HPLC法測定陜西商南地產(chǎn)金銀花不同采收時間及不同部位中木犀草苷的含量

柯　園，解淑琴，姚　遠

(商洛市食品藥品檢驗所，商洛　726000)

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HPLC法測定陜西商南地產(chǎn)金銀花不同采收時間及不同部位中木犀草苷的含量

柯園，解淑琴，姚遠

(商洛市食品藥品檢驗所，商洛726000)

目的建立高效液相色譜法測定金銀花不同部位(花、葉和莖)中木犀草苷的含量。方法應(yīng)用KromasilC18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-5mL·L-1冰醋酸溶液為流動相，按1∶9梯度洗脫至3∶7；流速為1.0mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長為350nm。結(jié)果木犀草苷存在于金銀花的花、葉和莖中，隨著花的成熟，花中含量逐漸提高，葉和莖中含量逐漸降低。結(jié)論HPLC法操作簡便、結(jié)果準確，適用于金銀花中木犀草苷的測定。

金銀花；木犀草苷；高效液相色譜法

金銀花又稱雙花，來源于忍冬科忍冬屬植物忍冬的干燥花蕾，作為傳統(tǒng)常用中藥，已有上千年的用藥歷史[1]。其性甘、寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、疏散風熱的功能[2]。金銀花富含揮發(fā)油、黃酮類、有機酸和三萜皂苷類等[3]成分。2010年版《中國藥典》[4]規(guī)定，金銀花中的標志性成分是綠原酸和木犀草苷，而是否含有木犀草苷是區(qū)別正品金銀花和同科的山銀花、忍冬藤的主要化學指標，也是正品金銀花與山銀花等同科植物在療效上存在差異的主要原因。以木犀草素及其木犀草苷為代表的黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種藥理作用[5-7]。“巨花一號”金銀花在商南縣富水鎮(zhèn)王家樓村長勢良好，適應(yīng)性強、易栽培、易成活、耐旱澇，在山坡和溝臺地均能種植。據(jù)報道，金銀花葉片粗提物的抑菌效果基本等同于金銀花粗提物，具有較高的開發(fā)利用價值[8]。

1　儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(日本島津制作所，20A)；超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子分析天平(瑞士梅特勒托利多儀器公司，萬分之一)。

1.2試藥木犀草苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111720-201307，質(zhì)量分數(shù)：94.0%)；甲醇和乙腈為色譜純(美國賽默飛世爾科技公司)；冰醋酸和乙醇為分析純；水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：KromasilC18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈(A)-5mL·L-1冰醋酸溶液(B)，進行梯度洗脫，見表1；流速：1mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：10.0μL；檢測波長：350nm[4]。

表1梯度洗脫程序

Tab.1Thegradientelutionprogram

時間/min流動相A/%流動相B/% 0～1510→2090→80 15～302080 30～4020→3080→70

2.2樣品采集于2013年4月25日，4月30日和5月9日，從商南縣富水鎮(zhèn)王家樓村金銀花產(chǎn)業(yè)基地采收金銀花不同部位(花、葉和莖)樣品若干，帶回實驗室陰干后密封，陰涼處保存。

2.3樣品處理分別稱取2.0g不同采收時間、不同部位樣品，粉碎，將其分別用體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，定容于50mL的棕色量瓶中，超聲1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用體積分數(shù)為70%的乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10mL，回收溶劑至干，殘渣再用體積分數(shù)為70%的乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL棕色量瓶中，加體積分數(shù)為70%的乙醇至刻度，即得供試品溶液。

2.4對照品溶液的制備精密稱取木犀草苷對照品4.0mg，用體積分數(shù)為70%的乙醇溶液配制成質(zhì)量濃度為0.040mg·mL-1的對照品溶液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。

2.5線性關(guān)系考察精密吸取木犀草苷對照品溶液1，2，4，6，8和10mL，置于5mL棕色量瓶中，定容至刻度，按照上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，得到直線回歸方程Y=33 613 021.230 1X-5 416.076 2(Y代表峰面積，X代表木犀草苷質(zhì)量濃度/mg·mL-1)，r=0.999 8，結(jié)果表明，木犀草苷對照品質(zhì)量濃度在0.008～0.080mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6精密度實驗取木犀草苷對照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進樣6次，精密度良好(RSD值為0.7%，n=6)。

2.7重復(fù)性實驗取5月10日金銀花的花1份，按照上述方法平行制備樣品溶液4份，分別進行測定，結(jié)果表明，木犀草苷的重復(fù)性良好(RSD值為0.1%，n=4)。

2.8穩(wěn)定性實驗取4月30日金銀花的花樣品溶液1份，分別在0，2，4，8，12和24h進行測定，結(jié)果表明，供試品在室溫條件下，24h內(nèi)基本穩(wěn)定(RSD值為0.8%，n=6)。

2.9回收率實驗精密稱取已知木犀草苷含量的5月10日金銀花的花1.000g，按照上述方法制備樣品溶液2份，其中1份加入木犀草苷對照品溶液(質(zhì)量濃度為0.040mg·mL-1)2.0mL，按照上述方法進行測定，回收率為95.7%。

2.10測定結(jié)果取制備好的金銀花樣品溶液和對照品溶液，按照上述方法進行測定，結(jié)果表明，木犀草苷普遍存在于金銀花的花、葉和莖中，其中以花中含量較高，超過《中國藥典》規(guī)定的1倍多，隨著采收時間不同含量亦有變化，近花期含量最高；其次是葉，含量也達到《中國藥典》的規(guī)定水平，并隨著花期臨近，含量逐漸降低，這可能是木犀草苷向花中轉(zhuǎn)移的結(jié)果；莖中含量最少，與《中國藥典》的規(guī)定值相差較大，不具有實際的藥用價值。液相色譜圖見圖1。

圖1高效液相色譜圖

A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.木犀草苷

Fig.1HPLCchromatograms

A.referencesubstance；B.testsample；C.negtivecontrol；1.luteoloside

3　討論

3.1色譜條件的選擇在中藥化學成分檢測中也不難看到，中藥因其成分復(fù)雜多變，質(zhì)量評價和標準還存在很多問題[9]。本文選用比較成熟的《中國藥典》方法，色譜柱為KromasilC18柱，流動相及梯度洗脫程序同《中國藥典》，實驗結(jié)果顯示，木犀草苷出峰快，分離效果較好，可作為商南產(chǎn)金銀花中木犀草苷含量測定用方法。

3.2采收時間的選擇實驗用樣品均為商南金銀花產(chǎn)地采樣，根據(jù)金銀花的花蕾形成過程，時間間隔分別為3，3和10d，能較好地反映金銀花自花蕾形成到含苞待放時間過程中木犀草苷在花、葉和莖中的轉(zhuǎn)移和分布，通過測定不同采收時間金銀花中木犀草苷的含量，為后期研究金銀花最佳采收時間提供參考依據(jù)。文獻報道[10]，金銀花中有效成分在1日之內(nèi)也會不斷發(fā)生變化，早晨和下午采收都有區(qū)別，因此，通過測定有效成分含量變化，不斷優(yōu)化金銀花采收時間，最大限度地發(fā)揮金銀花藥理作用。

3.3提取溶劑的選擇取金銀花粉末0.1g，精密稱定，分別加入體積分數(shù)為25%, 50%和70%的甲醇25mL以及體積分數(shù)為25%，50%和70%的乙醇25mL，超聲提取30min。結(jié)果以體積分數(shù)為70%的甲醇和體積分數(shù)為70%的乙醇作溶劑提取木犀草苷含量高，考慮到二者提取的量幾乎一致，而前者成本高，毒性大，所以選擇體積分數(shù)為70%的乙醇作為提取溶劑[11]。

實驗結(jié)果表明，木犀草苷存在于金銀花的花、葉和莖中，隨著花的成熟，花中含量逐漸提高，葉和莖中含量逐漸降低，但花和葉中木犀草苷含量均能達到《中國藥典》的規(guī)定標準，說明金銀花葉也具有一定的藥用價值。通過比較木犀草苷含量的變化，可以確定在金銀花含苞待放時采收品質(zhì)最佳[12]，此時花中木犀草苷含量最高。這可能與金銀花在生長過程中一些物質(zhì)含量在不斷發(fā)生變化和轉(zhuǎn)移有關(guān)，同時也與日光、天氣變化等因素有關(guān)。也有相關(guān)文獻報道，金銀花葉中木犀草苷高于花中的含量[13-14]，這可能與金銀花的產(chǎn)地、采收時間等因素有關(guān)。通過測定金銀花中木犀草苷的含量變化，可為商南金銀花產(chǎn)業(yè)基地采收金銀花時間提供一定的參考，提高陜西產(chǎn)金銀花的市場競爭力[15]。

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Determination of the contents of luteoloside of different parts and harvest time in Lonicera japonica that collected from Shaanxi Shangnan by HPLC

KE Yuan, XIE Shuqin,YAO Yuan

(Shangluo Institute for Food and Drug Control，Shangluo 726000，China)

ObjectiveToestablishanHPLCmethodforthedeterminationofluteolosideindifferentpartsofLonicera japonica(flowers，leavesandstems).MethodsSamplesweredeterminedonaKromasilC18column(150mm×4.6mm，5μm).Themobilephaseofisolatingluteolosidewasacetonitrileand5mL·L-1aceticacid，gradientelutionfrom1∶9to3∶7.Theflowratewas1.0mL·min-1，thecolumntemperaturewas30 ℃，andtheUVdetectionwavelengthwasat350nm.ResultsLuteolosideexistsinLonicera japonicaflowers，leavesandstems.Astheflowermatured，thecontentofflowersincreasedwiththecontentsofleavesandstemsdecreasedgradually.ConclusionHPLCmethodissimpleandaccurate,andcanbeusedforthedeterminationofluteolosideinLonicera japonica.

Lonicera japonica；luteoloside；HPLC

10.3969/j.issn.1004-2407.2016.05.006

R927.2

A

1004-2407(2016)05-0459-03

2015-10-20)