奶粉中阪崎克羅諾桿菌耐干燥性與MLST分型的研究

高建欣，杜欣軍，李萍，王碩

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071）

阪崎克羅諾桿菌是一種條件性食源致病菌，其感染已經(jīng)被認(rèn)為是最常見的危及生命的病例，可以導(dǎo)致嬰兒腦膜炎、敗血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎和系統(tǒng)性膿毒疾等疾病[1]。很多報(bào)道指出，嬰兒配方奶粉（powdered infant formula，PIF）是阪崎克羅諾桿菌的主要來源和載體[2-3]。因此，許多國家對于PIF 中這種病原體的監(jiān)測越來越重視。在PIF 生產(chǎn)過程中，前期的巴氏消毒法能夠滅活所有的阪崎克羅諾桿菌，但加入的配料不能用于巴氏消毒，加入被污染的配料可能導(dǎo)致該菌在成品奶粉中出現(xiàn)，另外加工設(shè)備不經(jīng)滅菌處理，也可能是導(dǎo)致嬰兒配方奶粉污染的重要原因[4]。在2010年和2012年，Li 等[5]對中國陜西省12 個城市的705 種零售牛奶嬰幼兒食品樣品中的阪崎克羅諾桿菌流行情況進(jìn)行了調(diào)查，其中19 種樣品阪崎腸桿菌為陽性，感染率為16.9%。這為阪崎克羅諾桿菌廣泛的發(fā)病率提供了新的流行病學(xué)證據(jù)，說明消費(fèi)者存在非常大的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)。阪崎克羅諾桿主要導(dǎo)致早產(chǎn)兒或嬰幼兒患病[6]，對其他年齡階段的人也有致病性，特別是免疫力低下的成年人或老人[7]。但阪崎克羅諾桿菌是如何開始感染宿主細(xì)胞的目前仍不清楚[8-9]。阪崎克羅諾桿菌具有一些重要的與毒力或應(yīng)激生存相關(guān)的因子，其中最重要的是耐干燥和滲透壓能力相關(guān)的因子，使其能夠在各種不利環(huán)境條件下持續(xù)生存[10]，在嬰兒配方奶粉中長時(shí)間存活的能力是阪崎克羅諾桿菌致病機(jī)制比較根本的特性[11]。這種強(qiáng)大的生存能力，以及感染嬰兒后高達(dá)80%的死亡率，也是使阪崎克羅諾桿菌作為新興的胃腸道病原體得到廣泛的關(guān)注的重要原因[12]。本研究通過干燥試驗(yàn)篩選出了耐干燥能力較強(qiáng)和較弱的阪崎克羅諾桿菌菌株，并通過多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）對所有菌株的分子流行特征進(jìn)行研究，以期獲得阪崎克羅諾桿菌耐干燥性與MLST 分型之間的關(guān)系，為進(jìn)一步開展奶粉的安全控制、阪崎克羅諾桿菌的分子流行病學(xué)研究以及防控耐干燥菌株的暴發(fā)流行提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

35 株阪崎克羅諾桿菌分離株均為天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種，如表1所示。本試驗(yàn)所用到的菌株，已經(jīng)過16s rRNA 基因測序與生理生化鑒定，確定為克羅諾桿菌屬中的阪崎克羅諾桿菌。所有菌株用甘油溶液保存于-80 ℃冰箱。

表1 本研究中用到的阪崎克羅諾桿菌菌株Table 1 C.sakazakii Strains used in this study

1.2 儀器設(shè)備和試劑

HVA-85 全自動壓力蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama；5418R 臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；TProfes sional Thermal Cycler PCR 儀：美國 Biometra 公司；Gel Doc 2000 凝膠成像儀：美國Bio-Rad 公司；Sunrise Basic 酶標(biāo)儀：Tecan，Austria；DYY-6C 電泳儀：北京六一儀器廠；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板：韓國SPL Life Sciences 公司。細(xì)菌DNA 提取試劑盒：北京天根生物有限公司；膠回收試劑盒、DNA 提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；蛋白胨、酵母浸取物：Oxoid 公司；NaCl：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Agar Power：北京索萊寶科技有限公司；所需引物均由金唯智生物有限公司合成。

1.3 耐干燥能力強(qiáng)阪崎克羅諾桿菌菌株的篩選

將實(shí)驗(yàn)室保存的35 株阪崎克羅諾桿菌，在LB（luria-bertani，LB）固體培養(yǎng)基上三區(qū)劃線，37 ℃培養(yǎng)12 h～18 h，挑取單克隆菌落，轉(zhuǎn)接至含有1 mL LB 液體培養(yǎng)基的96 深孔板中，37 ℃，200 r/min 過夜培養(yǎng)。然后，以1 ∶100 的體積比將菌液轉(zhuǎn)接至新的96 深孔板中，于 37 ℃，200 r/min 培養(yǎng) 2 h～3 h，用紫外分光光度計(jì)測其OD600值，并通過稀釋將所有菌株的OD600值達(dá)到0.6 左右。吸取10 μL 菌液于96 細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個菌株重復(fù)3 次。后將96 細(xì)胞培養(yǎng)板置于滅菌的干燥器中（內(nèi)有500 g 脫水硅膠）。最后，把置有96 細(xì)胞培養(yǎng)板的干燥器放于培養(yǎng)箱中，45 ℃培養(yǎng)3 h，待菌液完全干燥后將培養(yǎng)箱溫度調(diào)至25 ℃，繼續(xù)干燥6 d。期間，分別在干燥第1 天、第6 天時(shí)各取出1 個96 細(xì)胞培養(yǎng)板，吸取100 μL LB 液體培養(yǎng)基于每孔中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng) 3 h，測取 OD600值。

1.4 阪崎克羅諾桿菌的MLST分型

1.4.1 阪崎克羅諾桿菌DNA 的提取

利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒對實(shí)驗(yàn)室保存的阪崎克羅諾桿菌菌株的基因組DNA 進(jìn)行提取，試驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 阪崎克羅諾桿菌管家基因的擴(kuò)增及測序

結(jié)合參考文獻(xiàn)[13]和MLST 數(shù)據(jù)庫的資料，選取阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894 的7 個管家基因作為目的基因：atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB 和 pps，分別編碼ATP 合成酶β-亞基、伸長系數(shù)、谷氨酰-tRNA 合成酶、谷氨酸合酶大亞基、DNA 促旋酶B、翻譯起始因子IF-2 和磷酸烯醇式丙酮酸合酶?；蛭稽c(diǎn)和引物名稱、序列及其片段大小見表2。

表2 阪崎克羅諾桿菌中7 個管家基因擴(kuò)增和測序引物Table 2 Oligonucleotide primer sequences for the amplification and sequencing of the seven loci from genes in C.sakazakii

7 個管家基因所用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系經(jīng)優(yōu)化后，最終確定為 25 μL擴(kuò)增體系。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 2 min，94 ℃變性 30 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸，總共 30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)，目標(biāo)條帶大小參照DNA Marker 指示，條帶單一且明亮，則可進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增產(chǎn)物純化及測序分析。

PCR 產(chǎn)物的測序工作委托金唯智生物有限公司完成。使用測序引物對目的片段的DNA 序列進(jìn)行雙向測序，產(chǎn)物由3730xl DNA Analyzer 進(jìn)行分析。

1.4.3 阪崎克羅諾桿菌管家基因的序列編輯及分型

將所得的阪崎克羅諾桿菌7 個管家基因序列進(jìn)行拼接，并提交MLST 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，每個菌株可以得到相對應(yīng)的各個等位基因的序列號，7 個管家基因的等位基因序列編號組合即為該菌株的ST 型。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制

將所有菌株的7 個等位基因序列按一定順序串聯(lián)起來，使用Mega 6.0 對序列進(jìn)行比對，并采用Neighbour-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 阪崎克羅諾桿菌耐干燥性比較

本試驗(yàn)對35 株阪崎克羅諾桿菌進(jìn)行了干燥試驗(yàn)，試圖篩選出其中抗干燥能力較強(qiáng)的菌株，見圖1。

圖1 阪崎克羅諾桿菌干燥6 d 的失活率Fig.1 The inactivation rate of Cronobacter sakazakii after drying for 6 days

結(jié)果表明 1 號（IQCC10409）、6 號（IQCC 10455）和31 號（110609-3）菌株在第6 天表現(xiàn)出較其他菌株更強(qiáng)的抗干燥能力（如圖1），經(jīng)過6 d 處理失活率分別為63.73%、56.94%和 44.43%。而2 號（IQCC10410）、11號（ENS6309-4）和 17 號（ATCC 12868）菌株在第 6 天表現(xiàn)出較其他菌株較弱的抗干燥能力，經(jīng)過6 d 處理失活率分別為91.54%、96.06%和96.75%。因此，31號菌株耐干燥能力最強(qiáng)。

2.2 阪崎克羅諾桿菌的MLST分型

將35 株阪崎克羅諾桿菌菌株進(jìn)行MLST 分型，一共得到了16 個不同的ST 型，如表3所示。

表3 阪崎克羅諾桿菌分離株MLST 分型結(jié)果Table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

其中，屬于 ST1 型（20、24、27、28、33）和 ST4 型（4、6、7、9、11）的菌株較多，分別有 5 株菌，各占總菌株的14.3%；屬于ST73 型和ST199 型分別有3 株，占總菌株的8.6%；屬于ST8 型有2 株，占總菌株的5.7%；此外，還包含 ST23、ST136、ST266、ST13、ST40、ST60、ST240、ST373、ST223、ST442、ST282 型以及 6 株未能在數(shù)據(jù)庫中找到的新ST 型。

續(xù)表3 阪崎克羅諾桿菌分離株MLST 分型結(jié)果Continue table 3 MLST result of C.sakazakii isolates

耐干燥能力較強(qiáng)的1號（IQCC10409）、6 號（IQCC10455）、和31 號（110609-3）菌株分別屬于ST73、ST73 和 ST23 型，而耐干燥能力較弱的 2 號（IQCC10410）、11 號 （ENS6309-4） 和 17 號（ATCC 12868）菌株分別屬于ST1、ST8 和ST282 型。結(jié)合耐干燥能力與MLST 分型可知，阪崎克羅諾桿菌基因多樣性程度較高，其中，ST73 型耐干燥能力較強(qiáng)。另外，將試驗(yàn)所用35 株菌的耐干燥能力進(jìn)行排序，其中耐干燥性較強(qiáng)的菌株中ST4 型有5 株，ST73 型有2 株；耐干燥性較弱的菌株中ST1 型有5 株，ST199 型有3 株。說明ST4 型菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)耐干燥能力，而ST1 型耐干燥能力較弱。另外，通過比較不同菌株的耐干燥能力，發(fā)現(xiàn)即使相同ST 型的菌株，其耐干燥能力也不同，說明不同的阪崎克羅諾菌株間存在較強(qiáng)的個體差異性。

2.3 MLST分型與耐干燥的相關(guān)性

利用Mega 6.0 軟件分析阪崎克羅諾桿菌菌株MLST 分型數(shù)據(jù)所得到的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

圖2反映了菌株之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可以直觀地表現(xiàn)出分型與耐干燥之間的聯(lián)系。通過分析某些特定的ST 型和相關(guān)耐干燥模式之間的聯(lián)系，MLST 可能成為追溯阪崎克羅諾桿菌耐干燥菌株來源的有力工具，本研究中所涉及阪崎克羅諾桿菌菌株呈現(xiàn)出較高的基因多樣性，不同來源的阪崎克羅諾桿菌分屬于較為廣泛的ST 型中。

3 討論

阪崎克羅諾桿菌具有多種致病因子，能引起危及生命的疾病、嚴(yán)重的慢性后遺癥或是長時(shí)間的疾病。很多報(bào)道指出，PIF 是克羅桿菌屬的主要來源和載體[14-15]。因此，許多國家對于PIF 中這種病原體的監(jiān)測已經(jīng)越來越多重視。此外，阪崎克羅諾桿菌是一種抗干燥能力較強(qiáng)的菌種，能在奶粉中長期存活，其易在奶粉復(fù)水時(shí)大量繁殖。因此，研究阪崎克羅諾桿菌的分型與其耐干燥性的關(guān)系非常重要。本研究中，Cronobacter sakazakii IQCC10409、Cronobacter sakazakii IQCC10455 和 Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株的抗干燥能力較強(qiáng)（如圖1），其中Cronobacter sakazakii 110609-3 菌株耐干燥能力最強(qiáng)，屬于ST23 型，而Cronobacter sakazakii IQCC10409 和 Cronobacter sakazakii IQCC10455 也表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐干燥能力，它們都屬于ST73 型，這說明ST73 型屬于耐干燥能力較強(qiáng)的MLST 型。另外，對試驗(yàn)所用35 株菌的耐干燥能力進(jìn)行排序，耐干燥性較強(qiáng)的菌株主要集中于ST4型。Fei Peng 等[16]研究表明ST4 型耐干燥能力較強(qiáng)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這可能解釋ST4 型阪崎克羅諾桿菌是從嬰兒配方奶粉中分離出來的常見基因型的主要原因之一。以上的研究不僅有助于更好地了解阪崎克羅諾桿菌的在食品環(huán)境中的存活性，還有助于為分子流行病學(xué)調(diào)查以及預(yù)防和控制該菌的流行提供支持。

圖2 阪崎克羅諾桿菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of C.sakazakii isolates