HPLC法同時測定左歸飲提取物中馬錢苷和5-羥甲基糠醛的含量

盧春雪，楊紹杰，陶薈竹，黃樹明，楊書彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

·中藥工業(yè)·

HPLC法同時測定左歸飲提取物中馬錢苷和5-羥甲基糠醛的含量

盧春雪，楊紹杰，陶薈竹，黃樹明*，楊書彬*

(黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：測定左歸飲中馬錢苷和5-羥甲基糠醛2種化學成分的含量。方法：采用高相液相色譜法，以C18柱為色譜柱，流動相為乙腈-水，梯度洗脫；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為250 nm。結(jié)果：左歸飲中的馬錢苷和5-羥甲基糠醛分別在0.51～4.08 μg(r=0.999 8)、0.26～2.04 μg(r=0.999 8)與峰面積呈良好線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為101.24%(RSD=1.40%)和99.72%(RSD=1.10%)。結(jié)論：該法準確可靠、重復性好，可作為同時測定左歸飲中馬錢苷和5-羥甲基糠醛含量的測定方法。

左歸飲；高效液相色譜法；馬錢苷；5-羥甲基糠醛；含量測定

左歸飲出自《景岳全書·新方八陣》卷五十一方，是由熟地、山茱萸、枸杞、山藥、炙甘草、茯苓6味中藥組成的復方，具有滋腎、養(yǎng)肝、益脾的功能。方中重用熟地，甘溫滋腎以填真陰；輔以山茱萸、枸杞子養(yǎng)肝血，合主藥以加強滋腎陰而養(yǎng)肝血之效；佐以茯苓、炙甘草益氣健脾；山藥益陰健脾滋腎，是用于補益腎陰、治療真陰不足之癥的經(jīng)典名方[1]?，F(xiàn)代研究證實，該方在治療腎陰虛型更年期綜合征[2]及抗炎、抗衰老[3]等方面有顯著療效，但對于左歸飲有效成分及質(zhì)量控制研究報道較少。研究表明，左歸飲君藥熟地中的多糖和5-羥甲基糠醛(5-H)等是其藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[4]，《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定，采用高效液相色譜法測定山茱萸中的指標性化學成分馬錢苷的含量[5]，以其作為山茱萸質(zhì)量控制指標。近代研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸中的馬錢苷能夠抗炎，增強免疫，同時可使衰老大鼠紅細胞(RBC)中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量得到恢復[6]，起到抗氧化損傷作用。由于中藥復方的有效成分復雜，單一指標對質(zhì)量控制不夠合理。因此，本研究采用HPLC法建立了同時測定左歸飲中馬錢苷和5-H兩種指標性成分含量的方法，為左歸飲的質(zhì)量控制與評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695 Separation Module HPLC；Waters 2996 PAD紫外檢測器；Millennium32色譜工作站、ME155DU電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

馬錢苷對照品(中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-14090413，純度99.58%)；5-羥甲基糠醛(南京森貝伽生物科技有限公司，批號：67-47-0，純度98%)；乙腈(色譜純)；甲醇(天津市天力化學試劑有限公司，分析純)；水為哇哈哈純凈水。

熟地、山茱萸、枸杞、山藥、炙甘草、茯苓6味藥材均購自安國市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學楊書彬副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；EasyGurd C18(10 mm×4.0 mm)Kit保護柱；流動相：乙腈-水線性梯度，見表1；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長為250 nm；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃。

表1 流動相梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品混合溶液的制備 精密秤取馬錢苷和5-H對照品適量，采用甲醇配制成每1 mL含馬錢苷0.408 mg、5-H 0.204 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 據(jù)《景岳全書》中左歸飲原方的記載，藥材按熟地∶山茱萸∶枸杞∶山藥∶茯苓∶炙甘草=9∶5∶6∶6∶4∶3的比例，加10倍量蒸餾水先文火燒至水沸騰，后用武火煎煮40 min。紗布過濾，藥渣加8倍量蒸餾水先文火后武火沸騰20 min，合并濾液，濃縮后冷凍干燥得凍干粉(出粉率為39.72%)備用。精密秤取左歸飲凍干粉0.5 g，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲提取40 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，5000 r·min-1離心，取上清液，以0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 參照左歸飲處方工藝過程制備缺山茱萸或熟地的陰性樣品，按2.2.2項下的供試品制備方法處理，制成缺山茱萸或熟地的陰性樣品溶液。

2.3 專屬性試驗

將對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液按2.1項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。在與馬錢苷和5-羥甲基糠醛對照品相應(yīng)的保留時間處沒有色譜峰，說明陰性對照溶液無干擾，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

將2.2.1項下的混合對照品溶液按梯度稀釋成不同濃度，馬錢苷質(zhì)量濃度分別為：0.051、0.102、0.204、0.306、0.408 mg·mL-1；5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度分別為：0.026、0.051、0.102、0.153、0.204 mg·mL-1，各對照品經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后，按2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，以濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，對其進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 按2.2項下方法分別制備混合對照品溶液和供試品溶液，在2.1項下色譜條件下連續(xù)進樣6次。供試品溶液中馬錢苷和5-H峰面積的RSD分別為0.39%和0.28%，混合對照品溶液中馬錢苷和5-H峰面積的RSD分別為0.48%和0.24%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取同一批樣品，照2.2.2項下方法制備6份供試品溶液，進行含量測定。馬錢苷和5-H的平均含量分別為0.246%和0.212%，RSD分別為0.73%和0.49%，表明測定方法的重復性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12、16、24 h進樣測定，結(jié)果馬錢苷和5-H峰面積的RSD分別為0.53%和0.77%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：A.混合對照品；B.左歸飲供試品；C.缺山茱萸陰性對照；D.缺熟地陰性對照；1.5-羥甲基糠醛；2.馬錢苷。圖1 混合對照品與左歸飲供試品溶液主成分的HPLC圖

2.5.4 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的同一批次供試品(含馬錢苷0.246%、5-H 0.212%)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入用甲醇配制的混合對照品溶液(每1 mL含馬錢苷0.408 mg、5-H 0.204 mg)15 mL，甲醇定容至25 mL，按2.1項下色譜條件進行測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表2 線性關(guān)系試驗結(jié)果

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.6 樣品含量測定

參照左歸飲處方工藝過程制備3批次樣品適量，分別按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 檢測波長的選擇

為保證各指標成分的測定有較高靈敏度，根據(jù)檢測器上得到的紫外吸收光譜圖輔助成分定性和選擇各被測組分的檢測波長，馬錢苷和5-H在250 nm處都有較大吸收，故選擇檢測波長分別為250 nm。

3.2 流動相的選擇

試驗考察了甲醇-水、乙腈-水溶液為流動相的兩種洗脫系統(tǒng)，與甲醇相比，相同柱溫下乙腈擴散系數(shù)小，峰寬較小，分離度R更高，所以以乙腈-水為流動相時，色譜圖基線穩(wěn)定、峰形較好，并且在本研究所采用的梯度下分離效果最好。

3.3 提取條件的選擇

試驗中比較了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果表明，提取效率相同時，超聲提取所用時間較少，且提取操作簡單，因此選擇超聲提??；提取溶劑考察不同濃度甲醇提取效果，結(jié)果100%甲醇提取雜質(zhì)峰較少，被測成分峰面積較大，因此選擇100%甲醇提??；比較了超聲提取20、30、40、50、60 min的提取效率，結(jié)果提取40、50、60 min各被測成分的提取量基本相等，因此選擇提取時間40 min。

3.4 小結(jié)

左歸飲是治療腎陰虛癥的經(jīng)典方劑，在近年來的臨床實驗研究中，其在治療更年期綜合征、抗衰老、改善圍經(jīng)期卵巢功能[8-9]方面受到醫(yī)生和患者的廣泛認可。左歸飲中水溶性成分包括多糖、馬錢苷、5-羥甲基糠醛、梓醇等。本研究建立了左歸飲中馬錢苷和5-H兩種主要成分的綜合測定方法，儀器精密度、指標性成分穩(wěn)定性及方法的重復性和加樣回收率等均良好。因此采用本試驗方法可為準確對左歸飲進行質(zhì)量控制提供參考，同時也為左歸飲中有效成分的繼續(xù)研究提供依據(jù)。

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[2] 黃劍英，李曉萍.左歸飲合二至丸加減聯(lián)合西藥治療腎陰虛型更年期綜合征臨床觀察[J].新中醫(yī)，2015，6(47)：162-163.

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DeterminationofLoganinand5-hydroxymethylFurfuralinZuoguiDrinkbyHPLC

LUChunxue，YANGShaojie，TAOHuizhu，HUANGShuming*，YANGShubin*

(HeilongjianguniversityofChinesemedicinecollegeofpharmacy.Harbin，Heilongjiang150040，China)

Objective：To determine the content of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.Methods：HPLC was performed on C18column using acetonitrile-water as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 250nm.The column temperature was 30 ℃.Results：Loganin and 5-hydroxymethyl furfural showed good linearity in the concentration range of 0.51～4.04 μg (r=0.999 8) and 0.26～2.04 μg(r=0.999 8)，respectively.And their average recovery rates were 101.24% (RSD=1.40%) and 99.72%(RSD=1.10%)，respectively.Conclusion：The method is simple and accurate with good reproducibility.It can be used for the determination of loganin and 5-hydroxymethyl furfural in Zuogui Drink.

Zuogui Drink.；HPLC；loganin；5-hydroxymethyl furfural；content determination

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.025

2015-11-06)

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楊書彬，副教授，研究方向：中藥質(zhì)量評價及活性研究；Tel:(0451)87266807,E-mail:shubinyang0451@163.com 黃樹明，教授，研究方向：中醫(yī)藥防治神經(jīng)退行性疾病的作用及機制研究；Tel:(0451)87266872，E-mail:huangshuming1958@163.com