吐魯番錦雞兒根總黃酮的提取純化工藝△

帕孜萊提·艾尼瓦爾，潘蘭，賈新岳，力瓦衣丁·買合蘇提，鄭承劍，賈曉光

(1.新疆大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433)

·中藥工業(yè)·

吐魯番錦雞兒根總黃酮的提取純化工藝△

帕孜萊提·艾尼瓦爾1，潘蘭2，賈新岳2，力瓦衣丁·買合蘇提2，鄭承劍3，賈曉光

(1.新疆大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002；3.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433)

目的：優(yōu)選吐魯番錦雞兒中總黃酮提取純化工藝條件。方法：以吐魯番錦雞兒根總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選吐魯番錦雞兒根總黃酮提取的工藝條件；利用靜態(tài)吸附方法篩選分離吐魯番錦雞兒根總黃酮的最適大孔樹脂，利用動(dòng)態(tài)吸附方法研究最合適大孔樹脂純化吐魯番錦雞兒總黃酮的條件，并用紫外分光光度法測(cè)定其含量。結(jié)果：最佳提取工藝條件為乙醇回流提取法，80%乙醇，料液比為1∶30，提取1 h，溫度為80 ℃。最佳純化工藝條件為上樣液質(zhì)量濃度5 mg·mL-1，上樣液用量5 BV，上樣液流速2 BV·h-1，洗脫劑濃度90%乙醇，洗脫劑流速2 BV·h-1，洗脫劑用量6 BV。結(jié)論：優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、合理，可用于吐魯番錦雞兒根中總黃酮的提取及純化。

吐魯番錦雞兒；總黃酮；大孔樹脂；提?。患兓?/p>

吐魯番錦雞兒Caraganaturfanensis(Krassn.) Kom為豆科錦雞兒屬植物，生于海拔1280～3040 m的山坡、河流階地、峭壁，分布于新疆的伊犁地區(qū)、塔里木盆地、吐魯番盆地[1]。該植物以根入藥，具有活血、利尿、止痛功能，在民間多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病[2-3]。本課題組在前期對(duì)錦雞兒屬植物的研究中發(fā)現(xiàn)，該植物中的黃酮含量較高且種類豐富，主要有黃酮醇、異黃酮、紫檀素、黃酮等類型[4-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃酮類物質(zhì)具有抗腫瘤、護(hù)肝、抗炎、抗病毒、調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)等功能[9-11]，因此，本文以吐魯番錦雞兒的根為研究對(duì)象，進(jìn)行總黃酮的提取純化工藝研究，以期為該資源的開發(fā)利用提供科學(xué)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA2104N電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；DU-7型紫外可見分光光度計(jì)(Bekman公司)；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；回流提取裝置(自制)；玻璃層析柱(自制)。

1.2 材料

吐魯番錦雞兒根采集于新疆烏恰縣(經(jīng)度E75°25′41.76"，緯度N40°05′19.05")，憑證標(biāo)本存放于新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所標(biāo)本室；蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：NIC-100080，含量測(cè)定用)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉為分析純；XDA-1、HPD-100、XDA-6、AB-8、D101型大孔吸附樹脂(河北省滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品的制備 精密稱取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品適量，用80%乙醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為125 μg·mL-1的溶液，搖勻，備用。

2.1.2 供試液的制備 精密稱取樣品1 g，加80%乙醇30倍，回流提取1 h，濾過，80%乙醇定容至100 mL，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL分別置于10 mL具塞試管中。取樣品及對(duì)照品適量于10 mL具塞試管中，以70%乙醇補(bǔ)足為4 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，放置6 min后加10%硝酸鋁0.4 mL，放置6 min，再加4%氫氧化鈉4 mL，用70%乙醇定容，搖勻，放置15 min。處理后，于500 nm處測(cè)定吸光度，建立回歸方程Y=0.012X+0.011 1(Y為吸光度，X為蘆丁濃度)，r=0.999 7。表明蘆丁在5.87～47.67 g·mL-1與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 精密量取供試品溶液6份，同2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“以70%乙醇補(bǔ)足為4 mL”起，以70%乙醇為空白對(duì)照，于500 nm處測(cè)定吸光度，結(jié)果分別為0.290 4、0.297 1、0.298 9、0.299 1、0.300 6、0.301 4，總黃酮平均含量為2.38%，RSD為1.36%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品，分別于0、30、60、90、120、150、180、240、300、360 min測(cè)定吸光值，吸光值隨時(shí)間變化趨勢(shì)見圖1。在30 min內(nèi)該樣品穩(wěn)定，表明該方法的耐用性良好。

圖1 吸光值隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品5份，按照供試品溶液進(jìn)行制備，同2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，于500 nm處依次測(cè)定吸光度，結(jié)果總黃酮平均含量為2.33%，RSD=1.53%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品4份，每份約0.5 g。各加入5 mg蘆丁對(duì)照品，按照供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，在500 nm處依次測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率為98.16%，RSD為0.32%。表明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 總黃酮提取工藝

2.2.1 單因素試驗(yàn) 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響：精密稱取同一批樣品1 g，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇20倍，70 ℃提取1.5 h，濾過，定容至50 mL，測(cè)定總黃酮含量，結(jié)果見圖2。隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率先逐步上升后迅速下降，當(dāng)乙醇濃度70%時(shí)的提取效果最好，總黃酮含量為2.64%。

圖2 總黃酮含量隨乙醇濃度變化趨勢(shì)

提取溫度對(duì)提取效果的影響：精密稱取樣品1 g，分別于40、50、60、70、80、90 ℃加20倍的70%乙醇，提取1.5 h，濾過，定容至50 mL，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果見圖3。總黃酮含量隨著提取溫度的升高而提高，盡管圖中顯示90 ℃時(shí)的黃酮含量最高，但考慮提取溫度過高有可能破壞黃酮類化合物中的有效成分，且80 ℃與90 ℃條件下，總黃酮含量差異較小，因此提取溫度選擇80 ℃。

圖3 總黃酮含量隨提取溫度變化趨勢(shì)

料液比對(duì)提取效果的影響：精密稱取樣品1 g，分別加入10 倍、20倍、30 倍、40 倍的70%的乙醇，于80 ℃下提取1.5 h，濾過，定容至50 mL，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果圖4?？傸S酮含量隨料液比的提高而有明顯增加，且料液比為40 mL·g-1的總黃酮的提取率較30 mL·g-1時(shí)低。因此料液比選擇30倍。

圖4 總黃酮含量隨料液比變化趨勢(shì)

提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響：精密稱取樣品1 g，30倍的70%的乙醇，在80 ℃下分別提取1.0、1.5、2.0、2.5 h，濾過，定容至50 mL，測(cè)定總黃酮含量。結(jié)果圖5。提取時(shí)間為1.5 h的時(shí)候總黃酮含量最佳，所以提取時(shí)間選擇1.5 h。

圖5 總黃酮含量隨提取時(shí)間變化趨勢(shì)

2.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間4個(gè)因素，以吐魯番錦雞兒總黃酮的含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

表2 正交試驗(yàn)方差分析

由表1可知，吐魯番錦雞兒中黃酮類物質(zhì)提取的最優(yōu)參數(shù)組合是A3B1C2D2，即乙醇提取提取最佳工藝條件：乙醇濃度為80%，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶30，提取時(shí)間為1 h。由表2可知，影響吐魯番錦雞兒根總黃酮提取效果的各因素排序?yàn)榱弦罕?提取時(shí)間>溫度>乙醇濃度。料液比對(duì)總黃酮提取量有顯著影響。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按正交試驗(yàn)所確定條件，80%乙醇，提取提取1 h，料液比為1∶30，溫度為80 ℃，提取1次，平行做3次，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果吐魯番錦雞兒中總黃酮平均含量為2.96%。

2.3 吐魯番錦雞兒總黃酮純化

2.3.1 樣品溶液的制備 取吐魯番錦雞兒樣品適量，加入30倍量的80%乙醇，80 ℃提取1 h，樣液過濾，在55 ℃下烘干，得樣品干膏。

2.3.2 大孔樹脂的預(yù)處理 XDA-1、HPD-100型等大孔樹脂用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡24 h，充分溶脹后，再用大量蒸餾水洗盡至無醇味，備用。

2.3.3 樹脂的篩選 靜態(tài)吸附考察：分別稱取已處理好的5種型號(hào)的樹脂XDA-1、HPD-100、XDA-6、AB-8、D101各2 g(濕重)置于錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的樣液20 mL，室溫下靜置吸附24 h，過濾。將過濾后的樣品液按2.1方法測(cè)定總黃酮含量，并計(jì)算樹脂的吸附率。按下式計(jì)算吸附量及吸附率。

吸附率(S)= ( P0-Pa)/P0

吸附量(E)= ( P0-Pa) Va/M

式中P0為吸附前樣液濃度(mg·mL-1)；Pa為吸附后樣液濃度(mg·mL-1)；Va為溶液體積(mL)；M為樹脂重量(mg)。

靜態(tài)洗脫考察：取上述經(jīng)吸附總黃酮后濾出的樹脂，分別精密加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇20 mL，洗脫，在室溫下靜止解吸24 h，過濾，取各樣品2 mL,于10 mL具塞試管中，按下式計(jì)算各型號(hào)樹脂的解吸率。

解吸率=(解吸液濃度×解吸液體積)/(樹脂重量×吸附量)。結(jié)果見表3。

表3 大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附量和解吸率

由表知，HPD-100 和XDA-1型樹脂的吸附能力較強(qiáng)，這可能與HPD-100 和XDA-1型樹脂的比表面積大有關(guān)。HPD-100的解析率最高。綜合考慮吸附率及解析率，選用HPD-100樹脂進(jìn)行總黃酮的純化。

2.3.4 HPD-100型吸附樹脂純化總黃酮的工藝參數(shù)考擦 最佳上樣濃度的選擇：在保持黃酮總量不變的情況下分別取5份質(zhì)量濃度分別為3、4、5、6、7 mg·mL-1的樣品液分別通過大孔吸附樹脂柱，以2 BV·h-1(BV為樹脂體積數(shù)，下同)的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，待上樣完后，用3 BV的蒸餾水，以2 BV·h-1的流速洗柱，并將流出液和水洗液收集在一起作為吸附殘液，記錄殘液體積，計(jì)算吸附率。在濃度范圍內(nèi)，吸附率隨上樣液濃度的增加而增大，但當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度高于5 mg·mL-1后吸附率增長(zhǎng)的速度漸緩。因此最終選擇上樣液質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1。結(jié)果見圖6。

圖6 上樣液濃度對(duì)吸附率的影響

最佳上樣量的選擇：按確定的上樣液濃度，分別上樣1、2、3、4、5、6、7、8 BV，以2 BV·h-1的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，再以3 BV的蒸餾水，收集殘液，準(zhǔn)確記錄殘液體積，測(cè)定殘液中黃酮的吸光度值，計(jì)算出黃酮濃度，確定上樣量。隨著上樣量的增加，流出液中的黃酮含量增大，當(dāng)上樣量為5 BV時(shí)，黃酮泄漏開始明顯增加，因此，綜合考慮上樣量為5 BV適宜。結(jié)果見圖7。

圖7 上樣量對(duì)黃酮吸附效果的影響

最佳吸附流速的選擇：按上述確定的上樣液濃度及上樣量，分別以2、3、4、5 BV·h-1的速率加入裝有大孔樹脂的層析柱內(nèi)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。待上樣完后，用3 BV的蒸餾水洗柱，并將流出液和水洗液收集在一起作為吸附殘液，記錄殘液體積，測(cè)定殘液的吸光度值，計(jì)算吸附率。根據(jù)結(jié)果選擇吸附流速為2 BV·h-1。結(jié)果見圖8。

圖8 吸附速率對(duì)黃酮吸附效果的影響

洗脫劑用量的選擇：按上述確定的吸附與洗脫條件，取樣品液進(jìn)行上柱、吸附、洗脫，按樹脂床體積分段收集洗脫液16份(每半個(gè)柱體積收集一份)，測(cè)定每一份流出液中總黃酮濃度。結(jié)果見圖9。當(dāng)乙醇的用量為6 BV時(shí)，黃酮濃度最大，但當(dāng)乙醇的用量大于6 BV后，洗脫液中的總黃酮含量明顯降低，故洗脫劑的用量應(yīng)選擇6 BV為宜。

圖9 洗脫劑用量對(duì)黃酮解吸效果的影響

洗脫劑流速的選擇：按上述確定的吸附條件，取樣品液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附。樹脂柱分別用水洗脫至洗脫液近無色，再用6 BV 90%的乙醇分別以2、3、4 BV·h-1的速率進(jìn)行動(dòng)態(tài)解吸，收集解吸液，記錄解吸液體積，測(cè)定吸光度值，計(jì)算解吸液中黃酮濃度。結(jié)果見圖10。

圖10 洗脫劑流速對(duì)黃酮解吸效果的影響

結(jié)果表明，隨著解吸速率的不斷增加，黃酮濃度在不斷的降低，當(dāng)流速為2 BV·h-1時(shí)，解吸效果較好，故洗脫速率選擇2 BV·h-1為宜。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按上述確定的吸附與洗脫條件，取3份樣品液進(jìn)行上柱、吸附、洗脫，依法測(cè)定吸附殘液與洗脫液中黃酮的吸光度值，計(jì)算解吸率。結(jié)果吐魯番錦雞兒解吸率分別為99.12%、99.86%、99.82%，平均為99.60%，收率為47.5%，純化后的含量為58.24%。

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物易溶于乙醇等溶劑中，且乙醇對(duì)環(huán)境污染性小、成本低，因此，本試驗(yàn)采用乙醇作為提取溶劑。研究進(jìn)行了總黃酮回流提取及超聲提取的比較，發(fā)現(xiàn)回流提取法得到的黃酮含量是超聲提取的2倍，且本方法簡(jiǎn)便、高效，便于操作，故選擇回流提取法提取吐魯番錦雞兒中的總黃酮。

本對(duì)于一定量的溶質(zhì)來講，增加上樣濃度意味著增大了溶質(zhì)與樹脂的接觸機(jī)會(huì)，因此，樹脂對(duì)溶質(zhì)的物理吸附作用和化學(xué)吸附作用均較強(qiáng)，吸附效果也更好。但上樣液濃度過高將導(dǎo)致吸附選擇性降低，所以必須選擇適宜的吸附液濃度。

研究確定了吐魯番總黃酮提取及純化的工藝。乙醇回流提取總黃酮的最佳工藝：80%乙醇提取1 h，料液比為1∶30，溫度為80 ℃。方差分析表明，在不考慮交互作用的情況下，料液比對(duì)總黃酮提取量有顯著影響。采用靜態(tài)吸附法考察5種不同類型的樹脂對(duì)吐魯番錦雞兒總黃酮的吸附與解吸能力。吐魯番錦雞兒純化的條件：上樣液質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1，上樣液用量為5 BV，上樣液流速為2 BV·h-1，洗脫劑為90%乙醇，洗脫劑流速為2 BV·h-1，洗脫劑用量為6 BV。在此條件下，吐魯番錦雞兒總黃酮的收率為47.5%，純化后的含量為58.24%。

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ExtractionandPurificationofTotalFlavonoidsinCaraganaturfanensisRoot

Pazilaiti·Ainiwaer1，PAN Lan2，JIA Xinyue2，Liwayiding·Maihesuti2，ZHENG Chengjian3，JIA Xiaoguang

(1.XinjiangUniversity，XinjiangUrumqi，830046，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMadicaandEthnodrug，XinjiangUrumqi830002，China； 3.SecondMilitaryMedicalUniversityofChina，Shanghai200433，China)

Objective：To optimize the extraction and purification process conditions of total flavonoids inCaraganaturfanensis(Krassn.) Kom.root.Methods：According to content of total flavonoids as indexes，the orthogonal experiment design was used to optimize the extraction process of total flavonoids inC.turfanensisroot.Static absorption method was adopted to optimize macroporous resin for separating total flavonoids.Dynamic absorption was introduced to study the conditions for purifying total flavonoids by using the selected optimum macroporous adsorption resin.The analysis of the contents of total flavonoids was accomplished with UV spectrophotometry.Results：The optimized extraction conditions are 80% ethanol，liquid to solid ratio 1∶30，1 h extraction time，80 ℃ extraction temperature.The optimum purification conditions were 5 mg·mL-1of the sampling liquid concentration，5 BV of the sample liquid volume，2 BV·h-1of the sampling velocity，and 2 BV·h-1of the elution speed with 90% ethanol.Conclusion：The extraction and purification process is stable，rational and feasible for the extraction of total flavonoids fromC.turfanensisroot.

Caraganaturfanensis(Krassn.) Kom；total flavonoids；macroporous adsorption resin；extraction；purification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.017

2016-01-14)

NSFC-新疆聯(lián)合基金(U1203202)；新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(XJDX0201-2013-02)

*

賈曉光，研究員，研究生導(dǎo)師，研究方向：中藥民族藥；E-mail：xgjia@vip.sina.com