多指標(biāo)綜合評分-正交試驗(yàn)法優(yōu)化參芪益氣膠囊的水提工藝

牛曉靜，張　輝，劉曉龍，張文鑫，段曉穎#

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州　450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州　450000）

多指標(biāo)綜合評分-正交試驗(yàn)法優(yōu)化參芪益氣膠囊的水提工藝

牛曉靜1＊，張輝1，劉曉龍2，張文鑫1，段曉穎1#

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450000）

目的：優(yōu)化參芪益氣膠囊的水提工藝。方法：以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素提取率等為指標(biāo)進(jìn)行綜合評分，以加水倍數(shù)、煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化參芪益氣膠囊中藥材的水提工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為加8倍量水煎煮3次，每次2 h；驗(yàn)證試驗(yàn)中3批樣品提取后的綜合評分分別為98.95、99.71、99.98 （RSD＜2%，n=3）。結(jié)論：采用多指標(biāo)綜合評分-正交試驗(yàn)法優(yōu)化的參芪益氣膠囊的水提工藝穩(wěn)定、科學(xué)、合理。

參芪益氣膠囊；提取工藝；正交試驗(yàn)；多指標(biāo)綜合評分

參芪益氣膠囊由人參、黃芪、山茱萸、太子參、蜜款冬花、淫羊藿、矮地茶等12味中藥組成，為河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（以下簡稱我院）臨床常用驗(yàn)方，已應(yīng)用多年，具有補(bǔ)肺益氣、化痰、活血的功效，可減輕炎癥反應(yīng)、黏液分泌及氣道阻塞，提高免疫功能等，是中醫(yī)治療慢性阻塞性肺疾?。–OPD）穩(wěn)定期肺腎氣虛證的有效藥物［1］。方中君藥為黃芪，主要活性成分為黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷等三萜皂苷、黃酮類成分；淫羊藿、矮地茶為佐藥，主要活性成分分別為淫羊藿苷、巖白菜素等黃酮、苯醌類成分。為有效提取出該方藥材的有效成分，增強(qiáng)臨床療效，筆者對方中藥材進(jìn)行了提取工藝的優(yōu)化。

1　材料

1.1儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀、2424型蒸發(fā)光散射檢測器（美國Waters公司）；CP225D型電子天平（德國Satorious公司）。

1.2藥材、藥品與試劑

黃芪、太子參、蜜款冬花、淫羊藿、矮地茶等藥材均購自河南中一醫(yī)藥經(jīng)營有限公司（批號(hào)：120113、130209、130124、121008、120910），經(jīng)我院陳天朝主任藥師鑒定為真品；黃芪甲苷、淫羊藿苷、巖白菜素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110781-200613、110737-200415、111532-200202，純度分別為：93.0%、供含量測定用、94.4%）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：201001，純度：98.8%）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，水為高純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1黃芪甲苷的含量測定[2]

2.1.1色譜條件色譜柱為Agilent-ZORBAX Eclispe XDBC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（32∶68），流速為1 ml/min；柱溫為30℃；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為80℃，霧化溫度為60%，載氣壓力為30 psi。

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成21.74 mg/L對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.3供試品溶液的制備精密吸取正交試驗(yàn)各提取液50.0 ml，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 ml，合并正丁醇提取液；用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液；正丁醇液用正丁醇飽和的水充分洗滌2次，每次40 ml，棄去水液；正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，并用甲醇洗滌蒸發(fā)皿，溶液和洗滌液一并轉(zhuǎn)入5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

2.1.4陰性對照溶液的制備按處方比例分別稱取除黃芪以外的其余藥味，按提取工藝制成缺黃芪的陰性樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

2.1.5線性關(guān)系考察分別精密吸取黃芪甲苷對照品溶液4、8、12、16、20 μl，進(jìn)樣測定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度的常用對數(shù)為橫坐標(biāo)（x）、峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，回歸方程為y=1.441x+5.415 4（r=0.999 4），表明黃芪甲苷的檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.086 96～0.434 8 mg/ml。

2.1.6方法學(xué)考察取經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）濾過后的對照品溶液（10 μl）、供試品溶液（正交試驗(yàn)3號(hào)樣品，20 μl）和陰性對照溶液（20 μl），分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明陰性對照無干擾。按相關(guān)方法操作，精密度試驗(yàn)RSD=0.85%（n=6）、重復(fù)性試驗(yàn)RSD=1.25%（n=6）；定量限為30 ng/ml；加樣回收率試驗(yàn)中平均回收率為98.79%（RSD=1.32%，n=6）。黃芪甲苷色譜圖見圖1。

圖1　黃芪甲苷高效液相色譜圖A.黃芪甲苷對照品溶液；B.供試品溶液；C.缺黃芪陰性對照溶液Fig 1　HPLC chromatogram of astragalosideA.astragaloside control solution；B.test sample solution；C.negative control withoutAstragalus membranaceus

2.2毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素的含量測定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（分別測定） 色譜柱均為Agilent-ZORBAX Eclispe XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器均為紫外檢測器，柱溫均為30℃，流速均為1 ml/min。（1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜條件：流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0→30 min，10%→30%A；30→32 min，30%→100%A）；檢測波長為260 nm。理論板數(shù)按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)不低于3 000。（2）淫羊藿苷色譜條件：流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0→17 min，24%A；17→18 min，24%→60%A；18→22 min，60%A；22→30 min，60%→24% A）；檢測波長為270 nm。理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)不低于1 500。（3）巖白菜素色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-水（15∶85）；檢測波長為275 nm。理論板數(shù)按巖白菜素計(jì)不低于1 500。

2.2.2對照品溶液的制備分別精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素對照品適量，分別加甲醇溶解并定容，搖勻，即得20.36、18.76、56.1 mg/L的對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備分別精密吸取正交各提取液20、10 ml，轉(zhuǎn)入25 ml量瓶中，加入適量甲醇稀釋并定容，搖勻，離心（4 000 r/min，離心半徑12 cm）15 min，取上層清液，分別得供試品溶液a、b。

2.2.4陰性對照溶液的制備按處方比例分別稱取除黃芪、淫羊藿、矮地茶以外的其余藥味，按一定工藝條件分別制成缺黃芪、淫羊藿、矮地茶的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法分別制備陰性對照溶液。

2.2.5線性關(guān)系考察分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷對照品溶液各2、4、8、12、16、20 μl，巖白菜素對照品溶液1、2、5、10、15 μl，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，并計(jì)算回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），得回歸方程分別為：毛蕊異黃酮葡萄糖苷y=4.89×106x-1.49×103（r=0.999 9），淫羊藿苷y=3× 106x-14 675（r=0.999 9），巖白菜素y=6.59×106x-4.06×103（r=0.999 9）；三者線性范圍分別為0.040 72～0.407 2、0.037 52～0.375 2、0.056 1～0.841 5 mg/ml。

2.2.6方法學(xué)考察分別取經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）濾過后的對照品溶液（10 μl）、供試品正交試驗(yàn)3號(hào)樣品溶液a、b（a、b號(hào)各20、5 μl，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和淫羊藿苷采用a號(hào)，巖白菜素采用b號(hào)）和陰性對照溶液（20 μl），分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果表明陰性對照均無干擾。按相關(guān)方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素精密度試驗(yàn)的RSD分別為0.89%、0.65%、0.47%（n=6），重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為1.25%、0.98%、1.03%（n=6）；定量限分別為23、15、13 ng/ml；加樣回收率試驗(yàn)的平均回收率分別為98.99%、101.38%、101.11%（RSD分別為1.13%、1.32%、0.98%，n=6）。三者色譜圖見圖2。

圖2　毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素高效液相色譜圖A、B、C.缺黃芪、淫羊藿、矮地茶陰性對照溶液；D、E、F.供試品a、a、b溶液；G、H、I.對照品溶液；1.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；2.淫羊藿苷；3.巖白菜素Fig 2　HPLC chromatogram of calyosin-7-O-β-D-glycoside，icariin and bergeninA，B，C.negative control solution without A.membranaceus，Epimedium brevicornu，or Ardisia japonica；D，E，F(xiàn).test sample solution a，a，b；G，H，I.substance control solution；1.calyosin-7-O-β-D-glycoside；2. icariin；3.bergenin

2.3提取工藝設(shè)計(jì)

依據(jù)前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)，確定參芪益氣處方的藥效部位為水溶性部分，因此設(shè)計(jì)提取溶劑為水。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)初步預(yù)試結(jié)果，確定加水倍數(shù)（A）、煎煮次數(shù)（B）、煎煮時(shí)間（C）為主要影響因素，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、巖白菜素提取率（提取率=有效成分的量/藥材稱量×100%）為評價(jià)指標(biāo)。因素與水平見表1。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

2.4權(quán)重系數(shù)及綜合評分公式的確定

采用層次分析法（AHP）進(jìn)行分析［3］，方中黃芪甘溫而補(bǔ)益肺脾之氣并固衛(wèi)，為方中君藥；淫羊藿、矮地茶為佐藥。在黃芪代表性成分黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷中，前者相對后者更重要，記前者2分；與淫羊藿和矮地茶代表性成分淫羊藿苷和巖白菜素比較，黃芪甲苷相對更重要，記5分；與淫羊藿苷和巖白菜素比較，毛蕊異黃酮葡萄糖苷相對更重要，記3分；淫羊藿苷與巖白菜素相對重要性相同，均記1分；其余以此類推。采用AHP計(jì)算最終確定黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷和巖白菜素的權(quán)重系數(shù)分別為0.518 2、0.283 8、0.099 02、0.099 02，經(jīng)一致性檢驗(yàn)結(jié)果得一致性比率（CR）＜0.1，表明權(quán)重系數(shù)合理、有效。

綜合評分=黃芪甲苷提取率評分+毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率評分+淫羊藿苷提取率評分+巖白菜素提取率評分。黃芪甲苷提取率評分=（黃芪甲苷提取率/黃芪甲苷提取率最大值）×100×0.518 2；毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率評分=（毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率/毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率最大值）× 100×0.283 8；淫羊藿苷提取率評分=（淫羊藿苷提取率/淫羊藿苷提取率最大值）×100×0.099 02；巖白菜素提取率評分=（巖白菜素提取率/巖白菜素提取率最大值）×100×0.099 02。

2.5正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

按處方比例稱取各藥味，共計(jì)180 g，共9份，按正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)，藥材加適量水、煎煮一定時(shí)間和次數(shù)后，過濾，合并提取液。分別收集提取液，作為供試品母液，依法測定。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2　The orthogonal test results

表3　方差分析結(jié)果Tab 3　Results of variance analysis

由直觀分析可知，各因素對綜合評分的影響順序?yàn)锽＞C＞A。方差分析結(jié)果表明，因素B具有顯著性影響，因素A、C無顯著性影響。最終確定最優(yōu)工藝為A1B3C3，即加8倍量水煎煮3次，每次2 h。根據(jù)最優(yōu)工藝進(jìn)行提取，驗(yàn)證試驗(yàn)中3批樣品提取后4種指標(biāo)成分提取率的RSD均小于2%（n=3），表明提取工藝穩(wěn)定，詳見表4。

表4　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 4　Results of verification test

3　討論

3.1多指標(biāo)綜合評分法

本試驗(yàn)采用多指標(biāo)綜合評分法，其可將試驗(yàn)過程中多方面的變化予以綜合考慮，并采用適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)處理方法使各變化結(jié)果具有加和性，從而可全面監(jiān)測試驗(yàn)過程。相對單指標(biāo)而言，多指標(biāo)綜合評價(jià)可使優(yōu)化的工藝代表性更強(qiáng)，能更全面地反映試驗(yàn)結(jié)果［4-5］。在采用多指標(biāo)的正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)，首先要解決指標(biāo)間量綱不一致和指標(biāo)間的矛盾問題，然后針對指標(biāo)間的重要性差異確定各指標(biāo)權(quán)重，綜合評分后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。AHP采用系統(tǒng)分析的方法，根據(jù)評價(jià)目的所確定的總評價(jià)目標(biāo)，對評價(jià)對象進(jìn)行連續(xù)性分解，得到各級(jí)（或各層）評價(jià)目標(biāo)，并以最下層作為衡量目標(biāo)達(dá)到程度的評價(jià)指標(biāo)，然后依據(jù)這些指標(biāo)計(jì)算出綜合評分指數(shù)，以其大小來確定評價(jià)對象的優(yōu)劣等級(jí)［3］。

3.2色譜條件的篩選

在確定淫羊藿苷的色譜條件篩選試驗(yàn)中，筆者曾參照文獻(xiàn)［6-8］方法及《中國藥典》方法［2］進(jìn)行試驗(yàn)。但由于本研究的樣品成分較復(fù)雜，各試驗(yàn)條件下分離效果均不好，淫羊藿苷分離度差，不能達(dá)到基線分離。最后綜合各試驗(yàn)方法，最終確定了本文所述的色譜條件，結(jié)果表明能較好地將淫羊藿苷分離。

3.3淫羊藿苷的提取率

在試驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷的提取率超過100%（藥材含量為0.3%），懷疑是由于淫羊藿中其他黃酮類成分如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ等，可能在煎煮過程中相互轉(zhuǎn)化所致；但查閱文獻(xiàn)［8］發(fā)現(xiàn)有研究證明淫羊藿苷的生成量并不等同于朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 3種黃酮苷類成分的減少量，由此說明淫羊藿苷并不是全部從其他3種黃酮苷類轉(zhuǎn)化而來，而是淫羊藿中多成分共同參與的復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程。至于具體是哪種成分轉(zhuǎn)化而來，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

3.4有效成分指標(biāo)的確定

在控制含黃芪類樣品的質(zhì)量時(shí)，目前多以黃芪甲苷含量為指標(biāo)。本試驗(yàn)中則增加了黃芪中黃酮類成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為指標(biāo)。因現(xiàn)代藥理研究證明黃芪中的黃酮類成分具有調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突變、清除自由基等多種藥理作用［9-12］，因此，增加黃酮類成分的含量為指標(biāo)能更全面地反映復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

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（編輯：劉萍）

Optimization of Water Extraction Technology for Shenqi Yiqi Capsules with Multi-index Comprehensive Score-orthogonal Test

NIU Xiaojing1，ZHANG Hui1，LIU Xiaolong2，ZHANG Wenxin1，DUAN Xiaoying1
（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China；2.College of Pharmacy，Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China）

OBJECTIVE：To optimize water extraction technology of Shenqi yiqi capsules.METHODS：The water extraction technology of Shenqi yiqi capsules was optimized by L9（34）orthogonal test with amount of water added，decoction times and decoction time as factors using the extraction rate of astragaloside，calyosin-7-O-β-D-glycoside，icariin and bergenin as index，and the verification test was made.RESULTS：The best extraction technology was as follows as 8-fold water，decocting for 3 times，2 h each time；comprehensive score of 3 batches of samples in validation test were 98.95，99.71 and 99.98（RSD＜2%，n=3）.CONCLUSIONS：The water extraction technology optimized by multi-index comprehensive score-orthogonal test is stable，scientific and reasonable.

Shenqi yiqi capsules；Extraction technology；Orthogonal test；Multi-index comprehensive score

R285.2

A

1001-0408（2016）22-3139-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.34

＊主管藥師，碩士。研究方向：中藥新藥、質(zhì)量控制。電話：0371-66233639。E-mail：niuxiaojing314@163.com

主任藥師，碩士生導(dǎo)師，碩士。研究方向：中藥新技術(shù)、新劑型。E-mail：dxy137@sina.com

2015-12-09

2016-03-01）