張宇霞，馬世震，馮海生，李彩霞，鄭植元，劉永玲

(1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所/藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810001；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

栽培甘松藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

張宇霞1，2，馬世震1*，馮海生1，李彩霞1，鄭植元1，2，劉永玲1

(1.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所/藏藥研究重點實驗室，青海 西寧 810001；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

目的：制定栽培甘松藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：按中國藥典規(guī)定的方法對栽培甘松進(jìn)行粉末顯微觀察及薄層(TLC)鑒別，對其揮發(fā)油、水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、有害元素、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留進(jìn)行測定；采用高效液相色譜法(HPLC)測定甘松新酮的含量。結(jié)果：栽培甘松的顯微鑒別及TLC結(jié)果與中國藥典甘松一致；確定了水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬、有害元素、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留、揮發(fā)油、甘松新酮的限度。結(jié)論：所測指標(biāo)可以為完善甘松的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

甘松；高效液相色譜法；甘松新酮；揮發(fā)油；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

甘松為敗醬科植物甘松NardostachyschinensisBatal.或匙葉甘松N.jatamansiDC.的干燥根及根莖，藥用歷史悠久，具有理氣止痛，開郁醒脾的功能，可治胃痛、胸腹脹滿、頭痛、癔病、腳氣等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，甘松具有抗抑郁、抗心律失常、促進(jìn)PC12D細(xì)胞中神經(jīng)因子誘導(dǎo)的神經(jīng)突生長[2-4]等藥理作用。

甘松被《中華人民共和國藥典》自第二版起開始收載至今，且藏藥標(biāo)準(zhǔn)也有其收載。成都中醫(yī)藥大學(xué)及北京中醫(yī)藥大學(xué)對甘松的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究[5-6]，《中華人民共和國藥典》2010版甘松規(guī)定項目僅包括顯微鑒別、性狀、TLC、水分及揮發(fā)油含量限定[7]，本研究擬在前人研究工作的基礎(chǔ)上，以野生甘松和市售甘松為對照藥材，對甘松質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，從而增加甘松標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定項目，制定人工規(guī)范化栽培的甘松藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，增加其質(zhì)量可控性。同時本方法尚可為其他藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究方法提供借鑒，對規(guī)范性評價藥材質(zhì)量有重大的意義。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

美國Waters 515型高效液相色譜儀，包括溶劑管理系統(tǒng)，二極管陣列檢測器，Emprower色譜工作站(美國Waters公司)；MARS 6微波消解儀(美國CEM公司)；AA240Z石墨爐原子吸收光譜儀(美國Aligent公司)；725型ICP-AES(美國Aligent公司)；AFS-8230原子熒光光度計(北京吉天儀器有限公司)；揮發(fā)油提取器(上海玻璃儀器廠)；7890B GC氣相色譜儀(美國Agilent公司)；ESJ182-4型電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)。

HPLC色譜柱：Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Phenomenex Synergi 4μHydro-R P80A(250 mm×4.6 mm，4 μm)，HPLC-PCartridge LIChrosp-1her 100 RP-180(5 μm)試劑：甲醇(色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司)，超純水為實驗室自制，其它試劑均為分析純(天津市百世化工有限公司)。

對照品：甘松新酮(成都曼斯特生物科技有限公司，批次MUST-13090901)。

1.2 材料

第1～10批為栽培甘松，地點為青海省大通寶庫藥材種植基地，海拔為2890 m，引種種源為青海省玉樹藏族自治州巴塘鄉(xiāng)野生種源，栽培種源為第二代自繁種源，采集時間依次為2013-07-01、2013-07-31、2013-08-28、2013-09-18、2013-10-30、2014-05-17、2014-06-15、2014-07-16、2014-08-15、2014-09-13；第11批為野生甘松，2013年9月采于青海省玉樹藏族自治州巴塘鄉(xiāng)，海拔為3800m；第12批為市售甘松，2013年9月購自西寧市八一路藥材市場。以上樣品均經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰教授鑒定為甘松(NardostachyschinensisBatal.)的根莖。采回的甘松經(jīng)除去泥沙等雜質(zhì)后，室溫下陰干，經(jīng)植物粉碎機(jī)粉碎，過標(biāo)準(zhǔn)藥篩，待用。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

顯微觀察結(jié)果與《中華人民共和國藥典》描述基本一致(圖1)。

注：A.石細(xì)胞(10×40)；B.導(dǎo)管1(10×40)；C.導(dǎo)管2(10×40)；D.木栓細(xì)胞(10×40)；E.基生葉殘基碎片1(10×40)；F.基生葉殘基碎片2(10×40)圖1 栽培甘松顯微結(jié)構(gòu)圖

顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明：甘松石細(xì)胞類圓形或不規(guī)則多角形，偶見長方形，單個或成群，直徑33～64 μm，長可至200 μm或更長，壁甚厚，無色，胞腔狹小。梯紋導(dǎo)管或網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑7～40 μm，小型梯紋導(dǎo)管成束，其旁有時可見細(xì)長的木纖維。木栓細(xì)胞多為不規(guī)則多角形，略暗棕色，較薄，內(nèi)含黃色至棕黃色揮發(fā)油。基生葉殘基碎片較多，細(xì)胞呈長方形或長多角形，深黃色至棕色，直徑20～31 μm，長50～90 μm，壁呈念珠狀增厚。另一種碎片細(xì)胞呈長條形，長可達(dá)200 μm，壁有時呈念珠狀增厚。

2.2 薄層鑒別

參考《中華人民共和國藥典》2010版方法，以野生甘松藥材作為對照藥材，對栽培甘松進(jìn)行薄層鑒別(圖2及圖3)。從圖2及圖3中可看出，在與野生藥材及對照品一致的位置上，10批栽培藥材均出現(xiàn)相同顏色的斑點。

注：1～5及8～12為10批栽培甘松；6為野生甘松；7為甘松新酮對照品(下同)。圖2 甘松254nm紫外燈下TLC圖

圖3 甘松0.5%香草醛硫酸溶液顯色TLC圖

2.3 檢查

水分按照《中華人民共和國藥典》甲苯法測定；浸出物按照《中華人民共和國藥典》稀乙醇、熱浸法測定[8]；總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留均按照《中華人民共和國藥典》測定。結(jié)果見表1～3、圖4。

由表1及表2數(shù)據(jù)得出，建議甘松中水分不得超過5.0%；浸出物不得少于27.0%；總灰分不得超過13.0%；酸不溶性灰分不得超過7.0%；鉛不得過百萬分之五，鎘不得過千萬分之三，砷不得過百萬分之二，汞不得過千萬分之二，銅不得過百萬分之二十；由圖4知，9種有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留均未檢出，所以計算其檢出限，結(jié)果見表3。

表1 甘松水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分測定 (%)

表2 甘松重金屬及有害元素測定 /mg·kg-1

2.4 含量測定

2.4.1 揮發(fā)油測定 稱取甘松樣品粉末約10g，按照《中華人民共和國藥典》2010版第一部附錄Ⅹ D甲法測定揮發(fā)油含量，結(jié)果見表4?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定甘松揮發(fā)油不得少于2.0%(mL·g-1)，本實驗結(jié)果均符合該規(guī)定，且栽培甘松與野生、市售甘松含量差異不大。但除第6批樣品外，揮發(fā)油含量均大于3.0%(mL·g-1)，所以建議甘松藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中揮發(fā)油含量不得少于3.0%(mL·g-1)。

表3 有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留檢出限

注：A.混合對照品；B.栽培甘松樣品圖4 有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留GC圖

2.4.2 甘松新酮測定 色譜條件：采用HPLC法，色譜柱為Dikma Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(65∶35)，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為254 nm。對照品和供試品色譜圖見圖5。

注：A.甘松新酮對照品；B.栽培甘松供試品圖5 對照品和供試品色譜圖

對照品溶液制備：取甘松新酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含1.45 mg的溶液，即得。置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

供試品溶液制備：取本品粉末(過四號篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(100W，40kHz)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，得供試品溶液。

所建立的方法已進(jìn)行方法學(xué)考察，包括線性關(guān)系、精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率，均符合方法學(xué)驗證要求[9]。樣品測定結(jié)果見表4。表中數(shù)據(jù)顯示，除第3、4批藥材的甘松新酮低于10.0 mg·g-1，其他批次均高于10.0 mg·g-1，所以建議甘松藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中甘松新酮含量不得少于10.0 mg·g-1。

表4 甘松揮發(fā)油及甘松新酮含量測定結(jié)果(n=3)

3 小結(jié)和討論

本文通過以野生及市售藥材作對照，對10批栽培甘松藥材質(zhì)量進(jìn)行分析，初步制定了甘松浸出物、總灰分、酸不溶性灰分、重金屬及有害元素、有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留及甘松新酮的含量限度，同時提高了對甘松藥材揮發(fā)油及水分的含量限度要求，可以為中國藥典甘松質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供借鑒。建議甘松藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：水分不得超過5.0%；浸出物不得少于27.0%；總灰分不得超過13.0%；酸不溶性灰分不得超過7.0%；鉛不得過百萬分之五，鎘不得過千萬分之三，砷不得過百萬分之二，汞不得過千萬分之二，銅不得過百萬分之二十；有機(jī)氯類農(nóng)藥殘留由于未檢出所以暫不作規(guī)定；揮發(fā)油含量不得少于3.0% mL·g-1；甘松新酮含量不得少于10.0 mg·g-1。

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StudyonQualityStandardsofCultivatedNardostachyschinensisBatal.

ZHANGYuxia1，2，MAShizhen1*，F(xiàn)ENGHaisheng1，LICaixia1，ZHENGZhiyuan1，2，LIUYongling1

(1.NorthwestInstituteofPlateauBiology，ChineseAcademyofSciences/KeyLaboratoryofTibetanMedicineResearch，Xining810001，China；2.UniversityofChineseAcademyofSciences，Beijing100049，China)

Objective：To establish the quality standards for cultivatedNardostachyschinensisBatal.Methods：According to the standards of Chinese Pharmacopoeia，the cultivatedN.chinensiswas identified by powder microscopic observation and TLC,essential oil，water content，extract，total ash，acid-insoluble ash，heavy metals，harmful elements and organochlorine pesticides residue were measured,nardosinone was determined by HPLC.Results：Powder microscopic observation and TLC were consistent to the description of Chinese Pharmacopoeia.The limits of water content，extract，the total ash，acid-insoluble ash，heavy metals，harmful elements，organochlorine pesticides residue，essential oil and nardosinone were set up.Conclusion：The determined indicators can provide scientific basis for improvingN.Chinensis.quality standards.

NardostachyschinensisBatal.；HPLC；nardosinone；essential oil；quality standards

2015-07-10)

中國科學(xué)院藏藥研究重點實驗室項目(No.Y34291OZ1)

*

馬世震，研究員，研究方向：藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究及產(chǎn)品開發(fā)；E-mail：szma@nwipb.cas.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.018