HPLC-ELSD測(cè)定川楝子中川楝素含量

孟杰，朱文俊，王禮均*，黃國(guó)杰，寧鶴，文永盛

(1.四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，四川 成都 611730；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610000)

·基礎(chǔ)研究·

HPLC-ELSD測(cè)定川楝子中川楝素含量

孟杰1，朱文俊1，王禮均1*，黃國(guó)杰1，寧鶴1，文永盛2

(1.四川省中藥飲片有限責(zé)任公司，四川 成都 611730；2.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 610000)

目的：對(duì)比HPLC-MS，采用HPLC-ELSD建立適宜于川楝子中川楝素測(cè)定的新方法。方法：采用HPLC-ELSD，色譜柱：Agilent Eclipse XDS-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%甲酸溶液(3l∶69)，流量：1.0 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測(cè)器漂移管溫度：95 ℃，氣體流速：2.8 L·min-1，測(cè)定了12批不同產(chǎn)地川楝子中川楝素的含量。同時(shí)采用HPLC-MS法，儀器為島津LCMS-8040，色譜柱為InertSustainTMC18(50 mm×2.1 mm，2 μm)，分析條件照《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部“高效液相色譜-質(zhì)譜法”(附錄Ⅵ D和附錄Ⅸ J)，測(cè)定12批不同產(chǎn)地川楝子中川楝素的含量。結(jié)果：在本研究HPLC-ELSD法條件下，川楝素在3.78～47.25 μg線性關(guān)系良好(r=0.999 1)，平均回收率為99.43%，RSD=1.44%(n=9)，對(duì)比HPLC-MS法測(cè)定結(jié)果，方差分析顯示兩測(cè)定方法結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：本研究首次建立了HPLC-ELSD測(cè)定川楝子中川楝素含量的方法，該方法快速、準(zhǔn)確，適用于川楝子中川楝素的含量測(cè)定。

高效液相；蒸發(fā)光；質(zhì)譜；川楝子；川楝素

川楝子，又稱金鈴子，為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的干燥成熟果實(shí)，具有疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲的功能，用于治療肝郁化火，胸脅、脘腹脹痛，疝氣疼痛，蟲積腹痛[1]。川楝素(toosendanin，TSN)作為川楝子發(fā)揮藥效的主要成分，廣泛地存在于川楝子中，其含量高低也直接作為川楝子藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。川楝素結(jié)構(gòu)中具有半縮醛，始終有兩個(gè)互變異構(gòu)體存在，故定量時(shí)以川楝素兩個(gè)峰面積之和計(jì)算[2-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC-UV法測(cè)定川楝子中川楝素的含量[4-6]，但實(shí)際情況下，川楝素紫外特征吸收為208 nm，接近末端吸收，此法容易受提取物中其他雜質(zhì)干擾，且紫外檢測(cè)器在低波長(zhǎng)時(shí)基線容易產(chǎn)生漂移，所以《中華人民共和國(guó)藥典》(《中國(guó)藥典》)2010年版川楝子“含量測(cè)定”項(xiàng)下規(guī)定，川楝素的定量方法為高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)，該方法雖然靈敏、可靠，但是質(zhì)譜儀操作較為復(fù)雜且價(jià)格昂貴，目前國(guó)內(nèi)許多科研單位、企業(yè)還尚未配備[7-8]。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)為質(zhì)量型檢測(cè)器，其測(cè)定方法不依賴于樣品的光學(xué)性質(zhì)，適用于無紫外吸收的化學(xué)成分檢測(cè)[9]。本研究采用高效液相結(jié)合蒸發(fā)光散色檢測(cè)器對(duì)比高效液相-質(zhì)譜法測(cè)定12批不同產(chǎn)地川楝子中川楝素含量，最終證明本研究所確立的HPLC-ELSD法代替HPLC-MS法測(cè)定川楝子中川楝素含量的方法可行。本研究建立了川楝子中川楝素含量的新測(cè)定方法，該方法快速、準(zhǔn)確，適用于川楝子中川楝素的含量測(cè)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫1200高效液相色譜儀，Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光檢測(cè)器，島津電子分析天平；島津LCMS-8040超高效液質(zhì)聯(lián)用儀，包括LC-30AD×2(輸液泵)，SIL-30AC(自動(dòng)進(jìn)樣器)，CTO-30AC(柱溫箱)，CBM-20A(系統(tǒng)控制器)，DGU-20A5(在線脫氣機(jī))，LCMS-8040(四極桿質(zhì)譜儀)和LCMSsolution Ver.5.53(工作站)。

1.2 材料

川楝素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111842-201102)，12批川楝子藥材購(gòu)于成都國(guó)際商貿(mào)城中藥材市場(chǎng)，經(jīng)四川省中藥飲片有限責(zé)任公司朱文俊主任中藥師鑒定為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的果實(shí)。色譜純乙腈；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件

2.1.1 HPLC-ELSD法 Agilent Eclipse XDS-C18色譜柱(150 mm×4.6mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.01%甲酸溶液(3l∶69)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器漂移管溫度：95 ℃，氣體流速：2.8 L·min-1。

2.1.2 HPLC-MS法 InertSustainTMC18色譜柱(50 mm×2.1 mm，2 μm)，流動(dòng)相：乙腈-0.01%甲酸溶液(31∶69)，流速：0.35 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣體積：1 μL，分析時(shí)間：8 min。離子源為ESI正離子模式，離子源電壓：4.5 kV，霧化氣為氮?dú)?3 L·min-1)，干燥氣為氮?dú)?15 L·min-1)，檢測(cè)器電壓為2.04 kV，掃描模式為SIM(選擇離子監(jiān)測(cè)模式，m/z573)，駐留時(shí)間為20 ms，脫溶劑管溫度為200 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取川楝素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.89 mg川楝素的溶液，供HPLC-ELSD法測(cè)定用；同時(shí)吸取1 mL置500 mL容量瓶，加甲醇定容后得到3.78 μg·mL-1的溶液，供HPLC-MS法測(cè)定用。

2.3 供試品溶液的制備

取本品中粉約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流 1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，供HPLC-ELSD法測(cè)定。同時(shí)吸取1 mL續(xù)濾液置10 mL容量瓶中，加甲醇定容后供HPLC-MS法測(cè)定。

2.4 HPLC-ELSD法方法學(xué)考察與結(jié)果

2.4.1 系統(tǒng)適用性考察 對(duì)比《中國(guó)藥典》2010年版一部“川楝子”項(xiàng)下所規(guī)定的HPLC-MS法測(cè)定川楝素含量，本實(shí)驗(yàn)新確立的HPLC-ELSD分析系統(tǒng)，采用川楝素對(duì)照品按2.1項(xiàng)優(yōu)化條件對(duì)川楝子中色譜峰進(jìn)行了指認(rèn)。結(jié)果表明，川楝素存在互變異構(gòu)色譜峰；在該分析條件下，兩互變異構(gòu)體之間分離度大于1.5，完全滿足分析要求，HPLC-ELSD色譜圖見圖1，HPLC-MS色譜圖見圖2。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)數(shù)值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量對(duì)數(shù)值X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=5.634 3X-0.024 0，r=0.999 6。結(jié)果表明川楝素進(jìn)樣量在3.78～47.25 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取1.89 mg·mL-1川楝素對(duì)照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得川楝素峰面積積分值的常用對(duì)數(shù)值的RSD=1.15%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一份川楝素樣品約2.5 g，按照2.3項(xiàng)下方法提取，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h分別測(cè)定1次，其峰面積的RSD=1.38%，表明在24 h內(nèi)川楝素穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 同時(shí)精密稱定6份川楝素樣品，每份2.5 g，分別按照2.3項(xiàng)下方法提取，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果樣品中川楝素平均含量是0.10%，RSD=2.01%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知川楝素含量的川楝子樣品(川楝素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.080%)9份，各約1.25 g，精密稱定，分別精密加入一定量的川楝素對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。

表1 川楝子中川楝素加樣回收率試驗(yàn)(n=9)

2.5 樣品測(cè)定

取12批川楝子樣品，3次重復(fù)，按照2.3項(xiàng)下方法提取，并按照2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定并計(jì)算川楝素含量。HPLC-ELSD色譜圖見圖1，HPLC-MS色譜圖見圖2，測(cè)定結(jié)果見表2。

注：A.川楝素對(duì)照品；B.川楝子供試品(四川雅安)。圖1 川楝子及對(duì)照品HPLC-ELSD圖

注：A.川楝素對(duì)照品；B.川楝子供試品(四川雅安)。圖2 川楝子SIM掃描色譜圖(ESI-)

表2 不同產(chǎn)地川楝子中川楝素的測(cè)定(%)

根據(jù)表2可知，采用本文所建立的HPLC-ELSD法測(cè)定不同產(chǎn)地川楝子中川楝素含量，對(duì)比HPLC-MS法的測(cè)定結(jié)果，其誤差百分比(APE)范圍為0～3.16%，平均絕對(duì)百分比誤差(MAPE)為1.70%，證明本研究所確立的HPLC-ELSD法代替HPLC-MS法測(cè)定川楝子中川楝素含量的方法可行。

進(jìn)一步對(duì)比12批川楝子中川楝素含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的川楝子中川楝素含量波動(dòng)較大。依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版一部對(duì)于川楝子中川楝素應(yīng)為0.060%～0.20%的要求，本次測(cè)定的樣品中，來自云南楚雄、思茅的川楝子含量低于要求，不能入藥；而來自四川中江、雅安以及涼山的川楝子中川楝素含量均超過限量要求，不能直接入藥，必須經(jīng)過炮制處理將川楝素降低到規(guī)定范圍方可使用。

3 討論

3.1 方法適用性分析

由于川楝素紫外特征吸收為208 nm，接近末端吸收，若采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，容易受提取物中其他雜質(zhì)干擾，且紫外檢測(cè)器在低波長(zhǎng)時(shí)基線容易產(chǎn)生漂移，因此采用HPLC-UV法進(jìn)行川楝素含量測(cè)定的結(jié)果往往不夠準(zhǔn)確。采用本實(shí)驗(yàn)的HPLC-ELSD法進(jìn)行分析，相比于《中國(guó)藥典》2010年版一部“川楝子”項(xiàng)下所規(guī)定的HPLC-MS法，本法同樣具有簡(jiǎn)便快速、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，并且相對(duì)于質(zhì)譜儀，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，適用于各科研、企業(yè)單位的配備。

3.2 川楝子資源開發(fā)

根據(jù)《中國(guó)藥材產(chǎn)地生態(tài)適宜性區(qū)劃》一書介紹，編者根據(jù)川楝子生態(tài)適宜性數(shù)值分析結(jié)果，并結(jié)合其生物學(xué)特性，并考慮自然條件、社會(huì)經(jīng)濟(jì)條件、藥材主產(chǎn)地栽培和采收加工技術(shù)，建議選擇引種栽培區(qū)域主要以四川、云南、貴州、湖南、湖北一帶為宜[10]，本研究再次驗(yàn)證了四川產(chǎn)川楝子的質(zhì)量較好的說法。但是川楝素具有一定的毒性，攝入過量可對(duì)胃腸道產(chǎn)生刺激作用，并且對(duì)肝臟有損害，所以《中國(guó)藥典》2010年版限定其含量不得過0.20%。本研究中，來自四川中江、雅安以及涼山的川楝子中川楝素含量均超過相關(guān)限量要求，所以不能直接作為飲片“川楝子”入藥。有文獻(xiàn)報(bào)道通過炮制可以適當(dāng)降低川楝素的含量[6]，因此，應(yīng)通過諸如“清炒法”(《中國(guó)藥典》2015年版通則0213)等相關(guān)炮制手段而使其飲片符合要求，從而達(dá)到充分利用川楝子資源的目的。

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DeterminationofToosendanininFructusToosendanbyHPLC-ELSD

MENGJie1，ZHUWenjun1，WANGLijun1*，HUANGGuojie1，NINGHe1，WENYongsheng2

(1.SichuanTraditionalChineseMedicineDecoctionPiecesco.，LTD.，Chengdu611730，China；2.Chengdufoodanddruginspectioninstitute，Chengdu610000，China)

Objective：To establish a new HPLC-ELSD method for determination of toosendanin in Fructus Toosendan comparing with HPLC-MS method.Methods：For HPLC-ELSD，an Agilent Eclipse XDS-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)was applied，the mobile phase consisted of methyl cyanide-0.01% methane acid(3l∶69)，the flow rate was 1.0 mL·min-1；the column temperature was 30 ℃；the drift tube temperature of ELSD was set at 95.0 ℃，and the flow rate of air was 2.8 L·min-1.At the same time，F(xiàn)or HPLC-MS，a SHIMADZU LCMS-8040 was used for the verification of the new method，A InertSustainTMC18(50 mm×2.1 mm，2 μm)was applied，conditions according to the “Chinese Pharmacopoeia” in 2010 edition of “high performance liquid chromatography-mass spectrometry method”(Annex VI D and an appendix J)，12 batches of Fructus Toosendan were determined.Results：Under the conditions of HPLC-ELSD，we found that as for toosendanin，the linear detection range was 3.78-47.25 μg(r=0.999 1)，the average recovery was 99.43% and the relative standard deviation was 1.44%(n=9).And the results of the two quantification methods were identical.Conclusion：A HPLC-ELSD method for determination of toosendanin in Fructus Toosendan was established for the first time，and the method conforms to the method validation requirements，can be used for determination and analysis of toosendanin in Fructus Toosendan.

HPLC；ELSD；MS；Fructus Toosendan；toosendanin

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.011

2015-09-25)

*

王禮均，主管中藥師，研究方向：中藥炮制；E-mail：13060049032@163.com