玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響Δ

楊　勝，張仲林，袁明勇，鄭玲利，李　燕，廖昌軍

（1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都　610083；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，成都　610500）

玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響Δ

楊勝1＊，張仲林1，袁明勇2#，鄭玲利2，李燕2，廖昌軍1

（1.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都610083；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，成都610500）

目的：考察玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛證模型大鼠免疫功能的影響。方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組［人參北芪片0.6 g（生藥）/kg］和玉屏風(fēng)散高、中、低劑量組［24、12、6 g（生藥）/kg］，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用二氧化硫+風(fēng)寒綜合刺激法復(fù)制肺氣虛證模型。造模成功后，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥液，正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)13 d。給藥結(jié)束后，測(cè)定大鼠血清中白細(xì)胞介素（IL）-3、IL-6水平及T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+比例，觀察肺、支氣管組織病理變化。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-3、IL-6水平及T淋巴細(xì)胞中CD8+比例明顯升高，T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值降低（P＜0.01）；肺、支氣管明顯損傷并伴有炎癥反應(yīng)。與模型組比較，陽性組和玉屏風(fēng)散高劑量組大鼠血清中IL-3水平明顯降低；陽性組和玉屏風(fēng)散高、中劑量組大鼠血清中IL-6水平、T淋巴細(xì)胞中CD8+比例明顯降低，T淋巴細(xì)胞中CD3+比例明顯升高；各給藥組大鼠血清中CD4+比例、CD4+/CD8+比值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；肺、支氣管損傷及炎癥反應(yīng)程度減輕。結(jié)論：玉屏風(fēng)散可增強(qiáng)肺氣虛證模型大鼠的免疫功能。

玉屏風(fēng)散；肺氣虛證；免疫功能；T淋巴細(xì)胞；大鼠

玉屏風(fēng)散出自朱丹溪的《丹溪心法》，具有益氣、固表、止汗之功效，主要用于治療氣虛自汗、易感風(fēng)寒的中醫(yī)肺氣虛證，多用于反復(fù)呼吸道感染、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等多種慢性肺系疾病。研究顯示，肺氣虛時(shí)常伴有免疫功能降低或紊亂的現(xiàn)象，且隨病情的加重免疫功能異常更為明顯［1］。據(jù)報(bào)道，玉屏風(fēng)散具有提高機(jī)體自身免疫力的功效［2］，但系統(tǒng)研究其對(duì)肺氣虛證大鼠系列免疫細(xì)胞因子及肺、支氣管組織病理改變的報(bào)道相對(duì)較少。本課題組前期研究了玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛證大鼠血清免疫球蛋白E、脾淋巴細(xì)胞增殖活性、腹腔巨噬細(xì)胞活性、脾自然殺傷（NK）細(xì)胞殺傷活性的影響［3］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過復(fù)制中醫(yī)肺氣虛大鼠模型，進(jìn)一步研究其對(duì)肺氣虛證大鼠白細(xì)胞介素（IL）-3、IL-6和T淋巴細(xì)胞增殖及對(duì)肺、支氣管組織病理的影響。

1　材料

1.1儀器

Power Wave XS2酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；KDC-40低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；FACS-Calibur流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；CX21BIM-SET6生物顯微鏡（美國Olympus公司）。

1.2藥品與試劑

人參北芪片（黑龍江鼎恒升藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120713，規(guī)格：0.3 g/片）；IL-3酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：wti31512i）；IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)：wti61512i）；CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞ELISA檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，批號(hào)：wtc31512c、wtc41512c、wtc81512c）。

1.3藥材

黃芪、炒白術(shù)、防風(fēng)（四川新荷花中藥飲片股份有限公司，批號(hào)：1507063、1510052、1506022），經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院生藥教研室李羿教授鑒定均為合格藥材。

1.4動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD大鼠60只，♀♂各半，體質(zhì)量250～280 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供［動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（川）2013-24號(hào)］。

2　方法

2.1玉屏風(fēng)散藥液制備

按2015版《中國藥典》（一部）［4］玉屏風(fēng)口服液處方配比及文獻(xiàn)方法［5］，稱取黃芪約180 g、炒白術(shù)約60 g、防風(fēng)約60 g。將防風(fēng)剪碎，提取揮發(fā)油；將剩余藥渣與黃芪、白術(shù)一起加8倍量水浸泡30 min，煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1 h，合并煎液，濾過，收集濾液。用70%乙醇使藥渣沉淀，取上清液，減壓回收乙醇，加水?dāng)噭?，靜置。取上清液濾過，液濾于70～80℃水浴中濃縮為每1 ml藥液相當(dāng)于2 g生藥量的浸膏，再加入防風(fēng)揮發(fā)油，混勻，4℃保存，備用。

2.2動(dòng)物分組、給藥與造模

將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽性組和玉屏風(fēng)散高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均采用二氧化硫+風(fēng)寒綜合刺激法［6］復(fù)制肺氣虛證模型；造模期間大鼠正常飲食。造模成功后，陽性組大鼠ig人參北芪片藥液0.6 g（生藥）/kg（人臨床給藥劑量的10倍劑量），玉屏風(fēng)散各劑量組大鼠分別ig玉屏風(fēng)散藥液24、12、6 g（生藥）/kg（分別為人臨床用量的50、25、12.5倍劑量），正常組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥13 d；給藥期間各組大鼠正常飲食。

2.3指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于大鼠股動(dòng)脈取血，將血液于4℃靜置過夜，以離心半徑為16 cm、3 000 r/min離心10 min，收集血清。采用ELISA法檢測(cè)血清中IL-3、IL-6含量，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。于眼眶靜脈取血，分離血清，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+和CD8+比例。取血完成后，脫頸椎處死大鼠，分離肺、支氣管組織，于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)洗滌、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察大鼠肺、支氣管病理變化。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-3、IL-6含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和玉屏風(fēng)散高劑量組大鼠血清中IL-3、IL-6含量顯著減少，玉屏風(fēng)散中劑量組大鼠血清中IL-6含量顯著減少（P＜0.01）。各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測(cè)結(jié)果表1。

3.2各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均顯著降低，CD8+比例顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性組及玉屏風(fēng)散高、中劑量組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均顯著升高，CD8+比例顯著降低（P＜0.01）；玉屏風(fēng)散低劑量組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD4+比例顯著升高，CD4+/CD8+比值顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測(cè)結(jié)果見表2。

表1　各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Content results of IL-3 and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n=10）

表1　各組大鼠血清中IL-3、IL-6含量檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10）Tab 1　Content results of IL-3 and IL-6 in serum of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.01

IL-6，ng/ml 107.4±9.77 165.9±10.77＊110.3±11.41#123.9±5.53#131.6±14.71#161.1±8.51組別正常組模型組陽性組玉屏風(fēng)散高劑量組玉屏風(fēng)散中劑量組玉屏風(fēng)散低劑量組劑量，g/kg 0.6 24 12 6 IL-3，pg/ml 108.1±6.93 158.2±11.62＊116.3±14.91#145.7±12.68#152.9±13.11 153.9±10.67

表2　各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10）Tab 2　Proportions results of CD3+，CD4+and CD8+in T lymphocyte of peripheral blood in rats in each group（±s，n=10）

表2　各組大鼠外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+比例檢測(cè)結(jié)果（±s，n=10）Tab 2　Proportions results of CD3+，CD4+and CD8+in T lymphocyte of peripheral blood in rats in each group（±s，n=10）

注：與正常組比較，＊P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.normal group，＊P＜0.01；vs.model group，#P＜0.05，##P＜0.01

5.1±0.94 1.1±0.14＊4.4±0.43##2.9±0.37##2.4±0.35##1.6±0.23#組別正常組模型組陽性組玉屏風(fēng)散高劑量組玉屏風(fēng)散中劑量組玉屏風(fēng)散低劑量組劑量，g/kg CD3+，%CD4+/CD8+0.6 24 12 6 70.9±5.29 51.3±2.12＊68.7±4.59##65.3±3.93##63.8±2.75##53.3±2.15 CD4+，% 66.0±6.88 24.1±3.66＊59.7±3.98##41.2±4.20##36.7±3.49##33.1±4.06##CD8+，% 13.1±1.23 22.5±1.67＊13.6±1.44##14.5±1.00##15.5±2.54##21.4±2.19

3.3各組大鼠肺、支氣管組織病理觀察結(jié)果

3.3.1肺組織病理觀察結(jié)果正常組大鼠肺泡間隔連續(xù)、無纖維組織增生，肺泡腔內(nèi)無分泌物及炎性滲出、間質(zhì)小血管無擴(kuò)張；模型組大鼠肺泡組織輕度擴(kuò)張，部分肺泡間隔斷裂、纖維組織增生、管腔縮小，肺泡腔內(nèi)見少量滲出物及紅細(xì)胞，肺間質(zhì)內(nèi)小血管明顯充血（淤血）、可見較多炎性細(xì)胞浸潤；陽性組大鼠肺泡未見擴(kuò)張，肺泡間隔無增厚、無斷裂，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張充血，無炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散低劑量組大鼠肺泡中度擴(kuò)張，肺泡間隔稍增厚、偶見斷裂，間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，有炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散中劑量組大鼠肺泡輕度擴(kuò)張，部分肺泡間隔稍增厚、偶見斷裂，間質(zhì)有少許血管擴(kuò)張充血、少量炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散高劑量組大鼠肺泡間隔偶見斷裂，無纖維組織增生、紅細(xì)胞及炎性滲出，間質(zhì)小血管不擴(kuò)張，散在少數(shù)淋巴細(xì)胞。各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果見圖1。

3.3.2支氣管組織病理觀察結(jié)果正常組大鼠支氣管管腔無擴(kuò)張、腔內(nèi)無分滲出物，黏膜上皮完整、纖毛不倒伏，黏膜上皮下間質(zhì)無水腫、散在少數(shù)淋巴細(xì)胞；模型組大鼠支氣管黏膜上皮不連續(xù)，見大量脫失、斷裂，支氣管腔內(nèi)可見較多滲出物、管壁小血管輕度擴(kuò)張充血，黏膜上皮下間質(zhì)明顯水腫，其間可見較多炎性細(xì)胞浸潤；陽性組大鼠支氣管管腔無擴(kuò)張、纖毛規(guī)則、管腔內(nèi)無滲出、管壁間質(zhì)小血管無充血、無炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散低劑量組大鼠支氣管管腔擴(kuò)張、纖毛粘連倒伏，管腔內(nèi)見滲出，管壁間質(zhì)小血管中度充血、有炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散中劑量組大鼠支氣管管腔擴(kuò)張、纖毛粘連倒伏，管腔內(nèi)見少量滲出，管壁間質(zhì)小血管輕度充血、有部分炎性細(xì)胞浸潤；玉屏風(fēng)散高劑量組大鼠支氣管管腔無明顯擴(kuò)張，支氣管黏膜柱狀上皮完整，纖毛粘連倒伏，見少許滲出，管壁散在少數(shù)淋巴細(xì)胞。各組大鼠支氣管組織HE染色結(jié)果見圖2。

4　討論

圖1　各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果（×200）Fig 1　HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

圖2　各組大鼠支氣管組織HE染色結(jié)果（×200）Fig 2　HE staining of bronchus tissue of rats in each group（× 200）

由T淋巴細(xì)胞分泌合成的IL-3對(duì)肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等的增殖、分化具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，可使嗜酸性粒細(xì)胞向呼吸道炎癥區(qū)浸潤，從而使血管內(nèi)皮發(fā)生炎性反應(yīng)，刺激支氣管，最終導(dǎo)致哮喘等疾病的發(fā)生。研究表明，支原體肺炎伴喘息患兒血液中IL-3含量顯著增加，而后逐漸出現(xiàn)哮喘癥狀；而由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放的IL-6是構(gòu)成COPD氣道炎癥的重要炎癥因子，其能促進(jìn)、加速局部炎癥的發(fā)生發(fā)展，最終導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的重塑和氣道阻塞的形成［7-8］。在COPD患者肺組織中存在明顯的氣道重塑，表現(xiàn)為氣道平滑肌組織增生，氣道壁纖維化，炎癥細(xì)胞在氣道、肺血管、肺實(shí)質(zhì)的浸潤等。本研究復(fù)制的肺氣虛大鼠的肺、支氣管病理改變與文獻(xiàn)報(bào)道一致，說明本研究復(fù)制的肺氣虛癥大鼠模型是成功的。在急性加重期COPD患者血清、痰液中IL-6含量明顯高于緩解期［9-11］，患者體內(nèi)IL-3、IL-6含量與患者病情輕重具有相關(guān)性，且與患者預(yù)后也有一定的聯(lián)系，同時(shí)對(duì)藥物治療有明顯的指導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散能顯著降低肺氣虛大鼠外周血中IL-3、IL-6含量（P＜0.01），進(jìn)而抑制嗜酸性粒細(xì)胞的活化和減少嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，最終改善氣道阻塞形成的氣虛癥狀。人參北芪片具有扶正固本、補(bǔ)氣升陽、補(bǔ)虛生津的功用，用于肢體倦怠、神疲乏力、多夢(mèng)健忘等癥，對(duì)肺氣虛證有明確的治療作用［3］，故在本研究中以此為陽性藥物。

通過監(jiān)測(cè)外周血中T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+比例，可以判斷機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，對(duì)臨床疾病的發(fā)病機(jī)制的探討及預(yù)后判斷具有重要意義。據(jù)文獻(xiàn)［12-13］報(bào)道，慢性支氣管炎大鼠外周血中淋巴細(xì)胞增多，以CD8+為主；同時(shí)CD8+活化浸潤與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)和小氣道炎癥損傷浸出相關(guān)。CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值降低越明顯，提示患者的免疫功能越紊亂，機(jī)體抵抗力下降。姜素麗等［14］報(bào)道，具有益肺健脾等功效的中藥能顯著改善COPD穩(wěn)定期患者細(xì)胞免疫功能。玉屏風(fēng)散可通過刺激未成熟的粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分化成熟，提高機(jī)體的免疫功能［15］。方中炒白術(shù)健脾，白術(shù)多糖對(duì)氫化可的松導(dǎo)致免疫抵制小鼠的脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯的恢復(fù)作用［16］；防風(fēng)走表，驅(qū)散風(fēng)邪，防風(fēng)多糖能明顯增加體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞釋放IL-1和IL-8［17］；防風(fēng)和黃芪共同使免疫功能降低并趨向正常，而當(dāng)機(jī)體免疫功能偏低時(shí)，黃芪則能使之增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，肺氣虛證大鼠經(jīng)玉屏風(fēng)散治療后，外周血T淋巴細(xì)胞中的CD3+、CD4+比例及CD4+/CD8+比值均明顯升高，CD8+比例明顯降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），說明玉屏風(fēng)散有直接或間接升高肺氣虛大鼠外周血中CD3+、CD4+比例和CD4+/CD8+比值及降低CD8+比例的功能，從而發(fā)揮對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，玉屏風(fēng)散對(duì)肺氣虛證大鼠肺、支氣管損傷具有一定的保護(hù)作用，可能是通過調(diào)節(jié)大鼠免疫功能實(shí)現(xiàn)的。本研究為后續(xù)分析玉屏風(fēng)散調(diào)節(jié)免疫功能化學(xué)成分及探討發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的具體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編輯：林靜）

Effects of Yupingfeng Powder on Immune Function of Rats with Lung-qi Deficiency Syndrome

YANG Sheng1，ZHANG Zhonglin1，YUAN Mingyong2，ZHENG Lingli2，LI Yan2，LIAO Changjun1
（1.School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China；2.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Yupingfeng powder on immune function of rats with lung-qi deficiency syndrome.METHODS：60 SD rats were randomly divided into normal group，model group，positive group［Renshen beiqi tablet 0.6 g （crude drug）/kg］and Yupingfeng powder high-dose，medium-dose and low-dose groups［24，12，6 g（crude drug）/kg］，with 10 rats in each group.Except for normal group，those groups were given SO2+comprehensive cold stimulation to induce lung-qi deficiency syndrome model.After modeling，treatment groups were given relevant drug solutions intragastrically，and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically，once a day，for consecutive 13 d.After administration，serum levels of IL-3 and IL-6，the proportion of CD3+，CD4+，CD8+in T lymphocyte were determined，and pathological changes of lung and bronchus were observed.RESULTS：Compared with normal group，serum levels of IL-3 and IL-6 and the proportion of CD8+in T lymphocyte increased significantly in model group，while the proportions of CD3+and CD4+in T lymphocyte and the ratio of CD4+/CD8+decreased（P＜0.01）；obvious lung and bronchus injury and inflammatory reaction were observed.Compared with model group，serum level of IL-3 decreased significantly in positive group and Yupingfeng powder high-dose group；serum level of IL-6 and the proportion of CD8+in T lymphocyte decreased significantly in positive group and Yupingfeng powder highdose and medium-dose groups，while the proportion of CD3+in T lymphocyte increased significantly；the proportion of CD4+and the ratio of CD4+/CD8+increased significantly in treatment groups（P＜0.05 or P＜0.01）；lung and bronchial injury，and inflammation reaction were relieved.CONCLUSIONS：Yupingfeng powder can enhance immune function of rats with lung-qi deficiency syndrome.

Yupingfeng powder；Lung-qi deficiency；Immune function；T lymphocyte；Rats

R285

A

1001-0408（2016）22-3041-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.06

四川省科技廳立項(xiàng)科研課題（No.2012JY0035）；四川省衛(wèi)生廳立項(xiàng)科研課題（No.130391）

＊講師，碩士。研究方向：中藥藥理學(xué)。電話：028-62308610。E-mail：1310832723@qq.com

副主任藥師，碩士。研究方向：中藥藥理學(xué)、臨床藥學(xué)、藥事管理。電話：028-83016983。E-mail：yuanmingyong226@163.com

2016-03-21

2016-05-16）