毛頭牛蒡子抗氧化和降血糖的有效部位篩選研究△

駱秀珍，文娥，田樹(shù)革，周曉英*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 3.新疆醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

·專(zhuān)題·

毛頭牛蒡子抗氧化和降血糖的有效部位篩選研究△

駱秀珍1，文娥2，田樹(shù)革3，周曉英1*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011； 3.新疆醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：篩選出毛頭牛蒡子中抗氧化和降血糖的有效部位。方法：將毛頭牛蒡子粗多糖提取物經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂脫色純化，依次采用水和20%、40%、60%乙醇水進(jìn)行洗脫，以DPPH自由基清除活性、還原力的測(cè)定、羥基自由基清除活性和超氧陰離子清除活性4項(xiàng)指標(biāo)研究不同洗脫部位的抗氧化活性，采用體外α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定毛頭牛蒡子提取物不同部位的降血糖活性。結(jié)果：毛頭牛蒡子20%乙醇水洗脫部位的抗氧化活性和降血糖活性均強(qiáng)于其他部位。結(jié)論：毛頭牛蒡子抗氧化和降血糖的活性部位應(yīng)為20%乙醇水洗脫部位。

毛頭牛蒡子；抗氧化；降血糖

毛頭牛蒡子為菊科牛蒡?qū)僦参锩^牛蒡ArctiumtomentosumMill.的干燥成熟果實(shí)，維吾爾語(yǔ)名為“可熱可孜烏拉蓋”，在新疆分布廣泛。毛頭牛蒡的根和葉在維吾爾民間用于治療風(fēng)濕痛及皮膚癢痛，種子被認(rèn)為是牛蒡子的偽品[1]，主要用于風(fēng)熱感冒，咳嗽痰多，麻疹，咽喉腫痛，痄腮丹毒，癰腫瘡毒[2]。有研究表明毛頭牛蒡子醇提物的醋酸乙酯和正丁醇萃取部分具有一定的抗氧化活性[3]，但關(guān)于毛頭牛蒡子提取物不同洗脫部位的體外抗氧化和降血糖活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本文通過(guò)對(duì)毛頭牛蒡子活性部位的篩選為毛頭牛蒡子藥理活性的研究提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

XS105型十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多)；Spectra Max190酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(澳大利亞GBC科學(xué)儀器公司)；TGL16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))。

1.2 試藥

毛頭牛蒡子采集于新疆阿勒泰地區(qū)(經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院李永和主任藥師鑒定為毛頭牛蒡的干燥成熟果實(shí))；α-葡萄糖苷酶(Sigma，批號(hào)：129K1426)，對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma公司，批號(hào)：026K1516)，阿卡波糖 (Acarbose，Sigma公司，批號(hào)：16869)；DPPH(Sigma公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

毛頭牛蒡子粉碎后，加95%乙醇水回流提取2次，每次2 h，以除去脂溶性雜質(zhì)，過(guò)濾，藥渣揮干溶劑，加蒸餾水在90 ℃提取1 h，提取2次，合并提取液，濃縮，加入1/4體積的Sevag試劑[三氯甲烷-正丁醇(4∶1)的混合溶液劇烈振搖15 min，靜置，除去下層蛋白質(zhì)變性層，重復(fù)以上操作直到無(wú)白色絮狀物產(chǎn)生為止。取上層多糖液加入適量乙醇使終濃度為80%進(jìn)行沉淀，4 ℃下靜置過(guò)夜。離心，收集沉淀，置干燥箱中干燥得粗多糖。

大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇水浸泡24 h，濕法裝柱，并用95%乙醇水流動(dòng)沖洗，至流出的乙醇加水(1∶5)不產(chǎn)生渾濁為止，然后用大量蒸餾水洗至無(wú)醇味，待用。將毛頭牛蒡子粗多糖溶于水中，上樣，依次用水，20%、40%、60%乙醇水洗脫，收集洗脫液，每次用Molish反應(yīng)檢驗(yàn)有無(wú)多糖的流出，洗至無(wú)多糖流出，濃縮，冷凍干燥，備用。依次命名為a、b、c、d。

2.2 毛頭牛蒡子不同洗脫部位抗氧化活性的研究

2.2.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 分別吸取不同濃度(0.1～5.0 g·L-1)的樣品溶液2.00 mL，加入1.5 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液3.00 mL，搖勻，室溫下置黑暗處30 min，517 nm處測(cè)定吸光度值(Vc作為陽(yáng)性對(duì)照)[4-5]。按公式(1)計(jì)算清除能力，結(jié)果見(jiàn)表1。

清除能力S(%)=[1-(C-B)/A]×100%

(1)

式中：A—未加多糖液時(shí)溶劑的吸光度， B—多糖液的吸光度， C—加多糖液后溶液的吸光度。

表1 毛頭牛蒡子粗多糖不同洗脫部位各濃度的DPPH自由基清除活性

由表1結(jié)果可以看出a～d對(duì)DPPH自由基均具有一定的清除作用，其中b的清除活性高于其他3個(gè)部位，清除率高達(dá)75.35%，且隨著濃度的增高清除率也在增加，但a、b、c、d對(duì)DPPH自由基的清除活性(IC50依次為3.962，1.209，48.456，147.594 g·L-1)均低于陽(yáng)性對(duì)照組Vc(IC50=0.048 g·L-1)。

2.2.2 還原力的測(cè)定 分別吸取不同濃度(0.1～5.0 g·L-1)的樣品溶液1.00 mL，依次加入2.5 mL(pH=6.6，0.2 mol·L-1)磷酸鹽緩沖液和5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后50 ℃保溫20 min；加三氯乙酸5 mL，混勻后離心10 min(4 000 r·min-1)。取2.5 mL上清液，依次加入去離子水和氯化鐵溶液，搖勻后在室溫下反應(yīng)10 min，700 nm處測(cè)定吸光度(Vc作為陽(yáng)性對(duì)照)[6]。

由表2結(jié)果可以看出，a、b、c均具有較強(qiáng)的還原力，吸光度值大于0.5，在0.1～5.0 g·L-1濃度范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，其中b的還原能力最強(qiáng)，a和c還原能力接近，但明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組，d洗脫部位的還原能力較弱。

2.2.3 清除羥基自由基能力的測(cè)定 分別吸取不同濃度(0.1～5.0 g·L-1)的樣品溶液1.00 mL，依次加入4.5 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液、水楊酸-乙醇溶液，再加入1.00 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，搖勻在37 ℃水浴放置0.5 h，510 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算清除率，清除率公式同2.2.1(Vc作為陽(yáng)性對(duì)照)[7-8]。

由表3結(jié)果可以看出，b具有顯著的羥基自由基清除活性，當(dāng)b的濃度為5 g·L-1時(shí)，清除率高達(dá)85.34%。a也具有一定的清除活性，但清除率低于b，其余兩個(gè)洗脫部位清除活性較弱。Vc的清除活性(IC50=0.089 g·L-1)明顯高于a、b、c、d(IC50依次為2.420，0.768，18.446，163.137 g·L-1)。

2.2.4 清除超氧陰離子能力 分別吸取不同質(zhì)量濃度(0.1～5.0 g·L-1)的樣品溶液0.50 mL，加入3.00 mL Tris-HCl緩沖液(pH = 8.2)混合，在30 ℃水浴中保溫20 min，然后再加入鄰苯三酚溶液，混勻后在水浴中反應(yīng)5 min(25 ℃)，最后加入1.00 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，420 nm 處測(cè)吸光度值，清除率公式同2.2.1(Vc作為陽(yáng)性對(duì)照)[9-11]。

由表4結(jié)果可以看出，a、b、c、d均具有一定的清除活性，b對(duì)超氧陰離子的清除作用最強(qiáng)(IC50=1.121 g·L-1)，但同濃度下的清除率均遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照組(IC50=0.089 g·L-1)，a、c和d的清除作用較弱(IC50依次為5.002、15.500、11 174.731 g·L-1)，當(dāng)d的濃度為5 g·L-1時(shí)，清除活性?xún)H為9.67%。

2.3 毛頭牛蒡子不同洗脫部位降血糖活性的研究

根據(jù)已有方法進(jìn)行改進(jìn)[12-14]，反應(yīng)體系：測(cè)定組(Ati)，112 μL磷酸鉀緩沖液，加入0.2 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL，8 μL的待測(cè)液，37 ℃恒溫反應(yīng)15 min后，加入PNPG溶液20 μL，恒溫37 ℃反應(yīng)15 min，反應(yīng)完成之后，加入Na2CO3溶液80 μL，在波長(zhǎng)405 nm下測(cè)定A值；空白對(duì)照組(Ab)，與測(cè)定組的區(qū)別是本組不加抑制劑和α-葡萄糖苷酶；未加抑制劑測(cè)試組(At0)，與測(cè)定組的區(qū)別是本組不加抑制劑；未加酶空白組(Abi)，與測(cè)定組的區(qū)別是本組未加α-葡萄糖苷酶；以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照。按公式(2)計(jì)算抑制率。

表2 毛頭牛蒡子粗多糖不同洗脫部位各濃度的還原能力

表3 毛頭牛蒡子粗多糖不同洗脫部位各濃度的羥基自由基清除活性

表4 毛頭牛蒡子粗多糖不同洗脫部位各濃度的超氧陰離子清除活性

抑制率(%)={(At0-Ab)-[(Ati-Ab)-(Abi-Ab)]} /(At0-Ab)×100%

(2)

由表5可以看出毛頭牛蒡子不同洗脫部位除了d對(duì)α-葡萄糖苷酶無(wú)抑制作用外，a、b、c均具有較好的抑制作用，且抑制作用大于陽(yáng)性對(duì)照。抑制率大小順序?yàn)閎>a>c>阿卡波糖>d。

表5 毛頭牛蒡子不同洗脫部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究毛頭牛蒡子不同洗脫部位清除DPPH自由基活性、羥基自由基活性、超氧陰離子活性及還原力能力的測(cè)定對(duì)其中的抗氧化活性部位進(jìn)行篩選，同時(shí)采用體外α-葡萄糖苷酶抑制活性對(duì)其降血糖活性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛頭牛蒡子20%乙醇水洗脫部位抗氧化及降血糖活性最強(qiáng)。并且通過(guò)對(duì)毛頭牛蒡子不同洗脫部位化學(xué)成分的初步研究,發(fā)現(xiàn)20%乙醇水洗脫部位的多糖含量最高，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[15-16]推測(cè)其抗氧化和降血糖活性可能與多糖類(lèi)成分有關(guān)，具體有效成分組成及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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StudyonScreeningofEffectivePartsfromArctiumtomentosumMill.SeedsbyAntioxidantandHypoglycemicActivity

LUO Xiuzhen1，WEN E2，TIAN Shuge3，ZHOU Xiaoying1*

(1.PharmacyCollege，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；2.CollegeofTCM，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China；3.CenterofLAB，XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China)

Objective：To screen the effective parts fromArctiumtomentosumMill.seeds by antioxidant and hypoglycemic activity.Methods：The extracts were purified by AB-8 macroporous resin，eluted with water and 20%，40%，60% ethanol.The antioxidant activities were examined from the aspects of reducing power，scavenging rate of DPPH，hydroxyl and superoxide anion free radicals respectively.The hypoglycemic activity was examined by α-glucosidase inhibitory activities.Results：The antioxidant activity and hypoglycemic activity in 20% ethanol elution was higher than other parts.Conclusion：The active site ofA.tomentosumseeds should belong to the 20% ethanol elution parts.

ArctiumtomentosumMill.seeds；antioxidant activity；hypoglycemic activity

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.10.006

2016-01-15)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金 (2015211C025)

*

周曉英，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物的質(zhì)量控制與活性篩選；E-mail：zhouxiaoying4@163.com