柏薏灌腸液的提取工藝研究

李　燕，趙利剛，王慧麗，鄭麗娜，闞淑月

（1.唐山市婦幼保健院藥劑科，河北唐山　063000；2.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山　063000）

柏薏灌腸液的提取工藝研究

李燕1＊，趙利剛2，王慧麗1，鄭麗娜1，闞淑月1

（1.唐山市婦幼保健院藥劑科，河北唐山063000；2.華北理工大學(xué)藥學(xué)院，河北唐山063000）

目的：優(yōu)化柏薏灌腸液的提取工藝。方法：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法。以鹽酸小檗堿、阿魏酸和干膏率的總評(píng)歸一值（OD）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察加水量和提取時(shí)間對(duì)提取工藝的影響；同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：最優(yōu)提取工藝為第1次加11倍水煎煮70 min，第2次加5倍水煎煮30 min。驗(yàn)證試驗(yàn)中第1次提取的OD值為0.940 0，與預(yù)測(cè)值偏差-2.07%；第2次提取的OD值為0.851 8，與預(yù)測(cè)值偏差-2.41%。結(jié)論：柏薏灌腸液的提取工藝合理可行，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

柏薏灌腸液；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；鹽酸小檗堿；阿魏酸；干膏率

柏薏灌腸液處方由黃柏、薏苡仁、蒲公英、紫花地丁、三棱、莪術(shù)、桃仁、紅花、路路通、益母草、車前子、牛膝等12味藥材組成，具有清熱利濕、消炎止痛之功效，治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型盆腔炎療效顯著。該方劑在唐山市婦幼保健院臨床應(yīng)用已有十余年，療效確切。但以往一直憑醫(yī)師、藥師經(jīng)驗(yàn)對(duì)處方中藥材進(jìn)行煎煮提取，缺乏系統(tǒng)性。為對(duì)提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，筆者采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法［1-3］，優(yōu)化了柏薏灌腸液的提取工藝。

1　材料

1.1儀器

高效液相色譜儀，配置LC-20AT泵、SPD-20A紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器、SL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、島津LC Solution色譜工作站（日本島津公司）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2藥品、試劑與藥材

鹽酸小糪堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212，純度：96.7%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-201313，純度：99.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇、三氯甲烷、磷酸、鹽酸、乙醚為分析純，均購(gòu)自天津四友公司；黃柏（批號(hào)：20140201）、薏苡仁（批號(hào)：20140401）、蒲公英（批號(hào)：20140101）、紫花地?。ㄅ?hào)：20140101）、三棱（批號(hào)：20140301）、莪術(shù)（批號(hào)：20140301）、桃仁（批號(hào)：20140201）、紅花（批號(hào)：20140401）、路路通（批號(hào)：20140401）、益母草（批號(hào)：20140301）、車前子（批號(hào)：20140201）、牛膝（批號(hào)：20140401）均購(gòu)自石家莊柏林藥材加工廠，經(jīng)我院藥材鑒別師鑒定均符合2010年版《中國(guó)藥典》（一部）各項(xiàng)下規(guī)定。

2　方法與結(jié)果

2.1提取液的制備

按照處方比例稱取藥材，加水煎煮得第1次提取液，濾過(guò)、濃縮、備用；第1次煎煮所得濾渣加水煎煮得第2次提取液，濾過(guò)、濃縮、備用。

2.2鹽酸小檗堿含量的測(cè)定[4]

2.2.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（40∶60，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品12.10 mg于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備分別精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的第1次、第2次提取液各20 ml，加濃氨溶液5 ml，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 ml；合并三氯甲烷提取液，過(guò)濾，蒸干濾液，殘?jiān)蛹状既芙庵?0 ml量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm針式濾器過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.4方法學(xué)考察根據(jù)相應(yīng)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果鹽酸小檗堿的回歸方程為y=1.435×104x-2.324×104（r=0.999 8），線性范圍為6.05～60.5 μg/ml；精密度試驗(yàn)中峰面積RSD=0.7% （n=9）；重復(fù)性試驗(yàn)中鹽酸小檗堿含量RSD=1.3%（n=6）；平均加樣回收率為98.3%，RSD=1.5%（n=6）；檢測(cè)限（信噪比為3時(shí)）為0.101 μg/ml，定量限（信噪比為10時(shí)）為0.336 μg/ml；鹽酸小檗堿與相鄰雜質(zhì)峰的分離度為2.01，表明該方法可用于柏薏灌腸液中鹽酸小檗堿的含量測(cè)定。

2.3阿魏酸含量的測(cè)定[5-6]

2.3.1色譜條件色譜柱：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對(duì)照品10.40 mg 于100 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液0.2、0.4、0.8、1.5、2.0 ml，置于10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。

2.3.3供試品溶液的制備精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的提取液50 ml，加濃鹽酸（37.5%）2.5 ml，用乙醚振搖提取3次，每次50 ml；合并乙醚提取液，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓ǖ?次提取液至10 ml量瓶中，第2次提取液至5 ml量瓶中）稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm針式濾器過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4方法學(xué)考察結(jié)果根據(jù)相應(yīng)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果阿魏酸的回歸方程為y=1.682×104x-2.632×104（r=0.999 4），線性范圍為6.05～60.5 μg/ml；精密度試驗(yàn)中峰面積RSD=0.9% （n=9）；重復(fù)性試驗(yàn)中阿魏酸含量RSD=1.7%（n=6）；平均加樣回收率為98.6%，RSD=1.8%（n=6）；檢測(cè)限（信噪比為3時(shí)）為0.125 μg/ml，定量限（信噪比為10時(shí)）為0.416 μg/ml；阿魏酸與相鄰雜質(zhì)峰的分離度為3.20，表明該方法可用于柏薏灌腸液中阿魏酸的含量測(cè)定。

2.4干膏率的測(cè)定

精密量取“2.1”項(xiàng)下制備的提取液20 ml，置于干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算干膏率（%）=干膏質(zhì)量/復(fù)方藥材質(zhì)量×100%。

2.5提取工藝優(yōu)化

2.5.1因素及水平考察根據(jù)處方中藥材特性，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，采用水煎提取法，影響提取工藝的主要因素有加水倍量（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)。其中提取次數(shù)為非連續(xù)變量，不適合回歸處理，故預(yù)先對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行單因素考察，結(jié)果以2次為佳。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定第1次和第2次提取的加水倍量和提取時(shí)間的水平，因素與水平見(jiàn)表1、表2。

表1　第1次提取的因素與水平Tab 1　Factors and levels of the first extraction

表2　第2次提取的因素與水平Tab 2　Factors and levels of the second extraction

2.5.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)法則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，按處方比例稱取藥材飲片（黃柏30 g、薏苡仁60 g、蒲公英60 g、紫花地丁60 g、三棱20 g、莪術(shù)20 g、桃仁20 g、紅花20 g、路路通20 g、益母草24 g、車前子24 g、牛膝20 g，相當(dāng)于1 000 ml制劑量），按照不同的加水倍量和提取時(shí)間進(jìn)行提取。第1次提取液濃縮至1 000 ml，濾過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定；第2次提取液濃縮至500 ml，濾過(guò)，進(jìn)樣測(cè)定。將鹽酸小檗堿和阿魏酸的含量及干膏得率的總評(píng)歸一值（OD）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。將鹽酸小檗堿含量、阿魏酸含量、干膏得率3個(gè)指標(biāo)用Hansan法進(jìn)行歸一化，每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的歸一值，公式為：di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）（di為各指標(biāo)的歸一值，Yi為各指標(biāo)的實(shí)測(cè)值，Ymin為各指標(biāo)中的最小值，Ymax為各指標(biāo)中的最大值）。再以各指標(biāo)歸一值求算幾何平均數(shù)，公式為：OD=（d1×d2…×dk）1/k（k為指標(biāo)數(shù)）［7-8］。試驗(yàn)安排與結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3　第1次提取的試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 3　Arrangement and results of the first extraction

表4　第2次提取的試驗(yàn)安排與結(jié)果Tab 4　Arrangement and results of the second extraction

2.5.3模型擬合及方差分析以O(shè)D值為因變量，使用Desgin Expert 8.0.6對(duì)2次提取的因素進(jìn)行二次式擬合，Y1和Y2分別為第1次和第2次提取的擬合方程的因變量。結(jié)果Y1=-2.925 91+ 0.575 60A+0.017 797B+1.827 05×10-4AB-0.025 886A2-1.436 18×10-4B2、Y2=-0.580 52+0.487 45A+7.705 23×10-3B+ 2.789 98×10-3AB-0.053 962A2-3.285 05×10-4B2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表5　第1次提取的方差分析Tab 5　Analysis of variance for the first extraction

由方差分析結(jié)果可知，第1次和第2次提取的回歸方程，模型項(xiàng)P均小于0.05，失擬項(xiàng)P均大于0.05，相關(guān)系數(shù)r1= 0.900 2，r2=0.908 6，說(shuō)明回歸方程擬合度良好，模型準(zhǔn)確度較好，可以用該模型對(duì)實(shí)際情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表6　第2次提取的方差分析Tab 6　Analysis of variance for the second extraction

2.5.4提取工藝條件的確定根據(jù)回歸方程，繪制相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，詳見(jiàn)圖1、圖2。通過(guò)Design Expert 8.0軟件分析，得到2次提取的OD值的最大值點(diǎn)。結(jié)果，第1次和第2次最佳的加水倍量和提取時(shí)間分別為11.36倍、69.16 min，5.41倍、34.71 min。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，確定2次提取的工藝參數(shù)分別為11倍、70 min和5倍、30 min。

圖1　第1次提取的三維響應(yīng)面圖Fig 1　3D response surface of the first extraction

圖2　第2次提取的三維響應(yīng)面圖Fig 2　3D response surface of the second extraction

2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

依照最佳提取工藝參數(shù)對(duì)第1次和第2次提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。第1次提取實(shí)際OD值為0.940 0，與預(yù)測(cè)值0.959 9偏差-2.07%；第2次提取實(shí)際OD值為0.851 8，與預(yù)測(cè)值0.872 8偏差-2.41%，表明本研究建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，可用于該制劑提取工藝的優(yōu)化。

表7　工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab 7　Results of validation test

3　討論

柏薏灌腸液以黃柏、薏苡仁解祛濕邪為君藥：黃柏性寒、味苦，為清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡之主藥，其有效成分主要為小檗堿、黃柏堿、巴馬汀等生物堿類成分［9］；薏苡仁具有利水滲濕、健脾止瀉、除痹排膿、解毒散結(jié)之功。蒲公英、紫花地丁清熱解毒為臣藥：蒲公英主要有效成分為咖啡酸、綠原酸、阿魏酸等酚酸類，具有抗菌、抗炎、抗病毒的作用［10］。三棱、莪術(shù)、桃仁、紅花、路路通、益母草、車前子活血祛瘀為佐藥。牛膝補(bǔ)益肝腎為使藥?，F(xiàn)代研究表明，藥材中含有的生物堿類和酚酸類成分均易溶于熱水［11-12］，故仍然采用傳統(tǒng)水煎提取工藝。

君藥黃柏的有效成分為鹽酸小檗堿，蒲公英、益母草、三棱、牛膝中均含有阿魏酸有效成分，故本研究選擇鹽酸小檗堿和阿魏酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別以生物堿類和有機(jī)酸類有效成分的轉(zhuǎn)移率來(lái)考察提取工藝。筆者在預(yù)實(shí)驗(yàn)中曾選擇咖啡酸作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，但咖啡酸在提取過(guò)程中不穩(wěn)定、難以測(cè)準(zhǔn)，故最終選擇測(cè)定方法較為成熟穩(wěn)定的阿魏酸。薏苡仁雖為君藥，但因其活性成分含量較少、測(cè)定方法復(fù)雜，故未對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。由于中藥制劑成分復(fù)雜、有效成分較多，因此結(jié)合干膏率共同作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果表達(dá)方面較正交設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法更適宜進(jìn)行非線性模型擬合，能夠提高優(yōu)化預(yù)測(cè)的精確性，更好地體現(xiàn)因素、指標(biāo)與效應(yīng)值的關(guān)系［13-14］。本研究還通過(guò)歸一化消除了不同評(píng)價(jià)指標(biāo)的量綱不同帶來(lái)的影響，然后運(yùn)用OD值對(duì)多個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，再進(jìn)行模型擬合，從而預(yù)測(cè)最佳提取條件，適合于多成分中藥制劑的工藝優(yōu)化。

本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化了柏薏灌腸液的2次提取工藝條件，建立的工藝合理可行、提取率高、重現(xiàn)性好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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（編輯：劉明偉）

Optimization of Extraction Technology for Baiyi Rectal Solution

LI Yan1，ZHAO Ligang2，WANG Huili1，ZHENG Lina1，KAN Shuyue1
（1.Dept.of Pharmacy，Tangshan Maternal and Child Health Hospital，Hebei Tangshan 063000，China；2.College of Pharmacy，North China University of Science and Technology，Hebei Tangshan 063000，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of Baiyi rectal solution.METHODS：The effects of water amount and extraction time on extraction technology were investigated by central composite design-response surface method using OD value of berberine hydrochloride and ferulic acid and the extract yield as index.Validation test was also conducted.RESULTS：The optimal extraction technology was as 11-fold water，decocting 70 min for the first time；5-fold water，decocting 30 min for the second time.In validation test，OD value of first extraction was 0.940 0，and the bias between observed and predicted values was-2.07%；that of second extraction was 0.851 8，and the bias was-2.41%.CONCLUSIONS：The extraction technology of Baiyi rectal solution is reasonable，feasible and suitable for industrial production.

Baiyi rectal solution；Central composite design-response surface methodology；Berberine hydrochloride；Ferulic acid；Extract yield

TQ461

A

1001-0408（2016）22-3145-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.36

＊主管藥師，碩士。研究方向：醫(yī)院制劑。電話：0315-3726722。E-mail：liyan_syphu@163.com

2015-10-19

2016-06-14）