolysis.The results of HPLC showed that the amino acids in ginseng proteins decreased significantly after pepsin，trypsin and double enzymes hydrolysis.Conclusion：Ginseng proteins were converted into low molecular weight proteins and a small amount of amino acids after enzymolysis.

Ginseng protein，pepsin，trypsin，amino acid

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.1.008

2015-05-07)

中國博士后科學(xué)基金項目(2013M530945)

*

康廷國，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥鑒定學(xué)；E-mail:kangtg@126.com