廣西莪術(shù)葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究△

蔣妮，劉麗輝，胡鳳云，劉威，劉凡

(廣西藥用植物園,廣西 南寧 530023)

廣西莪術(shù)葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性研究△

蔣妮*，劉麗輝，胡鳳云，劉威，劉凡

(廣西藥用植物園,廣西 南寧 530023)

目的：明確廣西莪術(shù)葉斑病病原菌種類，掌握其生物學(xué)特性。方法：依據(jù)柯赫氏法則進行致病性測定和病原菌驗證，通過形態(tài)學(xué)特征觀察、rDNA-ITS序列分析來確定病原菌；設(shè)置不同的培養(yǎng)基、溫度、PH值、濕度，觀測菌絲生長及孢子萌發(fā)，進行生物學(xué)特性研究。結(jié)果：病原菌為大豆擬莖點種腐病菌(Phomopsis longicolla)；菌株在PDA培養(yǎng)基生長良好，加了莪術(shù)汁的PDA培養(yǎng)基更利于生長及產(chǎn)孢，溫度20～30 ℃、PH值5～6條件下適宜菌絲生長及孢子萌發(fā)，RH為80%時孢子萌發(fā)率最高。結(jié)論：廣西莪術(shù)葉斑病病原菌鑒定為Phomopsislongicolla；中溫、潮濕、偏弱酸性環(huán)境條件適宜該菌生長。

廣西莪術(shù)；病害；病原鑒定；生物學(xué)特性

廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS.G.Leset C.F.Liang，為姜科姜黃屬多年生草本植物，是中藥莪術(shù)的三大基源植物之一，又稱桂莪術(shù)、毛莪術(shù)。以根莖作為中藥莪術(shù)使用，具有破瘀行氣、消積止痛之功效；塊根作為中藥郁金(習(xí)稱“桂郁金”)使用，有行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃的功能；近期文獻報道莪術(shù)油還具有抗腫瘤、抗病毒等作用[1-2]。廣西作為廣西莪術(shù)的道地藥材產(chǎn)區(qū)，傳統(tǒng)種植于欽州靈山縣、貴港市等地，南寧市隆安縣也有栽培，全區(qū)種植面積上萬畝。近年來隨著藥材及其他作物種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，以及周邊環(huán)境的不斷變化，廣西莪術(shù)葉斑病發(fā)生嚴(yán)重。病害發(fā)生早期多從葉尖或葉緣處出現(xiàn)黃褐色斑點，隨著病原菌的不斷侵染，病斑逐漸向葉中脈擴展，引起葉片大面積枯黃，后期植株早衰死亡，嚴(yán)重影響廣西莪術(shù)的栽培生產(chǎn)。國內(nèi)外關(guān)于廣西莪術(shù)病害的研究尚未見報道，葉斑病為廣西莪術(shù)病害的首次報道。因此，明確廣西莪術(shù)葉斑病病原菌種類及其生物學(xué)特性，能夠?qū)υ摬『Φ念A(yù)防與控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 采樣與分離

2013年6月，在廣西隆安縣城廂鎮(zhèn)小林村廣西莪術(shù)種植基地，采集具有典型癥狀的莪術(shù)病葉及健康葉片，用清水洗凈病葉表面，進行病原菌的分離及純化[3]：在病健交界處剪取20塊長寬4～5 mm的病葉組織，用75%的酒精消毒2～3 s，0.1%升汞消毒2 min，無菌水沖洗3遍，置于滅菌濾紙上，吸干水后將病葉組織分別接到裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，共20 皿，在26 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，4天后挑取組織塊周圍的菌絲轉(zhuǎn)皿培養(yǎng)、純化，對分離物歸類、編號、轉(zhuǎn)管保存。

1.2 致病性測定

采取針刺方式進行。將純化的菌株接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，在28℃、RH為65%霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)擴繁培養(yǎng)5 d，用打孔器制成直徑為9 mm的菌片備用。用無菌接種針在健康的廣西莪術(shù)葉片上刺成面積約為1 cm2的傷口，用接種鏟將菌片接至傷口，保濕培養(yǎng)3～4 d，觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，對發(fā)病葉片進行再分離，顯微鏡下觀察分離病菌與原接種菌株是否相同[3]。以接種PDA培養(yǎng)基作為對照，在室溫(20 ℃～25 ℃)下保濕培養(yǎng)5天，記錄發(fā)病情況。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離純化后的病原菌在PDA上培養(yǎng)5 d，在菌落邊緣取菌絲塊接種于無菌廣西莪術(shù)葉片，在25 ℃、12 h/12 h光照/黑暗交替條件下培養(yǎng)，20 d后，在光學(xué)顯微鏡下進行病原菌形態(tài)學(xué)觀察和測量，包括子座大小、分生孢子器形態(tài)及排列、分生孢子形態(tài)及大小等。

1.4 核糖體rDNA-ITS序列分析

采用SDS法提取病原菌株的基因組DNA[4]。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)和ITS5(5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′)(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，擴增該菌的rDNA-ITS序列。擴增產(chǎn)物的純化和序列測定委托北京諾賽生物科技有限公司進行，所得到的核苷酸序列與GenBank中相關(guān)菌株進行同源性比較[5]。

1.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

選用5種培養(yǎng)基(編號1號～5號)觀察菌絲生長情況：1號PDA培養(yǎng)基(1000 mL清水+200 g馬鈴薯+20 g蔗糖+20 g瓊脂)、2號PDA莪術(shù)汁培養(yǎng)基(1000 m1清水+200 g馬鈴薯+10 g莪術(shù)汁+20 g蔗糖+20 g瓊脂、)、3號燕麥培養(yǎng)基(清水l000 mL+30 g燕麥+25 g瓊脂)、4號燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基(1000 mL清水+200 g馬鈴薯+30 g燕麥+20 g瓊脂+20 g蔗糖)、5號玉米培養(yǎng)基(清水1000 mL+50 g玉米粉+10 g瓊脂)，清水瓊脂培養(yǎng)基做對照。在病原菌菌落邊緣取直徑5 mm的菌餅移植到上述培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h、96 h、120 h時分別采用十字交叉法測量菌落直徑，并計算平均值。每個處理重復(fù)3次。

1.6 不同溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

將直徑為5 mm的病原菌菌餅移植到PDA莪術(shù)汁培養(yǎng)基平板上，在5、10、15、20、25、30、35 ℃ 7個不同溫度條件下培養(yǎng)，120 h后測量菌落直徑，每個處理重復(fù)3次。以pH為6的1%莪術(shù)葉片汁配制孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)，滴于凹玻片上，分別放置于10、15、20、25、30、35、40 ℃下進行培養(yǎng)，48h后觀察其萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次。

1.7 PH值對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

用滅菌的NaOH和HCl分別調(diào)節(jié)莪術(shù)汁PDA培養(yǎng)基pH值至2、3、4、5、6、7、8、9，并制成平板，接入5 mm的病原菌菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，接種后120h測量菌落直徑，每處理重復(fù)3次。配置1%莪術(shù)葉片汁孢子液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)，以滅菌的NaOH和HCl調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)基pH值為l、2、3、4、5、6，7、8、9、10、1l的梯度。將孢子液滴于凹玻片上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后觀察其萌發(fā)率。每處理重復(fù)3次。

1.8 濕度對孢子萌發(fā)的影響

在干燥器內(nèi)用不同濃度的硫酸將干燥器分別調(diào)制成相對濕度為90、80、70、60、50、20、10%的梯度濕度，將1%莪術(shù)葉片汁孢子懸浮液(15×40倍視野鏡下20～25個孢子)滴于凹玻片上，分別放置于上述各相對濕度的干燥器中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后觀察孢子萌發(fā)率，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果和分析

2.1 病害癥狀

發(fā)病植株的癥狀主要表現(xiàn)在葉片，病原菌主要侵染植株的中上部葉片，一般先侵染嫩葉。病害發(fā)生早期多從葉尖或葉緣處開始出現(xiàn)淡黃色的水漬狀斑點，病健交界明顯，隨著病原菌的不斷侵染，病斑逐漸向葉中脈擴展，形成邊緣褐色、中間暗褐色并凹陷的“V”形大病斑，病斑上可見黑色小顆粒(分生孢子器)，后期葉片枯黃、植株死亡。

2.2 病原菌分離、純化及致病性測定

將病組織置于PDA平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后，所有病組織均長出菌落，對各菌落進行編號、純化，其中產(chǎn)孢真菌用單孢分離法對進行純化，不產(chǎn)孢真菌采用多次挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)皿純化，共得到22個純化菌株。在室內(nèi)將所有菌株離體接種至健康的廣西莪術(shù)葉片，保濕培養(yǎng)5 d后，僅編號為v-3菌株接種后發(fā)病，對照未發(fā)病。發(fā)病葉片表現(xiàn)出明顯的黃褐色病斑，對發(fā)病葉片進行再分離，獲得與原分離菌株一致的病原菌。根據(jù)柯赫氏法則，V-3菌株為該病的致病菌株。

2.3 病原菌的形態(tài)特征

菌株V-3在PDA培養(yǎng)基上生長良好，菌落圓形，菌絲白色、有隔，疏松絨毛狀，2周后培養(yǎng)基背面產(chǎn)生黑色球形至不規(guī)則形分生孢子器，直徑200～500 μm，但挑取分生孢子器在顯微鏡下難觀察到分生孢子。接種病原菌的莪術(shù)葉片，培養(yǎng)15 d后可產(chǎn)生分生孢子器；在顯微鏡下可觀察到兩種類型分生孢子，其中α型分生孢子長紡錘形，無色，單孢，含有l(wèi)-2個油球，大小為(5.2～28.2)μm×(1.5～7.1)μm；β型分生孢子無色，線形，一端稍彎曲，單孢，l-3個油球，大小為(2.5～12.2)μm×(1.0～3.1)μm。根據(jù)上述形態(tài)特征，認(rèn)為該病原菌為擬莖點霉屬(Phomopsissp.)真菌。

2.4 病原菌核糖體DNA-ITS序列分析

采用通用引物ITS1/ITS4對V-3菌株的rDNA—ITS序列進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個大小約為500 bp的片段，經(jīng)序列測定，確定該片段全長451 bp，1～51 bp為部分18SrDNA，52～01 bp為ITS1，202～351 bp為5.8SrDNA，352～401 bp為ITS4，402～451 bp為部分5.8SrDNA(圖1)。將上述測序結(jié)果在GenBank中進行同源性分析，該病原菌株與(Phomopsissp.)同源性達99%。結(jié)合形態(tài)鑒定確定該病原菌為擬莖點霉屬真菌(Phomopsissp.)。

ACCTGCGGAGGGATCATTGCTGGAACGCGCTTCGGCGCACCCAGAAACCCTTTGTGAACTTATACCTATTGTTGCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCTTCACTGAGGCCCCCTGGAGACAGGGAGCAGCCCGCCGGCGGCCAACCAAACTCTTGTTTCTACAGTGAATCTCTGAGTACAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCACTGCTCTCTGACGGGAGCAGGCCCTGAAATCTAGTGGCGAGCTCGCTAGGACCCCGAGCGTAGTAGTTATATCTCGTTCTGGAAGGCCCTGGCGGTGCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA

圖1病原菌ITS-rDNA片段序列圖

2.5 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

試驗結(jié)果(圖2)表明，菌絲在PDA培養(yǎng)基(1號)、莪術(shù)汁PDA培養(yǎng)基(2號)燕麥馬鈴薯培養(yǎng)基(4號)上生長120h后，菌落平均直徑分別為80.5mm、88.5mm、75.8mm，顯著大于其他培養(yǎng)基，其中2號培養(yǎng)基菌株生長最旺盛，菌絲呈白色絮狀且較1號培養(yǎng)基的菌絲稍致密，菌落突起。5號玉米培養(yǎng)基上菌絲生長最差。

圖2 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

2.6溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

圖3-a顯示：該菌絲生長溫度范圍為10 ℃～35 ℃，最適宜溫度范圍為20 ℃～30 ℃，以25 ℃條件下菌絲生長最好，平均直徑為62.0mm，顯著大于其他溫度條件下培養(yǎng)的菌落直徑，在5 ℃、40 ℃下不能生長。圖3-b顯示：分生孢子在10 ℃～35 ℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，20 ℃～30 ℃適宜孢子萌發(fā)，其中25 ℃條件下，萌發(fā)率最高，為80.2%。，5 ℃、40 ℃條件下不能萌發(fā)。

圖3-a 不同溫度對菌絲生長的影響

圖3-b 不同溫度對孢子萌發(fā)的影響

2.7 不同pH值對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

圖4-a結(jié)果表明：菌絲在pH值3～9條件下能生長，適宜的pH值范圍為4～7，pH值為5條件下生長最好，pH值分別為1、2、10、11條件下不能生長。圖4-b結(jié)果表明：分生孢子在pH值3～10的條件下均可萌發(fā)，適宜pH值范圍4～7，pH值為5條件下萌發(fā)最好，pH值分別為1、2、11條件下無法萌發(fā)。

圖4-a 不同pH值對菌絲生長的影響

圖4-b 不同pH值對孢子萌發(fā)的影響

2.8濕度對孢子萌發(fā)的影響

圖5顯示，孢子在相對濕度(RH)為50%-100%條件下均可萌發(fā)，RH 70%～90%適宜萌發(fā)，RH80%萌發(fā)最好，(RH)低于50%，孢子不能萌發(fā)。

圖5 不同濕度對孢子萌發(fā)的影響

3 小結(jié)與討論

擬莖點霉屬真菌是一類重要的植物病原真菌，大豆擬莖點種腐病菌能引起多種植物病害，目前報道的寄主植物除大豆外，還為害三葉草、綠豆、豌豆、花生、大蒜、洋蔥、辣椒、番茄、三裂葉豚草、蒼耳、小地錦草、皺葉酸模等[6]。筆者在傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，通過對廣西莪術(shù)葉斑病病原菌的rDNA-ITS進行分析比對，從分子生物學(xué)水平上進一步明確擬莖點霉屬真菌—大豆擬莖點種腐病菌(Phomopsislongicolla)為廣西莪術(shù)葉斑病的病原真菌，發(fā)現(xiàn)該致病菌侵染廣西莪術(shù)為首次報道。

通過對廣西莪術(shù)葉斑病病原菌的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，該病原菌對營養(yǎng)的要求不嚴(yán)格，在多種培養(yǎng)基上均能生長良好，以PDA、莪術(shù)汁PDA培養(yǎng)基最為適合；菌絲生長及孢子萌發(fā)適宜溫度為20～30 ℃，偏弱酸性條件利于孢子萌發(fā)；孢子萌發(fā)需要一定的濕度，RH<50%不萌發(fā)，RH為80%時孢子萌發(fā)率最高?？梢姡摬≡仓袦?、潮濕、偏弱酸性環(huán)境，在田間控制病害時應(yīng)考慮病原菌的生物學(xué)特性進行。同時，關(guān)于該病原菌對碳氮源的利用等生物學(xué)特性，以及該病害的田間防治技術(shù)還有待進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：193.

[2] 曾建紅，陳旭，蔣小軍，等.廣西莪術(shù)揮發(fā)油抗腫瘤活性成分GC-MS研究[J].中華中醫(yī)藥雜志，2008，增刊：10.

[3] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[4] Graham G C，Mayser S P，Henry R J.A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J].Biotechniques，1994，16(1)：48-50.

[5] Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et a1.The CLUSTAL windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysistools[J].Nucleic Acids Research，1997，24：4876-4882.

[6] 張建成，顧建鋒，徐瑛，等.大豆擬莖點種腐病的研究進展及其檢疫意義[J].植物檢疫，2005，19(3)：163-167.

IdentificationofCurcumakwangsiensisLeafSpotPathogenandObservationofItsBiologicalCharacteristics

JIANG Ni*，LIULihui，HUFengyun，LIUWei，LIUFan

(GuangxiBotanicalGardenofmedicineplant，Nanning530023，China)

Objective：The study is aimed to iendtify the organism that leads to theCurcumakwangsiensisleaf spot andgrasp the biological characteristics of the pathogen.Methods：The fungus was isolated from infected plants according to Koch’s Rule.The identification of the pathogen was carried out mainly based on the morphological characters and molecular analysis of internal transcribed spacer(ITS)sequences；The effects of temperature，humidity，PH and nutrition on mycelial growth and conidialgermination of the pathogen were also investigated.Results：The morphological characters of the pathogenic isolate were in agreement withPhomopsissp.When compared with sequences in GenBank，the ITS sequence of the pathogen was 99% similar to that ofP.longicolla.On the condition of PH5～6，20～30 ℃ the fungal isolates grow bette and the more conidiums germinate.PDA medium with rhizomazedoariae juice was the optimum medium.Conclusion：The pathogen causingC.kwangsiensisleaf spot was identifidied asP.longicolla.The fungal isolates grow better on the condition of medium temperature，humidity and weak acid environment.

Curcumakwangsiensis；disease；pathogen identification；biological characteristic

2015-03-09)

廣西中醫(yī)藥科技專項(GZKZ1133)；南寧市科技成果推廣及產(chǎn)業(yè)化示范項目(201101074C)

*

蔣妮，副研究員，研究方向：藥用植物栽培病蟲害防治；Tel：(0771)5602461，E-mail：jiangni292@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.017