HPLC法同時測定猴頭菇提取物中3種核苷

汪楊麗，陳曉虎，王慧，蘇晶

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121)

·中藥工業(yè)·

HPLC法同時測定猴頭菇提取物中3種核苷

汪楊麗*，陳曉虎，王慧，蘇晶

(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121)

目的：建立高效液相色譜法同時測定猴頭菇提取物中尿苷、鳥苷和腺苷的含量。方法：采用Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動相為乙腈- 0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，梯度洗脫；檢測波長為260 nm。結(jié)果：尿苷、鳥苷、腺苷的線性范圍分別為0.034 43～0.688 6 μg(r=1)、0.022 26～0.445 1 μg(r=1 )、0.026 93～0.538 6 μg(r=0.999 9)，尿苷、鳥苷、腺苷的平均回收率(n=6)分別為97.6%(RSD=2.0%)、96.3%(RSD=1.0%)、96.3%(RSD=0.8%)。結(jié)論：該方法簡便、準確、可行，可為猴頭菇提取物的生產(chǎn)和使用提供質(zhì)量評價依據(jù)。

猴頭菇提取物；核苷；高效液相色譜法

猴頭菇為齒菌科猴頭菌Hericumerinaceus(Bull.)Pers.的子實體[1]，為藥食兩用的真菌，入藥能助消化、利五臟、促進腸胃功能，并能提高人體的免疫力[2]。猴頭菇含有多糖、核苷化合物、氨基酸等成分。有關(guān)猴頭菇多糖[1，3-4]的提取及含量測定的研究較多，戚雁飛[5]僅對猴頭菇中腺苷進行確認和含量測定。猴頭菇提取物是猴頭菇子實體的水浸提液以10∶1的比例干燥濃縮干燥而得。本試驗參考相關(guān)文獻，采用高效液相色譜法，應(yīng)用梯度洗脫測定猴頭菇提取物中的尿苷、鳥苷、腺苷的含量。結(jié)果表明，該方法簡便、準確、重復(fù)性好，可作為猴頭菇提取物的質(zhì)量控制方法之一，為猴頭菇保健品和藥品的進一步開發(fā)利用提供質(zhì)量評價依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695-2489高效液相色譜儀系統(tǒng)；Bp221s 型電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；Ax205電子天平(梅特勒公司)；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；3-30KS離心機(德國Sigma公司)。

1.2 試藥

尿苷對照品、鳥苷對照品(SIGMA公司，批號分別為1181124,101474373);腺苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號為110879-200202)；猴頭菇提取物(紐西蘭安發(fā)保健品有限公司)；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate AQ C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈為流動相A，0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液為流動相B，梯度洗脫，見表1；檢測波長為260 nm；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫色譜條件

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取尿苷、鳥苷、腺苷對照品適量，加水溶解，制成尿苷對照品儲備液(質(zhì)量濃度為0.430 4 mg·mL-1)、鳥苷對照品儲備液(質(zhì)量濃度為0.556 4 mg·mL-1)和腺苷對照品儲備液(質(zhì)量濃度為0.336 6 mg·mL-1)。精密量取鳥苷對照品儲備液1 mL，尿苷和腺苷對照品儲備液各2 mL，同置25 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，即得混合對照品溶液,冷藏保存。

2.3 供試品溶液的制備

取猴頭菇提取物適量，研細，混勻，取約0.6 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min(功率：450 W，頻率：50 Khz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，離心10 min(7000 r·min-1)，取上清液10 mL，蒸干，殘渣加水溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，并用水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗

分別精密吸取對照品、供試品溶液及水各10 μL，按上述色譜條件進行測定。結(jié)果供試品色譜中，在與尿苷、鳥苷、腺苷對照品相同的保留時間處均有吸收峰，而水液在此保留時間無干擾，見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.陰性樣品；1.尿苷；2.鳥苷；3.腺苷。圖1 尿苷、鳥苷、腺苷的高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

取2.2項下的混合對照品溶液，按上述色譜條件，分別進樣1、5、10、15、20 μL測定。以進樣質(zhì)量為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得尿苷、鳥苷、腺苷回歸方程分別為Y=2×106X-5 650.1(r=1)、Y=2×106X-7 488.5(r=1)、Y=3×106X-10 816(r=0.999 9)。結(jié)果表明，尿苷、鳥苷、腺苷分別在0.034 43～0.688 6、0.022 26～0.445 1、0.026 93～0.538 6 μg線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

取2.2項下的尿苷、鳥苷、腺苷混合對照品溶液，連續(xù)進樣5次，每次10 μL，測定峰面積，結(jié)果尿苷、鳥苷、腺苷峰面積的RSD分別為0.04%、1.0%、0.06%,表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取同一批號樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣10 μL，測定峰面積，計算尿苷、鳥苷、腺苷的峰面積RSD分別為0.08%、1.7%、1.5 %，表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性考察

取同一批號樣品，按2.2項方法分別制備6份供試品溶液，分別測定尿苷、鳥苷、腺苷的含量，6次重復(fù)測定結(jié)果的RSD分別為0.76%、0.98%、1.7%。

2.9 加樣回收率試驗

分別精密量取尿苷對照品溶液(0.326 4 mg·mL-1)2.3 mL、鳥苷對照品溶液(0.476 4 mg·mL-1)1.0 mL、腺苷對照品溶液(0.336 6 mg·mL-1)1.7 mL，置錐形瓶中(平行6份)，置水浴上蒸干，加入已知含量的樣品(尿苷質(zhì)量分數(shù)為2.8 mg·g-1、鳥苷質(zhì)量分數(shù)為1.6 mg·g-1、腺苷質(zhì)量分數(shù)為2.0 mg·g-1)約0.3 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 尿苷、鳥苷、腺苷的加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.10 樣品的測定

取3批猴頭菇提取物，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，用外標法計算，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3) /mg·g-1

3 討論

3.1 提取方法的選擇

試驗中選用了體積分數(shù)為20%、50%、70%甲醇作為提取溶劑，進行超聲提取，結(jié)果表明，70%甲醇提取的樣品充分，雜質(zhì)少。比較超聲20、30、40 min樣品中各組分的提取率，發(fā)現(xiàn)30 min提取效率高。核苷類成分水溶性較好，若采用甲醇-水混合溶液溶解樣品，易造成色譜峰分叉，故選用70%提取液蒸干后用水溶解。

3.2 流動相的選擇

參考相關(guān)文獻[6-8]，分別采用甲醇-水、甲醇-磷酸緩沖鹽(pH=6.5)、乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀等作為流動相體系，梯度洗脫。結(jié)果表明，本試驗使用的流動相體系能使供試品色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰分離度好、峰形尖銳、對稱性好、保留時間適宜，且方法的重復(fù)性好。

3.3 供試品溶液終濃度的選擇

3批樣品的三苷含量較高，考慮到藥材質(zhì)量的波動可能使供試品溶液進樣量超出線性范圍，因此供試品提取后最終用水溶解并定容至25 mL，其較定容至10 mL更合理。不同批次猴頭菇提取物之間尿苷、鳥苷、腺苷的含量較穩(wěn)定，表明三苷可以作為一個穩(wěn)定的控制因子，為猴頭菇提取物提供質(zhì)量分析指標。

[1] 賈聯(lián)盟，劉柳，董群，等.猴頭菇子實體中的主要多糖成分[J].中草藥，2005，36(1)：10-12.

[2] 杜鵑，王琰.猴頭菇種7種金屬元素含量分析[J].微量元素與健康研究，2010，27(1)：46-47.

[3] 猴梁華，李雪華，陸亞春.猴頭菇多糖提取工藝研究[J].食品與機械，2006，22(1)：35-38.

[4] 張帥，沈楚燕，董基.酶法提取猴頭菇多糖的研究[J].河南工業(yè)大學學報(自然科學版)，2010，31(2)：76-79.

[5] 戚雁飛.HPLC測定復(fù)方猴頭膠囊中腺苷的含量[J].中成藥，2002，24(3)：181-183.

[6] 孫忠華，肖建輝，遲強，等.高效液相色譜法測定三種蟲草發(fā)酵液與菌絲體核苷化合物含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26(12)：2000-2003.

[7] 顏棟林.HPLC法測定冬草夏草膠囊中腺苷含量[J].藥學實踐雜志，2010，28(4)：293-294.

[8] 武彥舒，周丹蕾，鄢丹.天然蟲草與蟲草菌絲體的HPLC指紋圖譜研究[J].中國中藥雜志，2008，33(19)：2212-2214.

SimultaneousDeterminationofThreeNucleosidesinHericumerinaceusExtractbyHPLC

WANG Yangli*，CHEN Xiaohu，WANG Hui，SU Jing

(ChongqingInstituteforFoodandDrugControl，ChongqingEngineeringTechnologyResearchCenterforPharmaceuticalProcessandQualityControl，Chongqing401121，China)

Objective：To establish an HPLC method to simultaneously determine the contents of uridine，guanosine and adenosine inHericumerinaceusextract.Methods：Welch Ultimate AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5μm) was used for determination.Acetonitrile-0.05 mol·L-1potassium dihydrogen phosphate solution was used as the mobile phase in a gradient elution mode，and the detection wavelength was 260 nm.Results：The linearity ranges obtained from calibration curves of uridine，guanosine and adenosine were 0.034 43～0.688 6 μg (r=1)，0.022 26 ～ 0.445 1 μg (r=1)，0.026 93～0.538 6 μg (r=0.999 9)，respectively.The average recoveries (n=6) were 97.6%(RSD=2.0%)，96.3%(RSD=1.0%)，96.3%(RSD=0.8%)，respectively.Conclusion：The method is simple，accurate and validated，which can be used for the quality evaluation ofH.erinaceusextract.

Hericumerinaceusextract；nucleoside；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.022

2015-12-04)

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汪楊麗，主管中藥師，研究方向：中藥分析；E-mail：wangyangli81@163.com