丹參酮ⅡA抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移及其機(jī)制研究

董宜旋，李　靜

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南　250355）

丹參酮ⅡA抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移及其機(jī)制研究

董宜旋＊，李靜#

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南250355）

目的：研究丹參酮ⅡA抑制同型半胱氨酸（Hcy）誘導(dǎo)的大鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖和遷移及其機(jī)制。方法：取VSMCs用于試驗。在驗證丹參酮ⅡA抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移試驗（驗證試驗）中，將細(xì)胞分為對照組、Hcy組（1 000 μmol/L）及丹參酮ⅡA低、中、高劑量組（5、10、20μg/L）。在丹參酮作用機(jī)制試驗（細(xì)胞通路試驗）中，將細(xì)胞分為對照組、丹參酮ⅡA組（20μg/L）、雷帕霉素組（20 nmol/L）、MHY1485組（10 μmol/L）、丹參酮ⅡA+雷帕霉素組（丹參酮ⅡA，20μg/L+雷帕霉素，20 nmol/L）、丹參酮ⅡA+MHY1485組（丹參酮ⅡA，20μg/L+MHY1485，10 μmol/L）。驗證細(xì)胞通路P70S6K和p-P70S6K的表達(dá)時，雷帕霉素（抑制試驗）與MHY1485（激動試驗）分別進(jìn)行試驗。酶標(biāo)儀測定VSMCs的增殖，細(xì)胞劃痕試驗、Transwell法測定VSMCs的遷移，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法測定VSMCs中P21、P27、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、P70S6K和p-P70S6K的表達(dá)。結(jié)果：驗證試驗中，與對照組比較，Hcy組細(xì)胞24、48 h吸光度值，遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量，MMP-2、MMP-9和p-P70S6K表達(dá)水平顯著升高，P21、P27表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與Hcy組比較，丹參酮ⅡA低劑量組細(xì)胞48 h，中、高劑量組24、48 h吸光度值，MMP-2水平，低、中、高劑量組細(xì)胞遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量，MMP-9和p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低，丹參酮ⅡA中、高劑量組細(xì)胞中P21、P27表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；各組細(xì)胞P70S6K水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。細(xì)胞通路試驗中，與對照組比較，丹參酮ⅡA、雷帕霉素組細(xì)胞24、48 h吸光度值，遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著降低，MHY1485組24、48 h吸光度值顯著升高（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，丹參酮ⅡA+雷帕霉素組細(xì)胞24、48 h吸光度值顯著降低，丹參酮ⅡA+MHY1485組細(xì)胞12、24、48 h吸光度值，遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著升高（P＜0.01）。抑制試驗中，與對照組比較，丹參酮ⅡA組細(xì)胞p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較、雷帕霉素、丹參酮ⅡA+雷帕霉素組細(xì)胞p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。激動試驗中，丹參酮ⅡA組細(xì)胞p-P70S6K水平顯著降低（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，MHY1485、丹參酮ⅡA+MYH1485組細(xì)胞p-P70S6K水平顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：丹參酮ⅡA可以抑制VSMCs的增殖和遷移，并通過抑制mTOR/P70S6K信號通路而發(fā)揮作用。

血管平滑肌細(xì)胞；丹參酮ⅡA；雷帕霉素受體/P70S6K；增殖；遷移

血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的增殖和遷移是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中重要的病理基礎(chǔ)，也是造成支架植入或冠狀動脈搭橋術(shù)后血管再狹窄的重要原因。高同型半胱氨酸（Hcy）血癥是目前公認(rèn)的冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素。大量研究證實Hcy可以增強(qiáng)VSMCs的增殖和遷移，誘導(dǎo)VSMCs分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等影響細(xì)胞外基質(zhì)動態(tài)平衡的蛋白酶［1］。丹參酮ⅡA是傳統(tǒng)中藥丹參中主要的脂溶性有效成分，結(jié)構(gòu)中含有醌型結(jié)構(gòu)，容易被氧化還原。丹參酮ⅡA參與了機(jī)體的多重生化反應(yīng)且具有多種生物活性，在心腦血管保護(hù)領(lǐng)域具有廣泛的藥理學(xué)作用，在抑制VSMCs的增殖遷移方面具有巨大潛力［2-3］。本研究擬設(shè)計相關(guān)試驗證實丹參酮ⅡA具有抑制VSMCs的增殖遷移的作用。

研究表明，哺乳動物雷帕霉素受體（mTOR）信號通路在VSMCs的增殖和遷移中起到關(guān)鍵的作用［4］。當(dāng)mTOR通路受到抑制時，VSMCs的增殖和遷移能力下降，最終抑制機(jī)體內(nèi)血管重構(gòu)的發(fā)生［5］；而mTOR通路的激活則可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自噬消失，細(xì)胞功能紊亂，細(xì)胞增殖遷移加快［6］。P70S6K是mTOR下游的一個分子通路；雷帕霉素、MHY1485分別是mTOR、P70S6K通路的特異性抑制劑和激動劑［7-8］。本研究擬通過用雷帕霉素或MHY1485抑制或激活VSMCs中的mTOR通路后，再給予丹參酮干預(yù)VSMCs，證實丹參酮是否通過抑制mTOR/P70S6K通路來發(fā)揮其抗VSMCs增殖和遷移的作用。

1　材料

1.1儀器

Eclipse TS100倒置熒光光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；SOIF/XTZ-E體視顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；Forma ClassⅡ生物安全柜（美國Thermo Scientific公司）；Anthos 2010酶標(biāo)儀（奧地利Anthos Labtec公司）；5417R離心機(jī)（美國Eppendorf公司）。

1.2藥品與試劑

丹參酮ⅡA（中國食品藥品檢定研究院，純度：99%，批號：110766-200518，化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品）；Hcy（美國Sigma公司，純度：99%）；兔抗大鼠平滑肌肌動蛋白（SMA）、β-actin單克隆抗體、兔抗大鼠P21、P27、MMP-2、MMP-9多克隆抗體（英國Abcom公司）；兔抗P70S6K、p-P70S6K多克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或者抗鼠二抗，F(xiàn)ITC、FRITC標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白IgG（美國Jackson公司）；MHY1485、雷帕霉素（美國Sigma公司，純度：99%）。

1.3動物

SPF級SD大鼠，♂♀不限，日齡50 d左右，體質(zhì)量150～ 180 g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（魯）20050015。

2　方法

2.1分組與給藥

采用組織貼塊法培育大鼠胸主動脈VSMCs，采用形態(tài)學(xué)觀察，并通過細(xì)胞免疫熒光檢測SMA，通過SMA與4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）核染之間的關(guān)系測定VSMCs的純度。取第4～7代VSMCs用于后續(xù)試驗，試驗中施加干預(yù)時用含1.0%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基作為基質(zhì)。在驗證丹參酮ⅡA抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移試驗（驗證試驗）中，將細(xì)胞分為對照組、Hcy組（1 000 μmol/L）及丹參酮ⅡA低、中、高劑量組（5、10、20μg/L）。在丹參酮作用機(jī)制試驗（細(xì)胞通路試驗）中，將細(xì)胞分為對照組、丹參酮ⅡA組（20μg/L）、雷帕霉素組（20 nmol/L）、MHY1485組（10 μmol/L）、丹參酮ⅡA+雷帕霉素組（丹參酮ⅡA，20μg/L+雷帕霉素，20 nmol/L）、丹參酮ⅡA+ MHY1485組（丹參酮ⅡA，20μg/L+MHY1485，10 μmol/L）。驗證細(xì)胞通路P70S6K和p-P70S6K的表達(dá)時，雷帕霉素（抑制試驗）與MHY1485（激動試驗）分別進(jìn)行試驗。

2.2VSMCs的增殖測定

取4～7代培養(yǎng)細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化單層VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計數(shù)，以每孔6×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后，待細(xì)胞長到70%～80%后，采用血清饑餓使細(xì)胞同步化，按“2.1”項下分組并加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，每組設(shè)3個復(fù)孔、2個不加細(xì)胞的空白對照孔。細(xì)胞于37℃、5%CO2孵箱分別培養(yǎng)12、24、48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入MTT液20 μl，于37℃繼續(xù)孵育4～6 h后終止培養(yǎng)，小心棄去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），震蕩10 min。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔吸光度值。

2.3VSMCs遷移的測定

2.3.1細(xì)胞劃痕試驗測定VSMCs遷移取4～7代培養(yǎng)細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化單層VSMCs，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計數(shù)，以每孔105個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml。細(xì)胞貼壁后，待細(xì)胞長到70%～80%后，采用血清饑餓使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，用100 μl黃色槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片，按“2.1”項下分組并加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h。48 h后拍照記錄，用Image pro plus 6.0圖像分析軟件分析并計算出細(xì)胞遷移的面積。細(xì)胞遷移面積=劃痕面積-遷移后細(xì)胞之間剩余面積；細(xì)胞遷移率=細(xì)胞遷移面積/劃痕面積×100%。

2.3.2Transwell法測定VSMCs遷移取4～7代VSMCs，血清饑餓使細(xì)胞同步化，加入1.8 mmol/L羥基脲作用12 h抑制細(xì)胞增殖，按“2.1”項下分組并加入含相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基配成細(xì)胞懸液并計數(shù)（3×104個/ml）。每組24孔板配套的Transwell小室（0.8 μm）中，上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基500 μl，培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后以棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的VSMCs，取下Transwell半透膜，TBS洗滌3次，3.7%多聚甲醛室溫固定5 min，流水沖洗后，用2 μg/ml的DAPI染核，PBS沖洗。熒光顯微鏡下隨機(jī)取5個視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)并記錄。

2.4VSMCs中P21、P27、MMP-2、MMP-9、P70S6K和p-P70S6K表達(dá)的檢測

按“2.1”項下方法分組、加藥、培養(yǎng)48 h后，裂解VSMCs提取蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）每孔加入20 μl樣品，80 V行蛋白濃聚30 min，120 V凝膠電泳2 h，并用孔徑0.45 μm的硝酸纖維素膜以250 mA轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜完畢后在常溫（25℃）下以三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗膜3次、脫脂奶粉封閉2 h后，以1∶1 000比例分別加入兔抗大鼠P21、P27、MMP-2、MMP-9多克隆抗體，兔抗P70S6K、p-P70S6K多克隆抗體，兔抗大鼠β-actin單克隆抗體（細(xì)胞通路試驗僅加入兔抗P70S6K、p-P70S6K多克隆抗體，兔抗大鼠β-actin單克隆抗體），4℃孵育過夜。常溫下（25℃）TBST洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）法檢測目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的表達(dá)。暗室柯達(dá)膠片顯影，采用Quantity One 4.4軟件進(jìn)行定量分析。蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/β-actin灰度值。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用單因素方差分析和LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1VSMCs原代培養(yǎng)測定結(jié)果

用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動脈VSMCs，8 d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，2周左右細(xì)胞融合可以傳代。傳代后細(xì)胞呈典型“峰谷”狀排列生長，用SMA細(xì)胞免疫熒光法測定VSMCs，DAPI核染之后確定細(xì)胞純度在99%以上，詳見圖1。

圖1　大鼠主動脈VSMCs原代培養(yǎng)測定結(jié)果A.形態(tài)學(xué)觀察（×100）；B.細(xì)胞免疫熒光鑒定（×400）Fig 1　Determination of rat aortic VSMCs primary cultureA.morphology observation（×100）；B.immunocytochemistry identification（×400）

3.2驗證試驗結(jié)果

3.2.1各組細(xì)胞增殖情況測定結(jié)果與對照組比較，Hcy組細(xì)胞24、48 h吸光度值顯著升高（P＜0.01）；與Hcy組比較，丹參酮ⅡA低劑量組細(xì)胞48 h及中、高劑量組24、48 h吸光度值顯著降低（P＜0.01），表明細(xì)胞增殖明顯減少，詳見表1。

表1　各組細(xì)胞吸光度值測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 1　OD value of cell in each group（±s，n=5）

表1　各組細(xì)胞吸光度值測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 1　OD value of cell in each group（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與Hcy組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.Hcy group，#P＜0.01

48 h 0.73±0.09 1.14±0.15＊0.93±0.18#0.87±0.05#0.79±0.11#組別對照組Hcy組丹參酮ⅡA低劑量組丹參酮ⅡA中劑量組丹參酮ⅡA高劑量組劑量，μg/L 5 10 20 12 h 0.32±0.02 0.38±0.02 0.36±0.02 0.31±0.01 0.31±0.01 24 h 0.41±0.06 0.62±0.06＊0.57±0.06 0.49±0.04#0.39±0.02#

3.2.2各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果與對照組比較，Hcy組細(xì)胞遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著升高（P＜0.01）；與Hcy組比較，丹參酮ⅡA低、中、高劑量組細(xì)胞遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著降低（P＜0.01），詳見表2。

表2　各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 2　Migration of cell in each group（±s，n=5）

表2　各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 2　Migration of cell in each group（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與Hcy組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.Hcy group，#P＜0.01

VSMCs穿透數(shù)量，個46±9.6 245±27.6＊199±21.6#147±23.4#139±15.2#組別對照組Hcy組丹參酮ⅡA低劑量組丹參酮ⅡA中劑量組丹參酮ⅡA高劑量組劑量，μg/L 5 10 20遷移面積，% 0.22±0.02 0.58±0.05＊0.46±0.04#0.41±0.04#0.39±0.05#

3.2.3各組細(xì)胞中P21、P27、MMP-2、MMP-9、P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果與對照組比較，Hcy組細(xì)胞中P21、P27表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），MMP-2、MMP-9和p-P70S6K表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與Hcy組比較，丹參酮ⅡA低劑量組細(xì)胞中P27表達(dá)水平，丹參酮ⅡA中、高劑量組細(xì)胞中P21、P27表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；丹參酮ⅡA中、高劑量組細(xì)胞中MMP-2，丹參酮ⅡA低、中、高劑量組細(xì)胞中MMP-9和p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；各組細(xì)胞P70S6K水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），詳見表3。ECL法檢測目標(biāo)蛋白和內(nèi)參的表達(dá)結(jié)果見圖2。

表3　各組細(xì)胞中P21、P27、MMP-2、MMP-9、P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 3　The expression levels of P21，P27，MMP-2，MMP-9，P70S6K and p-P70S6K of cell in each group（±s，n=5）

表3　各組細(xì)胞中P21、P27、MMP-2、MMP-9、P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 3　The expression levels of P21，P27，MMP-2，MMP-9，P70S6K and p-P70S6K of cell in each group（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與Hcy組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.Hcy group，#P＜0.01

p-P70S6K 0.12±0.01 1.43±0.21＊0.78±0.08#0.55±0.34#0.32±0.02#組別對照組Hcy組丹參酮ⅡA低劑量組丹參酮ⅡA中劑量組丹參酮ⅡA高劑量組劑量，μg/L 5 10 20 P21 1.35±0.15 0.89±0.12＊1.04±0.17 1.78±0.13 1.73±0.21#P27 0.54±0.04 0.21±0.01＊0.64±0.02#0.84±0.05#0.76±0.02#MMP-2 0.12±0.01 0.64±0.02＊0.62±0.03 0.31±0.01#0.29±0.01＊MMP-9 0.14±0.01 0.57±0.05＊0.48±0.03#0.32±0.02#0.24±0.02#P70S6K 0.76±0.05 0.69±0.06 0.75±0.07 0.86±0.03 0.67±0.06

3.3細(xì)胞通路試驗結(jié)果

3.3.1各組細(xì)胞增殖情況測定結(jié)果與對照組比較，丹參酮ⅡA、雷帕霉素組細(xì)胞24、48 h吸光度值顯著降低（P＜0.01），MHY1485組24、48 h吸光度值顯著升高（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，丹參酮ⅡA+雷帕霉素組細(xì)胞24、48 h吸光度值顯著降低（P＜0.01），丹參酮ⅡA+MHY1485組細(xì)胞12、24、48 h吸光度值顯著升高（P＜0.01），詳見表4。

圖2　各組細(xì)胞中P21、P27、MMP-2、MMP-9、P70S6K與p-P70S6K的表達(dá)情況Fig 2　The expression of P21，P27，MMP-2，MMP-9，P70S6K and p-P70S6K of cell in each group

表4　各組細(xì)胞吸光度值結(jié)果（±s，n=5）Tab 4　OD value of cell in each group（±s，n=5）

表4　各組細(xì)胞吸光度值結(jié)果（±s，n=5）Tab 4　OD value of cell in each group（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與丹參酮ⅡA組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.TanⅡAgroup，#P＜0.01

48 h 1.13±0.19 0.74±0.15＊0.64±0.08＊0.61±0.05#1.22±0.18＊1.09±0.13#組別對照組丹參酮ⅡA組雷帕霉素組丹參酮ⅡA+雷帕霉素組MHY1485組丹參酮ⅡA+MHY1485組12 h 0.42±0.03 0.31±0.01 0.34±0.01 0.31±0.02 0.52±0.02 0.54±0.02#24 h 0.69±0.04 0.52±0.06＊0.49±0.07＊0.42±0.02#0.81±0.08＊0.78±0.09#

3.3.2各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果與對照組比較，丹參酮ⅡA、雷帕霉素組細(xì)胞遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著降低（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，丹參酮ⅡA+MHY1485組細(xì)胞遷移面積和VSMCs穿透數(shù)量顯著升高（P＜0.01），詳見表5。

表5　各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 5　Migration of cell in each group（±s，n=5）

表5　各組細(xì)胞遷移情況測定結(jié)果（±s，n=5）Tab 5　Migration of cell in each group（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與丹參酮ⅡA組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.TanⅡAgroup，#P＜0.01

VSMCs穿透數(shù)量，個243±21.4 155±12.4＊98±7.7＊79±6.9 268±17.9 237±22.7#組別對照組丹參酮ⅡA組雷帕霉素組丹參酮ⅡA+雷帕霉素組MHY1485組丹參酮ⅡA+MHY1485組遷移面積，% 0.72±0.07 0.31±0.04＊0.24±0.02＊0.22±0.01 0.82±0.07 0.74±0.07#

3.3.3各組細(xì)胞中P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果抑制試驗中，與對照組比較，丹參酮ⅡA組細(xì)胞p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，雷帕霉素、丹參酮ⅡA+雷帕霉素組細(xì)胞的p-P70S6K表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），詳見表6、圖3。

表6　抑制試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 6　The expression level of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in inhibitory tes（t±s，n=5）

表6　抑制試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 6　The expression level of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in inhibitory tes（t±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與丹參酮ⅡA組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.TanⅡAgroup，#P＜0.01

組別對照組丹參酮ⅡA組雷帕霉素組丹參酮ⅡA+雷帕霉素組p-P70S6K 0.87±0.07 0.43±0.06＊0.08±0.01#0.05±0.01#P70S6K 0.66±0.05 0.59±0.06 0.65±0.07 0.66±0.03

圖3　抑制試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)情況Fig 3　The expression of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in inhibitory test

激動試驗中，丹參酮ⅡA組細(xì)胞p-P70S6K水平顯著降低（P＜0.01）；與丹參酮ⅡA組比較，MHY1485、丹參酮ⅡA+ MYH1485組細(xì)胞p-P70S6K水平顯著升高（P＜0.01），詳見表7、圖4。

表7　激動試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 7　The expression level of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in activation test（±s，n=5）

表7　激動試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n=5）Tab 7　The expression level of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in activation test（±s，n=5）

注：與對照組比較，＊P＜0.01；與丹參酮ⅡA組比較，#P＜0.01Note：vs.control group，＊P＜0.01；vs.TanⅡAgroup，#P＜0.01

組別對照組丹參酮ⅡA組MHY1485組丹參酮ⅡA+MYH1485組p-P70S6K 0.47±0.05 0.13±0.01＊0.58±0.05#0.75±0.15#P70S6K 0.64±0.06 0.57±0.05 0.55±0.03 0.56±0.02

圖4　激動試驗中各組細(xì)胞P70S6K和p-P70S6K表達(dá)情況Fig 4　The expression of P70S6K and p-P70S6K of cell in each group in activation test

4　討論

丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參中的一種提取成分，在心血管疾病的治療中已有廣泛的應(yīng)用［9］。丹參酮ⅡA不僅可以抑制血小板黏附、聚集發(fā)揮抗凝血作用，還具有抗氧化、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用［10-13］。研究證實，P21和P27可以抑制VSMCs的增殖［14-15］。在本研究中，丹參酮ⅡA通過抑制mTOR/P70S6K通路，增加與細(xì)胞增殖相關(guān)的P21和P27的表達(dá)，抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移，這可能是其抗動脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

VSMCs位于動脈血管的中層，在正常狀態(tài)下主要起收縮血管的功能，當(dāng)遇到炎癥因子等血管損傷因素時，VSMCs可被激活而增加增殖和遷移能力［16］。VSMCs大量增殖、遷移、吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）后形成肌源性泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步分泌炎癥因子，使炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，細(xì)胞外基質(zhì)降解，最終導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成以及斑塊的破裂［17］。MMP在平滑肌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，一方面其可通過與細(xì)胞黏附分子相互作用降解細(xì)胞外基質(zhì)，為VSMCs向周圍組織增殖遷移提供空間；另一方面MMP還可以激活細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT通路，增加細(xì)胞的遷移和增殖能力［18-19］。本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA可以抑制VSMCs中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，這可能是丹參酮ⅡA抑制VSMCs增殖遷移的機(jī)制之一。

VSMCs的增殖和遷移受大量信號通路的調(diào)控，mTOR信號通路的激活可以增加p-P70S6K的表達(dá)，增加VSMCs的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA在抑制VSMCs的增殖和遷移的同時，減少p-P70S6K的表達(dá)。

為了進(jìn)一步證實丹參酮ⅡA是否通過抑制mTOR/P70S6K信號通路而發(fā)揮作用，筆者在本研究中設(shè)計了抑制試驗與激動試驗。結(jié)果顯示，雷帕霉素可以抑制p-P70S6K的表達(dá)，與丹參酮ⅡA一樣可以抑制VSMCs的增殖和遷移；MHY1485可以逆轉(zhuǎn)丹參酮ⅡA抑制VSMCs增殖遷移的作用，進(jìn)一步證實丹參酮ⅡA是通過抑制mTOR/P70S6K信號通路發(fā)揮作用。綜上所述，丹參酮ⅡA可以抑制VSMCs的增殖和遷移，并通過抑制mTOR/P70S6K信號通路而發(fā)揮作用。

［1］Chistiakov DA，Orekhov AN，Bobryshev YV.Vascular smooth muscle cell in atherosclerosis［J］.Acta Physiol：Oxf，2015，14（1）：33.

［2］Chaabane C，Coen M，Bochaton-Piallat ML.Smooth muscle cell phenotypic switch：implications for foam cell formation［J］.Curr Opin Lipidol，2014，25（5）：374.

［3］Han XB，Zhang HP，Cao CJ，et al.Aberrant DNA methylation of the PDGF gene in homocysteine mediated VSMC proliferation and its underlying mechanism［J］. Mol Med Rep，2014，10（2）：947.

［4］Zhang D，Chen Y，Xie X，et al.Homocysteine activates vascular smooth muscle cells by DNA demethylation of platelet-derived growth factor in endothelial cells［J］.J Mol Cell Cardiol，2012，53（4）：487.

［5］ Zheng L，Liu M，Wei M，et al.TanshinoneⅡAattenuates hypoxic pulmonary hypertension via modulating KV currents［J］.Respir Physiol Neurobiol，2015，205：120.

［6］Grundmann S，Hans FP，Kinniry S，et al.MicroRNA-100 regulates neovascularization by suppression of mammalian target of rapamycin in endothelial and vascular smooth muscle cells［J］.Circulation，2011，123（9）：999.

［7］Munson MJ，Ganley IG.MTOR，PIK3C3，and autophagy：signaling the beginning from the end［J］.Autophagy，2015，11（12）：2 375.

［8］Cheng Y，Kim J，Li XX，et al.Promotion of ovarian follicle growth following mTOR activation：synergistic effects of AKT stimulators［J］.PLoS One，2015，10（2）：117 769.

［9］黃菁菁，張偉霞，楊婉花.丹參酮ⅡA磺酸鈉治療冠心病心絞痛的臨床觀察［J］.中國藥房，2016，27（2）：219.

［10］Yang Y，Cai F，Li PY，et al.Activation of high conductance Ca（2+）-activated K（+）channels by sodium tanshinoneⅡAsulfonate（DS-201）in porcine coronary artery smooth muscle cells［J］.Eur J Pharmacol，2008，598（1/2/ 3）：9.

［11］ Xu S，Little PJ，Lan T，et al.TanshinoneⅡAattenuates and stabilizes atherosclerotic plaques in apolipoprotein-E knockout mice fed a high cholesterol diet［J］.Arch Biochem Biophys，2011，515（1/2）：72.

［12］Wu WY，Yan H，Wang XB，et al.Sodium tanshinoneⅡAsilate inhibits high glucose-induced vascular smooth muscle cell proliferation and migration through activation of AMP-activated protein kinase［J］.PLoS One，2014，9（4）：94 957.

［13］ Wang J，Jiang Q，Wan L，et al.Sodium tanshinoneⅡAsulfonate inhibits canonical transient receptor potential expression in pulmonary arterial smooth muscle from pulmonary hypertensive rats［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2013，48（1）：125.

［14］Tan XQ，Cheng XL，Yang Y，et al.TanshinoneⅡAsodium sulfonate（DS-201）enhances human BKCa channel activity by selectively targeting the pore-forming alpha subunit［J］.Acta Pharmacol Sin，2014，35（11）：1 351.

［15］ Auge N，Maupas-Schwalm F，Elbaz M，et al.Role for matrix metalloproteinase-2 in oxidized low-density lipoprotein-induced activation of the sphingomyelin/ceramide pathway and smooth muscle cell proliferation［J］.Circulation，2004，110（5）：571.

［16］ Vanhoutte D，Heymans S.TIMPs and cardiac remodeling：'Embracing the MMP-independent-side of the family' ［J］.J Mol Cell Cardiol，2010，48（3）：445.

［17］Lee SJ，Lee YS，Seo KW，et al.Homocysteine enhances MMP-9 production in murine macrophages via ERK and Akt signaling pathways［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2012，260（1）：89.

［18］ Wagner RJ，Martin KA，Powell RJ，et al.Lovastatin induces VSMC differentiation through inhibition of Rheb and mTOR［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，299（1）：119.

［19］ Martin KA，Rzucidlo EM，Merenick BL，et al.The mTOR/p70 S6K1 pathway regulates vascular smooth muscle cell differentiation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，286（3）：507.

（編輯：劉明偉）

Study on TanshinoneⅡAInhibiting the Proliferation and Migration Induced by Homocysteine of VSMCs and Its Mechanism

DONG Yixuan，LI Jing
（School of Pharmacy，Shandong University of TCM，Jinan 250355，China）

OBJECTIVE：To study tanshinoneⅡAinhibiting the proliferation and migration induced by homocysteine（Hcy）of rat aortic vascular smooth muscle cells（VSMCs）and its signal pathway.METHODS：VSMCs were selected for the following experiments.In order to validate TanshinoneⅡAinhibiting the proliferation and migration induced by Hcy of VSMCs，VSMCs were divided into control group，Hcy group（1 000 μmol/L），TanshinoneⅡAlow-dose，medium-dose and high-dose groups（5，10，20μg/ L）.In mechanism study test，VSMCs were divided into control group，TanshinoneⅡAgroup（20μg/L），rapamycin group（20 nmol/ L），MHY1485 group（10 μmol/L），TanshinoneⅡA+rapamycin group（TanshinoneⅡA，20μg/L+rapamycin，20 nmol/L），TanshinoneⅡA+MHY1485 group（TanshinoneⅡA，20μg/L+MHY1485，10 μmol/L）.In validation test of P70S6K and p-P70S6K pathway expression，rapamycin and MHY1485 were used for inhibitory test and activation test，respectively.The proliferation of VSMCs was determined by ELIASA，and Transwell chambers and wound healing test were employed to test the migratory ability of VSMCs.Western blotting were used to investigate the expressions of P21，P27，MMP-2，MMP-9，P70S6K and p-P70S6K in VSMCs.RESULTS：In validation test，compared with control group，24，48 h absorbance，migration area，the number of VSMCs penetration and the expression of MMP-2，MMP-9 and p-P70S6K increased significantly，while the expression of P21 and P27 decreased significantly（P＜0.01）.Compared with Hcy group，48 h absorbance of TanshinoneⅡAlow-dose group，24，48 h absorbance and the expression of MMP-2 of TanshinoneⅡAmedium-dose and high-dose groups，migration area，the number of VSMCs penetration，the expression of MMP-9 and p-P70S6K in low-dose，medium-dose and high-dose groups all decreased significantly；the expression of P21 and P27 increased significantly in TanshinoneⅡAmedium-dose and high-dose groups（P＜0.01）；there was no statistical significance in P70S6K level among those groups （P＞0.05）.Incellpathwaytest，comparedwithcontrol group，24，48 h absorbance，migration area and the number of VSMCs penetration decreased significantly in TanshinoneⅡAgroup and rapamycin group，while 24，48 h absorbance increased significantly in MHY1485 group（P＜0.01）.Compared with TanshinoneⅡAgroup，24，48 h absorbance decreased significantly in TanshinoneⅡA+rapamycin group，while 12，24，48 h absorbance，migration area and the number of VSMCs penetration increased significantly in TanshinoneⅡA+MHY1485 group（P＜0.01）. In inhibitory test，compared with control group，the expression of p-P70S6K decreased significantly in TanshinoneⅡAgroup（P＜0.01）；compared with TanshinoneⅡAgroup，the expression of p-P70S6K decreased significantly in rapamycin group and Tanshinone ⅡA+rapamycin group（P＜0.01）；in activation test，the expression of p-P70S6K decreased significantly in TanshinoneⅡAgroup （P＜0.01），compared with TanshinoneⅡAgroup，the expression of p-P70S6K increased significantly in MHY1485，TanshinoneⅡA+ MHY1485 group（P＜0.01）.CONCLUSIONS：TanshinoneⅡAcan inhibit the proliferation and migration of VSMCs by suppressing mTOR/P70S6K signal pathway.

Vascular smooth muscle cells；TanshinoneⅡA；mTOR/P70S6K；Proliferation；Migration

R543.3+1

A

1001-0408（2016）22-3072-05

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.22.15

＊博士研究生。研究方向：中藥學(xué)。E-mail：Dong012aD@163. com

講師，博士研究生。研究方向：中藥學(xué)。E-mail：406124939@qq.com

2016-01-02

2016-06-17）