薏苡仁油對(duì)HCT116細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的影響及機(jī)制*

余　濤，　劉　禮，　呂秀瑋，　賀文煜，　袁昌勁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院中西結(jié)合腫瘤科，武漢430014

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薏苡仁油對(duì)HCT116細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的影響及機(jī)制*

余濤，劉禮，呂秀瑋，賀文煜，袁昌勁△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院中西結(jié)合腫瘤科，武漢430014

目的觀察薏苡仁油(CLSO)對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成能力的影響，并觀察CLSO對(duì)細(xì)胞遷移能力和遷移誘導(dǎo)蛋白-7(Mig-7)表達(dá)水平的影響，藉此探討CLSO影響血管生成擬態(tài)形成的可能機(jī)制。方法MTT法檢測CLSO對(duì)HCT116的無毒濃度(增殖抑制率<10%時(shí)的濃度)，選取無毒濃度以下不同濃度的CLSO作用于三維培養(yǎng)的HCT116細(xì)胞，觀察其對(duì)HCT116細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的影響；并用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的遷移能力，蛋白印跡法檢測各組中Mig-7蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果體外三維培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)CLSO作用的HCT116細(xì)胞形成血管生成擬態(tài)的結(jié)構(gòu)比對(duì)照組減少。劃痕實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組、CLSO 5和10 μL/mL濃度組的平均遷移距離依次縮小，遷移率分別為17.07%、9.19%、2.10%，2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。蛋白印跡法檢測顯示經(jīng)不同濃度CLSO作用于HCT116細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)組條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值比對(duì)照組小，Mig-7蛋白表達(dá)受到抑制，其中10 μL/mL濃度組的抑制作用比5 μL/mL組更明顯，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CLSO體外對(duì)HCT116形成血管生成擬態(tài)的能力存在抑制，其機(jī)制可能與下調(diào)Mig-7蛋白表達(dá)，從而影響細(xì)胞的遷移能力有關(guān)。

薏苡仁油；結(jié)腸癌；血管生成擬態(tài)；細(xì)胞遷移；遷移誘導(dǎo)蛋白-7

薏苡仁油(coix seed oil，CLSO)是從中藥薏苡仁中提取的脂質(zhì)成份。前期臨床研究表明該藥對(duì)腸癌有效，具體作用表現(xiàn)在抗炎消腫[1]，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[2]，輔助化療減毒增效[3]，減少放療造成的組織損傷[4]以及調(diào)整免疫功能[5]等方面。而抑制腫瘤血液供應(yīng)也是抗腫瘤治療的重要策略，但是關(guān)于CLSO影響腫瘤血供的研究卻較少。目前發(fā)現(xiàn)有內(nèi)皮血管和血管生成擬態(tài)2種管道為腫瘤提供血液[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)CLSO可以影響腫瘤內(nèi)皮血管生成[7]，其機(jī)制與CLSO影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá)有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)則是以人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116)為研究對(duì)象，觀察CLSO對(duì)血管生成擬態(tài)的影響。由于腫瘤細(xì)胞遷移是血管生成擬態(tài)形成過程中的必要環(huán)節(jié)，而遷移誘導(dǎo)蛋白-7(migration induced protein-7，Mig-7)是調(diào)控血管生成擬態(tài)的關(guān)鍵分子[9]，本實(shí)驗(yàn)中同時(shí)觀察CLSO對(duì)細(xì)胞遷移能力和Mig-7表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討CLSO抑制血管生成擬態(tài)的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株(HCT116)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM高糖型培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；鼠尾Ⅰ型膠原購自杭州生友生物技術(shù)有限公司；薏苡仁油購自陜西森朗生物化工有限公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司；DMSO(分析純)購自北京博大泰恒有限公司；兔抗人Mig-7多克隆抗體購自Abcam公司，內(nèi)參GAPDH兔抗人多克隆抗體購自杭州至賢生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體購自R&D公司；RIPA細(xì)胞裂解液購自日本TaKaRa公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；酶標(biāo)儀、電泳儀、半干法轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像系統(tǒng)均為Bio-Rad品牌；其余蛋白印跡法所需試劑耗材均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

HCT116細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，以完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，10萬U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)培養(yǎng)于含5% CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中，適時(shí)換液、傳代，連續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT法檢測CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞的無毒濃度

無毒濃度為增殖抑制率<10%的濃度。取對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，常規(guī)清洗、消化、收集、吹打重懸，制成密度為(1～5)×104/mL的單細(xì)胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL。置培養(yǎng)箱中24 h，待細(xì)胞貼壁，棄去舊培養(yǎng)液，將CLSO先用DMSO溶解，再用新培養(yǎng)液稀釋(DMSO的終濃度小于3‰)，使終濃度依次為0、10、20、40、80、160、320 μL/mL，空白組加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后終止培養(yǎng)，每孔加入20 μL MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后，去原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，搖床上搖晃10 min，酶標(biāo)儀讀取參考波長490 nm，檢測波長570 nm處各孔的吸光度值(A)，并按公式計(jì)算抑制率：細(xì)胞生長抑制率=1—(實(shí)驗(yàn)組平均A值—空白組平均A值)/(對(duì)照組平均A值—空白組平均A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。軟件計(jì)算IC10，作為CLSO對(duì)HCT116的無毒劑量。

1.4三維培養(yǎng)觀察血管生成擬態(tài)形成

參照文獻(xiàn)[10]的方法，預(yù)先在無菌6孔板板底鋪加200 μL鼠尾Ⅰ型膠原，靜置凝固。再將對(duì)數(shù)生長期的HCT116常規(guī)消化，以2×106/孔的密度加入6孔板中，同時(shí)分別加入培養(yǎng)液和CLSO稀釋液，使終體積為3 mL/孔，終濃度為0、5、10 μL/mL。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，用PAS染色法顯示管狀結(jié)構(gòu)后拍照。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[11]的方法，預(yù)先在24孔板中鋪鼠尾Ⅰ型膠原150 μL/孔。CLSO用無血清的培養(yǎng)液稀釋成0、5、10 μL/mL，分別預(yù)處理HCT116 24 h。再將處理后的HCT116以5×105個(gè)/mL的密度接種于各孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至形成單細(xì)胞層時(shí)，用黃色移液器吸頭在板底劃“一”字痕，鏡下拍照；繼續(xù)培養(yǎng)12 h再次拍照，用IMAGE軟件計(jì)算劃痕距離，并計(jì)算細(xì)胞遷移率(%)=(1—培養(yǎng)后的劃痕距離/初始距離)×100%。

1.6蛋白印跡法檢測Mig-7蛋白表達(dá)

同1.4中的分組和三維培養(yǎng)方法，培養(yǎng)36 h后將細(xì)胞置冰上，用預(yù)冷PBS洗3遍，加入含有PMSF的RIPA裂解液，收集各孔總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，取總蛋白量相等的樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗(1∶2 000)，4℃孵育過夜，加入二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色，暗室中曝光于膠片。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照并行灰度分析，以目標(biāo)蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果

2.1CLSO作用于HCT116細(xì)胞的無毒劑量

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，經(jīng)不同濃度CLSO干預(yù)后，HCT116細(xì)胞增殖能力受到不同程度抑制。經(jīng)計(jì)算，CLSO處理HCT116細(xì)胞48 h的IC50=119.87 μL/mL，IC10=14.63 μL/mL。

2.2CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成的影響

通過三維培養(yǎng)形成的管腔結(jié)構(gòu)如圖2所示，對(duì)照組中可見HCT116在模擬細(xì)胞外基質(zhì)的膠原上形成大量完整的VM結(jié)構(gòu)。而CLSO 5 μL/mL濃度組中，完整VM結(jié)構(gòu)明顯減少，10 μL/mL濃度組則幾乎未見到完整的VM結(jié)構(gòu)。

2.3CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)不同濃度CLSO作用后的HCT116細(xì)胞遷移能力受到不同程度抑制。對(duì)照組、5和10 μL/mL濃度組的平均遷移距離依次縮小，遷移率分別為17.07%、9.19%、2.10%。兩實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

圖1　不同濃度CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CLSO on the migration of HCT116 cells

A：CLSO 0 μL/mL；B：CLSO 5 μL/mL；C：CLSO 10 μL/mL圖2　不同濃度CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞形成VM結(jié)構(gòu)的影響(PAS染色，×40)Fig.2 Effects of different concentrations of CLSO on the VM formation in HCT116 cells(PAS staining,×40)

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2.4CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞Mig-7蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡法檢測不同濃度CLSO作用于HCT116細(xì)胞后Mig-7的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值依次變小，可見Mig-7蛋白表達(dá)受到抑制，其中10 μL/mL濃度組的抑制作用比5 μL/mL更明顯，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：CLSO 0 μL/mL；2：CLSO 5 μL/mL；3：CLSO 10 μL/mL圖4　不同濃度CLSO對(duì)HCT116細(xì)胞Mig-7蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of CLSO on the expression levels of Mig-7 protein in HCT116 cells

3　討論

薏苡仁是一味傳統(tǒng)中藥材，在消化系統(tǒng)腫瘤尤其是腸癌中藥處方中被廣泛應(yīng)用，對(duì)該藥抗癌成分和機(jī)制的研究日趨增加。薏苡仁油即是從薏苡仁中提取的脂質(zhì)。經(jīng)過大量的臨床觀察和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該藥具有多方面的抗癌功效，如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、對(duì)放化療減毒增效、調(diào)整患者的免疫能力等等。由于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴血液供應(yīng)，因此如何阻斷腫瘤血供已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。之前曾有學(xué)者通過薏苡仁油作用于主動(dòng)脈環(huán)研究該藥對(duì)血管生成的影響，還有學(xué)者研究該藥對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和VEGF表達(dá)的影響[8]，均證實(shí)薏苡仁油對(duì)血管形成存在抑制，這也可能是其抗癌機(jī)制之一。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為輸送血液的管道必須有內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成，即經(jīng)典的內(nèi)皮依賴性血管。然而1999年Maniotis在研究黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新型的腫瘤供血管道，它不依賴內(nèi)皮細(xì)胞，而由腫瘤細(xì)胞通過自身表型和胞外基質(zhì)重塑圍成，遂將之命名為血管生成擬態(tài)(VM)。后來的研究證實(shí)腸癌中也存在VM結(jié)構(gòu)，并且與腸癌的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)[12]。VM作為傳統(tǒng)微循環(huán)結(jié)構(gòu)的補(bǔ)充，和內(nèi)皮依賴性血管一起為腸癌的生長和轉(zhuǎn)移提供必要條件[13]。因此本文主要觀察薏苡仁油對(duì)VM的影響，以從抑制腸癌微循環(huán)的角度了解薏苡仁油的抗腫瘤機(jī)制。由于薏苡仁油的細(xì)胞毒作用可在體外培養(yǎng)環(huán)境中引起細(xì)胞死亡導(dǎo)致VM無法形成，所以文中采用MTT法測定細(xì)胞抑制率為10%時(shí)的濃度為無毒濃度，分組所選濃度均小于無毒濃度，以排除干擾。同時(shí)采用三維培養(yǎng)模擬腸癌細(xì)胞在體內(nèi)生長的微環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薏苡仁油體外可以抑制腸癌VM形成，增大劑量可提高抑制效果(圖2)。

VM形成需要經(jīng)歷一個(gè)復(fù)雜的過程。腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高度的可塑性，經(jīng)過去分化后具備內(nèi)皮細(xì)胞表型，再經(jīng)過遷移、變形、分解并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，最終形成和宿主循環(huán)系統(tǒng)相連接[14]。由此可見，細(xì)胞的遷移能力決定著最終VM結(jié)構(gòu)的形成。本實(shí)驗(yàn)通過劃痕實(shí)驗(yàn)初步觀察了薏苡仁油對(duì)HCT116細(xì)胞在三維培養(yǎng)時(shí)遷移能力的影響，結(jié)果顯示經(jīng)過薏苡仁油作用后細(xì)胞遷移能力受到抑制，這在一定程度上可以解釋薏苡仁油抑制VM形成的機(jī)制。而這一系列過程又受到眾多信號(hào)通路和分子的調(diào)控，如缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)、黏著斑激酶(FAK)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、遷移誘導(dǎo)蛋白7(Mig-7)，層黏蛋白(LN)等[9]。其中Mig-7是一種富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，它分布在細(xì)胞膜上和內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白相鄰，可促進(jìn)層黏蛋白5γ2片段形成，增加基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)，這些均是VM形成的重要條件，因此在VM形成過程中起重要調(diào)控作用[15]。本文采用免疫印跡法檢測HCT116細(xì)胞經(jīng)CLSO干預(yù)后Mig-7的表達(dá)情況(圖3)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CLSO可以抑制Mig-7的表達(dá)，初步推測CLSO抑制Mig-7表達(dá)也可能是其影響VM形成的原因之一。

綜合以上結(jié)果和分析，CLSO抗腫瘤的作用機(jī)制是多方面，多靶點(diǎn)的。不同于當(dāng)前抗腫瘤藥物研制追求單一靶點(diǎn)，我國天然抗腫瘤藥物研發(fā)成果多數(shù)具有多靶點(diǎn)多機(jī)制的特點(diǎn)，這和腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制相契合。雖然針對(duì)單一靶點(diǎn)的效果不突出，但多靶點(diǎn)的干預(yù)方式能有效防止腫瘤耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，且副作用較小，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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(2015-06-19收稿)

Effect of Coix Seed Oil on the Vasculogenic Mimicry Formation of HCT116 Cells

Yu Tao，Liu Li，Lv Xiuweietal

DepartmentofOncology，WuhanCentralHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430014，China

ObjectiveTo investigate the effect of coix seed oil(CLSO)on the expression of migration-induced protein-7(Mig-7)and migration of HCT116 colorectal cancer cells in an attempt to examine the possible mechanism underlying the effect of CLSO on vasculogenic mimicry(VM)formation.MethodsMTT assay was used to detect the non-toxic concentrations of CLSO to HCT116 cells(the inhibition rate<10%).CLSO at non-toxic concentrations was added to HCT116 cells in 3D cultureinvitroto observe the effect of CLSO on VM formation.Wound healing assay was used to detect the ability of cell migration.And the expression levels of Mig-7 proteins were measured by Western blotting.ResultsThe VM structures developed in CLSO-treated HCT116 cells in 3D culture were much less than those in control group.In wound healing test，the average migration distance was decreased in 5 μL/mL and 10 μL/mL groups progressively.The migration rates were 17.07%，9.19% and 2.10% in 5 μL/mL CLSO，10 μL/mL CLSO and control groups，respectively，with the difference found between the two experimental groups and the control group(P<0.05).Western blotting showed the ratio of the gray value of the experimental group against that of the internal reference was smaller than that of the control group，indicating that the Mig-7 expression was inhibited by CLSO.The effect was more obvious in 10 μL/mL CLSO group than in 5 μL/mL CLSO group(P<0.05).ConclusionCLSO can inhibit the VM formationinvitroby down-regulating the cell migration and expression of Mig-7 protein.

coix seed oil；human colon cancer；vasculogenic mimicry；cell migration；migration-induced protein-7

，Corresponding author，E-mail：13607169125@139.com

R735.35

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.015

*武漢市衛(wèi)計(jì)委科研資助項(xiàng)目(No.WZ14Z17，No.WZ15Z07)

余濤，男，1986年生，博士研究生，E-mail：yutao1986cn@163.com