星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化五味子多糖的酶提工藝

張楠楠，朱志軍，蔣亞超，鄧　浩，高　松，李瑩麗

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州　450008）

星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化五味子多糖的酶提工藝

張楠楠＊，朱志軍#，蔣亞超，鄧浩，高松，李瑩麗

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450008）

目的：優(yōu)化五味子多糖的酶提工藝。方法：采用星點設(shè)計-響應(yīng)面法，以溶液pH、酶用量、提取溫度為響應(yīng)因子，以五味子多糖的提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用3因素5水平星點設(shè)計進(jìn)行試驗；同時進(jìn)行驗證試驗。結(jié)果：優(yōu)化的最佳提取工藝條件為酶提溶液pH 5.7、酶用量1.3%、提取溫度53℃；驗證試驗中五味子多糖的提取率為14.30%（RSD=1.84%，n=6）。結(jié)論：優(yōu)化的提取工藝簡便、合理、穩(wěn)定，可用于五味子多糖的提取。

五味子多糖；酶法提??；星點設(shè)計-響應(yīng)面法

五味子，習(xí)稱北五味子，為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實［1］。五味子多糖是從五味子中提煉出來的混合物，其藥理作用主要體現(xiàn)在保護(hù)肝臟［2］、增強(qiáng)免疫［3］、抗腫瘤［4］、抗疲勞［5］、抗超敏反應(yīng)［6］等方面。五味子多糖的提取方法主要有溶劑提取法、微波提取法、超聲提取法、酶提取法等［7］。本研究是課題組關(guān)于生脈散劑型轉(zhuǎn)化的前期研究，因此，五味子多糖后續(xù)純化不僅要求工藝方便快捷，還要避免提取過程中的損失，以為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供條件。目前，工業(yè)化生產(chǎn)中五味子多糖的提取方法普遍采用水提法，但是水提法提取率相對較低，且耗費時間和能源［7-9］，例如孟憲軍等［8］采用水提法得到五味子多糖的提取率僅為（10.99±0.33）%。因此，本研究擬采用其他提取方法輔助水提法提取多糖。研究顯示，超聲提取過程中多糖易分解［7］、微波提取能否提高多糖提取率仍存在爭議［10］，且這2種方法在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中使用不方便。酶法提取具有條件溫和、提取率高［11］、后續(xù)步驟易處理、可用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點，故筆者采用目前常用的響應(yīng)面法對酶提取法提取五味子多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化［12］，以為五味子多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

1.1儀器

T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；SHA-C型水浴振蕩器（鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司）；5439R型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf股份公司）；UPH系列超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2藥品與試劑

無水乙醇、95%乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉（天津登科化學(xué)試劑科技有限公司）；重蒸酚（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，編號：NEP039）；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：20140324，純度：≥98%）；纖維素酶（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：20140721，活力：50 U/mg）；五味子（安徽易元堂中藥飲片科技有限公司，批號：130303），經(jīng)過河南中醫(yī)學(xué)院董誠明教授鑒定為北五味子的干燥成熟果實。

2　方法與結(jié)果

2.1五味子多糖的含量測定

2.1.1供試品溶液的制備精密稱取5 g過三號篩的五味子粉末于500 ml錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶（纖維素酶的用量以藥材質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)表示），再加入料液比為1∶15、一定pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，在一定溫度的水浴振蕩器中（100 r/min）提取0.5 h。錐形瓶取出后在水浴鍋中滅酶20 min，離心（3 500 r/min，離心半徑為7.5 cm，下同）10 min除去藥渣。提取液在水浴鍋上濃縮至20 ml，置于室溫（25℃）后加入95%乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置過夜。取沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌3次，離心5 min得到粗多糖沉淀并揮去溶劑。將得到的粗多糖定容至100 ml量瓶中，再取1 ml定容至100 ml量瓶中，用于多糖含量測定。多糖提取率（%）=多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對照品10.33 mg，加蒸餾水定容至10 ml量瓶中，制成質(zhì)量濃度為1.033 mg/ml的對照品溶液。精密量取對照品溶液0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 ml分別置于10 ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，得到不同質(zhì)量濃度的對照品溶液。各取1 ml置于具塞試管中（空白組采用蒸餾水），再加入用蒸餾水配制5%的重蒸酚溶液1 ml，搖勻，迅速加入5 ml濃硫酸，搖勻，40℃恒溫水浴30 min。取出后冰水浴5 min，并于490 nm波長處測吸光度。以無水葡萄糖質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，無水葡萄糖的回歸方程為y=0.008 7x（r= 0.999 1），表明其在10.33～82.64 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，可用于多糖提取率的分析。

2.1.3精密度試驗精密量取“2.1.2”項下對照品溶液1 ml，按照“2.1.2”項下方法重復(fù)測定5次。結(jié)果，對照品溶液吸光度的RSD=0.239 4%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗精密稱取五味子粉末5 g，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.2”項下方法分別于0、0.5、1.0、1.5 h時測定吸光度值。結(jié)果，供試品溶液吸光度的RSD= 1.173 9%（n=4），表明供試品溶液在1.5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性試驗按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液6份，按照“2.1.2”項下方法測定吸光度值。結(jié)果，供試品溶液吸光度的RSD=0.439 0%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收試驗精密稱取已知含量的五味子粉末5 g，共6份，精密加入質(zhì)量濃度為82.64 μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 ml，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.2”項下方法測定吸光度值，計算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.16%，RSD=1.374 6%（n=6），表明本方法準(zhǔn)確度較好。

2.2單因素考察

2.2.1溶液pH的考察精密稱取過三號篩的五味子粉末5 g，共6份，分別加入纖維素酶1%，加入料液比為1∶15，pH為3.7、4.3、4.9、5.5、6.1、6.7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液于錐形瓶中，置于50℃恒溫水浴振蕩器中（100 r/min）0.5 h，按照“2.1.2”項下方法測定多糖含量，計算提取率。結(jié)果，多糖的提取率分別為3.62%、3.91%、5.80%、7.03%、5.29%、5.07%，pH 為5.5時提取率最高，故選擇pH為5.5作為星點設(shè)計的節(jié)點。

2.2.2纖維素酶用量的考察精密稱取過三號篩的五味子粉末5 g，共6份，分別加入纖維素酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，加入料液比為1∶15，pH為5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液于錐形瓶中，置于50℃恒溫水浴振蕩器中（100 r/ min）0.5 h，按照“2.1.2”項下方法測定多糖含量，計算提取率。結(jié)果，多糖的提取率分別為4.92%、8.21%、10.11%、10.15%、10.16%、10.15%，隨酶用量增加而增加，但酶用量超過1.5%時增幅不明顯。故選擇1.75%作為星點設(shè)計的節(jié)點。

2.2.3提取溫度的考察精密稱取過三號篩的五味子粉末5 g，共6份，分別加纖維素酶1%，加入料液比為1∶15，pH為5.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液于錐形瓶中，置于溫度為45、50、55、60、65、70℃的恒溫水浴振蕩器中（100 r/min）0.5 h，按照“2.1.2”項下方法測定多糖含量，計算提取率。結(jié)果，多糖的提取率分別為6.60%、6.90%、7.51%、7.47%、7.23%、6.09%，隨提取溫度的升高而增加，但55℃和60℃差別不太明顯，超過60℃提取率開始下降。故選擇57.5℃作為星點設(shè)計的節(jié)點。

2.3響應(yīng)面設(shè)計

應(yīng)用Minitab 15軟件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應(yīng)面法星點設(shè)計，以溶液pH（A）、酶用量（B）、提取溫度（C）3個因素為響應(yīng)因子，以五味子多糖提取率（%）為響應(yīng)值進(jìn)行試驗安排。設(shè)計因素與水平見表1。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

2.4模型建立與方差分析

星點設(shè)計試驗安排與結(jié)果見表2，多糖提取率的估計回歸系數(shù)見表3，方差結(jié)果分析見表4。

表2　星點設(shè)計試驗結(jié)果Tab 2　Results of central composition design

表3　多糖提取率的估計回歸系數(shù)Tab 3　Estimated regression coefficient of extraction rate of polysaccharide

由表3可知，A、C、A2、AC對提取效果的曲面效應(yīng)極其顯著（P＜0.01），C2對提取效果的曲面效應(yīng)顯著（P＜0.05），其他項不顯著。由表4可知，回歸項的P=0.000，表明應(yīng)該拒絕原假設(shè)，因此本模型總體來說是有效的；失擬項對應(yīng)的P值為0.077＞0.05，因此本模型中不存在失擬現(xiàn)象。多糖提取率的回歸方程為y=5.033 66+4.723 38A+1.552 65B-0.193 849C-0.959 252A2-0.248 449B2-0.005 574 15C2-0.481 158AB+ 0.129 609AC+0.034 851 4BC（R2=0.914 6），R2＞0.9，說明二次多項式擬合較好。

2.5響應(yīng)曲面圖與等高值線圖

根據(jù)擬合方程作效應(yīng)曲面圖和等高線圖，考察所擬合的效應(yīng)曲面形狀，分析各提取因素對多糖提取率的影響，結(jié)果詳見圖1、圖2、圖3。

表4　多糖提取率的方差分析Tab 4　Variance analysis for the extraction rate of polysaccharide

圖1　溶液pH和酶用量對多糖提取率影響的三維曲面圖和等高線圖Fig 1　Three-dimensional response surface plot and contour of the effect of solvent pH and enzyme dosage on the extraction rate

圖2　溶液pH和提取溫度對多糖提取率影響的三維曲面圖和等高線圖Fig 2　Three-dimensional response surface plot and contour of the effect of solvent pH and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharide

圖3　酶用量和提取溫度對多糖提取率影響的三維曲面圖和等高線圖Fig 3　Three-dimensional response surface plot and contour of the effect of enzyme dosage and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.6驗證試驗

采用Mintab 15軟件的效應(yīng)優(yōu)化器對試驗進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果為：溶液pH為5.7、酶用量為1.3%、提取溫度為53.3℃，多糖提取率的預(yù)測值為14.45%。在此條件下進(jìn)行驗證試驗，取五味子粉末100 g，共6份，按照“2.1.1”項下方法進(jìn)行試驗，結(jié)果多糖實際提取率平均為14.30%（RSD=1.84%，n=6），與模型預(yù)測值間的偏離率為1.04%，表明模型可靠。為了方便生產(chǎn)，溫度可設(shè)為53℃。

3　討論

五味子多糖酶法提取的文獻(xiàn)報道較少，驗證試驗表明五味子多糖實際提取率平均為14.30%，高于文獻(xiàn)報道的其他提取方法，如程振玉等［13］使用超聲波輔助酶法提取的五味子多糖提取率為10.54%。本研究為課題組生脈散劑型的轉(zhuǎn)化研究提供了數(shù)據(jù)支持，為酶法提取五味子多糖的工業(yè)化大生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

本試驗尚存在不足之處，例如在多糖提取之前未對藥材進(jìn)行熱水浸泡處理，可能會降低提取率。預(yù)試驗考察了纖維素酶和木瓜蛋白酶對多糖提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素酶的提取率高于木瓜蛋白酶。預(yù)試驗結(jié)果提示提取時間超過0.5 h后多糖的提取率有所下降，因此，在本研究中五味子多糖的提取時間為0.5 h；另外在多糖的沉淀過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇沉淀下來的多糖有時為絮團(tuán)狀，有時為稀泥狀，產(chǎn)生稀泥狀的原因可能是由于五味子藥材粉末沒有離心干凈或者是由于醇沉的溫度偏高所致，導(dǎo)致后續(xù)操作不便，因此在試驗時需特別注意。

本研究優(yōu)化的提取工藝簡便、合理、穩(wěn)定，可用于五味子多糖的提取，為后續(xù)生脈散的劑型轉(zhuǎn)化研究提供了基礎(chǔ)。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of Enzymatic Extraction Technology of Polysaccharides from Schisandra chinensis by Central Composite Design-response Surface Methodology

ZHANG Nannan，ZHU Zhijun，JIANG Yachao，DENG Hao，GAO Song，LI Yingli
（College of Pharmacy，Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

OBJECTIVE：To optimize enzymatic extraction technology of polysaccharide from Schisandra chinensis.METHODS：Using pH value of enzymatic extraction solution，the amount of enzyme，extraction temperature as response factor，S.chinensis polysaccharide as response value，on the basis of single-factor experiments，3-factor，5-level central composite experimental design was adopted for the experiment.Validation test was also conducted.RESULTS：The optimal extraction technology was as pH value of 5.7，enzyme dosage of 1.3%，extraction temperature of 53℃.In validation test，the extraction rate of S.chinensis polysaccharide was 14.30%（RSD=1.84%，n=6）.CONCLUSIONS：The optimized extraction technology is simple，reasonable and stable，and can be used for the extraction of polysaccharide from S.chinensis.

Schisandra chinensis polysaccharide；Enzymatic extraction technology；Central composite-response surface methodology

R284.2

A

1001-0408（2016）22-3142-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.35

＊碩士。研究方向：中藥新劑型、新技術(shù)與新藥研究。E-mail：865250821@qq.com

副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，碩士。研究方向：中藥新劑型、新技術(shù)與新藥研究。E-mail：zzjun63@126.com

2015-12-11

2016-06-12）