p67蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義

謝二娟，　玉素甫·買買提，　方　華△

1湖北省醫(yī)學(xué)會(huì)，武漢　4300712華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢　430022

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p67蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義

謝二娟1，玉素甫·買買提2，方華1△

1湖北省醫(yī)學(xué)會(huì)，武漢4300712華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢430022

目的分析p67蛋白在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)及預(yù)后意義。方法共納入90例胰腺導(dǎo)管腺癌患者，每位患者具有對(duì)應(yīng)的癌組織和癌旁組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行芯片染色，檢測(cè)組織芯片中p67的表達(dá)，分析p67的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析及Cox回歸分析探討p67的 預(yù)后價(jià)值。結(jié)果90例胰腺癌組織中p67陽性表達(dá)率為57.8%。p67陽性表達(dá)與腫瘤大小及臨床分期顯著相關(guān)(均P<0.05)。p67在癌旁組織的陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期具有顯著相關(guān)性(均P<0.05)。胰腺癌組織p67陽性組患者的總生存期(OS)短于p67陰性組患者(P<0.05)，在癌旁組織中有相同趨勢(shì)。Cox多因素分析顯示癌旁組織p67陽性為胰腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立因素。結(jié)論p67陽性表達(dá)預(yù)示胰腺癌的不良預(yù)后。p67抑制劑可能會(huì)改善胰腺癌患者的預(yù)后。

胰腺癌;p67;預(yù)后;組織芯片

胰腺癌是侵襲能力強(qiáng)，極易轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤。早期行根治性手術(shù)是可能治愈的唯一希望，但多數(shù)患者在發(fā)病早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，術(shù)后5年生存率并不高[1]。目前，尋找早期診斷指標(biāo)，并為生物靶向治療提供依據(jù)是胰腺癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[2]。c-myc原癌基因參與細(xì)胞增殖、分化，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]，其編碼的蛋白產(chǎn)物p67與細(xì)胞中Vav1相互作用激活Rac，繼而共激活還原性輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)，參與細(xì)胞氧代謝，活性氧的大量產(chǎn)生致細(xì)胞超氧，降低吞噬細(xì)胞的自我監(jiān)視作用[4]。體外研究結(jié)果顯示，p67蛋白與急性白血病、腦腫瘤、結(jié)腸癌等多種腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[5-7]。本研究采用組織芯片及免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測(cè)胰腺癌組織中p67蛋白的表達(dá)，探討p67與胰腺癌病理參數(shù)的相關(guān)性，考察其是否可以作為胰腺癌的預(yù)后指標(biāo)。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

組織芯片購自上海生物芯片工程中心。收集90例胰腺癌患者的完整臨床病理資料。本組患者手術(shù)前影像學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，均未接受放射治療、化學(xué)治療及其他抗腫瘤治療。手術(shù)后病理診斷均為胰腺導(dǎo)管腺癌，具有3～7年的隨訪資料，平均隨訪時(shí)間為(45.0±2.9)個(gè)月?？偵嫫?overall survival，OS)定義為:患者接受手術(shù)治療到患者死亡或者末次隨訪時(shí)間?；颊咚劳鲈蚺懦且认侔┑乃劳?。

1.2免疫組織化學(xué)染色及評(píng)分判定

鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新生物公司。組織芯片厚度4 μm，貼附于載玻片上，60℃充分烤片。操作步驟：①二甲苯脫蠟后梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5 min，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，水浴抗原修復(fù)20 min，5%正常山羊血清封閉10 min；②滴加p67抗體，4℃冰箱過夜后PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗后37℃恒溫箱中孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min，生物素-親和素-酶結(jié)合物(ABC)復(fù)合物30 min，PBS洗3次，每次3 min；③滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水后制成中性樹脂封片。干片后送到上海芯超公司進(jìn)行切片掃描。免疫組織化學(xué)結(jié)果由2位病理科醫(yī)生采用雙盲法獨(dú)立對(duì)所有標(biāo)本進(jìn)行評(píng)分判定。細(xì)胞核染色呈棕黃色顆粒為主定義為p67陽性。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法分析組間差異，應(yīng)用Kaplan-Meier法和Log-rank繪制、檢驗(yàn)生存曲線，應(yīng)用COX回歸進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素及多因素分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件完成。

2　結(jié)果

2．1p67表達(dá)與胰腺癌及癌旁組織臨床病理特征的相關(guān)性

本研究共納入90例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的癌組織，根據(jù)p67的免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)評(píng)分結(jié)果分為p67陽性和陰性組，見表1。其中52例p67陽性，38例p67陰性，p67陽性率 57.8%。p67陽性表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、病理分級(jí)、血管侵犯無顯著相關(guān)性 (均P>0.05)。淋巴結(jié)陽性轉(zhuǎn)移的患者p67高表達(dá)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。p67陽性表達(dá)組中腫瘤大小較陰性組大(P<0.05)，臨床分期較晚(P<0.01)。在癌旁組織中，p67高表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、病理分級(jí)、血管侵犯均無顯著相關(guān)性，p67陽性組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者明顯增多(P<0.05)，癌旁組織中p67高表達(dá)的患者通常臨床分期較晚(P<0.01)。

2．2胰腺癌患者的生存分析

應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)差異性。生存分析結(jié)果顯示癌組織中p67陽性表達(dá)組患者OS較陰性組顯著縮短(P<0.05)，見圖1。在癌旁組織中，生存分析呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)，p67陽性患者比p67陰性患者OS明顯縮短(P<0.01)，見圖2。COX單因素分析結(jié)果顯示胰腺癌和癌旁組織p67的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期以及胰腺癌預(yù)后相關(guān)，而與年齡、病理分級(jí)、血管侵犯與否、腫瘤大小等因素?zé)o相關(guān)關(guān)系。多因素分析結(jié)果揭示p67在癌旁組織中的高表達(dá)是胰腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素，見表2。

表1　p67的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

續(xù)表1

圖1　p67在胰腺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系Fig.1 Relationship between the p67 expression and prognosis in pancreas cancer tissues

圖2　p67在胰腺癌癌旁組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Relationship between the p67 expression and prognosis in paracancerous tissues of pancreas cancer

臨床病理特征分類計(jì)數(shù)單因素HRP值多因素HRP值性別女331.7130.062男57年齡(歲)<50421.0840.756≥5048腫瘤部位胰頭63-0.794胰體10胰尾17腫瘤大小T16-0.740T269T3～T415病理分級(jí)G11-0.169G264G325淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移否541.7470.0341.2170.626是36血管侵犯否381.2880.332是52臨床分期Ⅰ期41-0.025-0.380Ⅱ期47Ⅲ期2癌組織p67表達(dá)陰性381.7600.0411.2950.392陽性52癌旁組織p67表達(dá)陰性542.9690.0002.6480.001陽性36

3　討論

在腫瘤細(xì)胞中，TGIF通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)NOX2/p67(PHOX)絡(luò)合物激活，促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、提高了侵襲能力。p67沉默可以抑制TGIF誘導(dǎo)的癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移[8-9]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p67蛋白過度表達(dá)具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長、浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。本研究結(jié)果顯示，癌組織和癌旁組織中p67陽性患者的OS較p67陰性患者短，說明p67陽性腫瘤具有侵襲性。在p67陽性表達(dá)組，癌組織中腫瘤體積明顯增大，臨床分期明顯較晚。這些結(jié)果進(jìn)一步說明在p67表達(dá)陽性的腫瘤中，腫瘤細(xì)胞侵襲性更強(qiáng)。在癌旁組織中，p67表達(dá)陽性率與淋巴結(jié)發(fā)生腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的比例具有顯著相關(guān)性，與腫瘤體積不具有相關(guān)性，可能由于取材位置與腫瘤之間距離的差異相關(guān)。而病理分級(jí)、血管侵犯情況與p67表達(dá)陽性率不具有相關(guān)性，可能與p67不參與組織學(xué)分化及血管浸潤有關(guān)。多因素Cox回歸分析顯示癌旁組織中p67陽性表達(dá)是胰腺癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能癌旁組織p67高表達(dá)的胰腺癌體內(nèi)已經(jīng)發(fā)生微轉(zhuǎn)移。

本研究顯示癌組織中高表達(dá)的p67促進(jìn)癌細(xì)胞的遷徙、浸潤和轉(zhuǎn)移，使其具有更強(qiáng)的侵襲性。因此癌旁組織中p67表達(dá)的陽性情況可作為一個(gè)預(yù)后指標(biāo)，指導(dǎo)早期胰腺癌的診斷和治療。抑制p67的表達(dá)，可作為未來胰腺導(dǎo)管腺癌生物靶向治療的方向，值得進(jìn)一步研究。

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(2016-04-13收稿)

Prognostic Value of p67 Expression in Pancreas Cancer

Xie Erjuan1，Yusufu·Maimaiti2，F(xiàn)ang Hua1△

1MedicalAssociationofHubeiProvince，Wuhan430071，China2DepartmentofBreastandThyroidSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

ObjectiveTo investigate the p67 expression in specimens of pancreas cancer and corresponding paracancerous tissues and its prognostic value.MethodsThe p67 expression in pancreas adenocarcinoma patients was detected by immunohistochemistry.The relationship between the p67 expression and clinicopathological features of pancreas cancer was analyzed.Survival analysis and the COX regression hazards model were used to study the prognostic value of p67 expression in pancreas cancer.ResultsThe p67 positive expression rate in 90 pancreas cancer patients was 57.8%.The p67 expression was significantly associated with tumor size and clinical stage (P<0.05).The overall survival (OS) in patients positive for the p67 expression was shorter than in those negative for the p67 expression (P<0.05).Multivariate analysis demonstrated that the p67 expression was independent predictor of poor prognosis in patients with pancreas cancer.ConclusionThe p67 expression predicts a poor prognosis in patients with pancreas cancer.Overexpression of p67 shows a high probability of lymphatic metastasis in pancreas cancer.The p67 inhibition therapy may be necessary to improve the poor prognosis in patients with pancreas cancer.

pancreas cancer;p67;prognosis;tissue microarray

，Corresponding author，E-mail：3044402087@qq.com

R735.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.021

謝二娟，女，1976年生，醫(yī)學(xué)碩士，副主任技師，E-mail：xzz07@126.com