杏仁核ERK在芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏中的作用及機(jī)制*

羅　瓊，　尹平平，　羅　放

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢　430030

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杏仁核ERK在芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏中的作用及機(jī)制*

羅瓊，尹平平，羅放△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，武漢430030

目的探討細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)在芬太尼誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏(OIH)中的作用及機(jī)制。方法雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為正常組、OIH組、U0124組和U0126組。于右側(cè)中央杏仁核(CeA)置管后，后3組皮下給予芬太尼制作OIH模型，成功后向CeA內(nèi)分別注射0.3 μL 50% DMSO、1.5 nmol U0124(無(wú)藥理活性的U0126結(jié)構(gòu)類似物)和1.5 nmol U0126(ERK抑制劑)；正常組皮下給予等容量生理鹽水，CeA內(nèi)注射0.3 μL 50% DMSO。檢測(cè)芬太尼或生理鹽水注射前、注射后7 h及導(dǎo)管內(nèi)給藥0.5 h后機(jī)械縮足閾值和熱縮足潛伏期，隨后處死大鼠，取右側(cè)中央杏仁核組織采用Western blot法檢測(cè)p-ERK1/2的表達(dá)。另取雄性SD大鼠8只，隨機(jī)分為OIH2組和正常2組，前者皮下注射芬太尼制作OIH模型，后者皮下注射生理鹽水作為對(duì)照，制作腦片后記錄各組右側(cè)CeA區(qū)神經(jīng)元U0126(10 μmol/L)使用前后的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)。結(jié)果與正常組比較，OIH組大鼠機(jī)械縮足閾值和熱縮足潛伏期均降低(均P<0.05)，CeA區(qū)p-ERK2表達(dá)增加(P<0.05)，U0126，而非U0124，可翻轉(zhuǎn)上述變化(均P<0.05)；腦片電生理記錄示OIH2組mEPSCs幅值及頻率均增加(均P<0.05)，且可被U0126逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。結(jié)論p-ERK2對(duì)OIH的形成至關(guān)重要，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)杏仁核神經(jīng)元間的突觸傳遞有關(guān)。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；杏仁核；突觸可塑性；芬太尼；痛覺(jué)過(guò)敏

阿片類藥物是治療急、慢性疼痛的代表性藥物，其副作用之一，阿片誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏(opioid-induced hyperalgesia，OIH)是臨床亟待解決的問(wèn)題。研究表明，中央杏仁核(CeA)不僅接受來(lái)自脊髓和腦干等多個(gè)部位的疼痛信息[1]，慢性疼痛狀態(tài)下其自身突觸傳遞還可發(fā)生可塑性變化。而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)是觸發(fā)突觸可塑性變化的重要介質(zhì)[2]。因此，本研究選取CeA為研究部位，探討ERK在阿片誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏中的作用及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，體重60～100 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，室溫飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，光照與黑暗時(shí)間12 h∶12 h。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為正常組、OIH組、U0124組和U0126組，共4組，均杏仁核CeA置管，恢復(fù)1周后，后3組分別皮下給予芬太尼制作OIH模型，成功后向CeA內(nèi)分別注射0.3 μL 50% DMSO、1.5 nmol U0124和1.5 nmol U0126；正常組皮下給予等容量生理鹽水，后向CeA內(nèi)注射0.3 μL 50% DMSO。另取雄性SD大鼠8只，隨機(jī)分為OIH2組和正常2組，前者給予芬太尼制作OIH模型，后者皮下注射生理鹽水作為對(duì)照，在給予芬太尼，制作OIH模型成功后，利用全細(xì)胞腦片膜片鉗技術(shù)分別記錄各組CeA區(qū)神經(jīng)元給予U0126(10 μmol/L)前后的微小興奮性突觸后電流(mEPSCs)。

1.3CeA區(qū)立體定位置管給藥

立體定位置管給藥裝置購(gòu)于中國(guó)深圳市瑞沃德生命科技有限公司。參照文獻(xiàn)[3]的方法行立體定位置管，以10%的水合氯醛3 mL/kg腹膜腔注射麻醉大鼠，將其固定在立體定位儀(Stoelting公司，美國(guó))上，消毒皮膚后，暴露顱骨前囟及矢狀縫，在右側(cè)CeA區(qū)(參考文獻(xiàn)[4]坐標(biāo)：前囟后2.2 mm，中線旁開(kāi)4.2 mm，顱骨下7.8 mm)植入帶管芯的套管，并用牙科骨水泥固定。手術(shù)后恢復(fù)1周再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4藥物配制

U0124、U0126均購(gòu)于美國(guó)Cayman chemical公司，藥物的配制方法參照文獻(xiàn)[5]。臨用前溶于含50% DMSO的生理鹽水中。

1.5OIH動(dòng)物模型建立

枸櫞酸芬太尼購(gòu)于湖北省宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)：1130411)，臨用前溶于0.9%的生理鹽水中。采用文獻(xiàn)[6]的方法建立OIH模型。在大鼠頸部皮下注射芬太尼，每次60 μg/kg，間隔15 min，共4次，累積藥量240 μg/kg。對(duì)照組在大鼠頸部皮下注射等容量生理鹽水。

1.6疼痛行為學(xué)檢測(cè)

于芬太尼或生理鹽水注射前(0 h)、注藥后7 h(7 h)及導(dǎo)管內(nèi)給藥0.5 h后(給藥0.5 h后)測(cè)機(jī)械縮足閾值和熱縮足潛伏期。采用文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)左足機(jī)械縮足閾值，將大鼠靜置于金屬籠內(nèi)30 min后，用不同壓力的von Frey絲(North Coast公司，美國(guó))垂直刺激鼠足掌面，力度以von Frey絲輕微彎曲為準(zhǔn)，持續(xù)10 s或直至出現(xiàn)縮足反應(yīng)。若出現(xiàn)縮足反應(yīng)，記為陽(yáng)性。采用up-and-down方法計(jì)算50%縮足反應(yīng)閾值。采用熱痛刺激儀(BME-410C，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所)測(cè)定熱縮足潛伏期：將大鼠靜置于底部為玻璃板的透明小室中，靜置30 min后，輻射熱對(duì)準(zhǔn)大鼠左足掌正中照射，自動(dòng)記錄縮足反應(yīng)的潛伏期作為熱縮足潛伏期。截止時(shí)間為15 s，以免造成輻射損傷。

1.7中央杏仁核p-ERK表達(dá)的檢測(cè)

痛閾測(cè)定完畢后立即處死大鼠，迅速取出右側(cè)中央杏仁核組織凍存于-80℃?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[8]用Western blot法檢測(cè)中央杏仁核p-ERK的表達(dá)。將組織稱重后加入適量的含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天公司，中國(guó))，勻漿后，12 000 g，4 ℃離心10 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入SDS-PAGE上樣緩沖液，95 ℃煮沸8～10 min使蛋白變性，制備SDS-PAGE凝膠(10%)，電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫振蕩封閉1 h后，加入封閉液稀釋的單克隆抗體兔抗p-ERK(1∶2 000稀釋，CST，美國(guó))和小鼠抗GAPDH(1∶500，武漢博士德生物工程有限公司)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，加入TBST稀釋的HRP-山羊抗兔和HRP-山羊抗小鼠的二抗(1∶10 000，武漢博士德生物工程有限公司)，室溫孵育2 h，洗膜后在避光條件下將ECL試劑盒中的A、B兩種試劑等體積混合，振蕩混勻后均勻加到膜上，用化學(xué)發(fā)光凝膠圖像系統(tǒng)拍照。p-ERK1/2表達(dá)以p-ERK1/2吸光度值與GAPDH吸光度值的比值表示。

1.8全細(xì)胞膜片鉗記錄

用振動(dòng)切片機(jī)(LEICA VT1000S)將取自O(shè)IH2組和正常2組含有CeA區(qū)的右腦組織塊冠狀切成厚度為350 μm的腦片。切片溶液為4℃，溶液組成為(mmol/L)：213蔗糖，3 KCl，1 NaH2PO4，0.5 CaCl2，5 MgCl2，26 NaHCO3和10葡萄糖，將所得腦片在人工腦脊液(ACSF)中25 ℃孵育至少1 h，ACSF組成為(mmol/L)：125 NaCl，5 KCl，1.2 NaH2PO4，2.6 CaCl2，1.3 MgCl2，26 NaHCO3和10葡萄糖。切片液及腦脊液在使用時(shí)均為氧飽和溶液，且pH=7.2～7.4，滲透壓為290～310 mOsm/L。在持續(xù)灌流ACSF，溫度控制在31℃，前置電壓為-70 mV條件下記錄mEPSCs。膜片鉗放大器為HEKA EPC-10(Molecular Devices)，記錄軟件為patchmaster(Molecular Devices)，應(yīng)用紅外線微分干涉相差顯微鏡在可視化模式下記錄CeA區(qū)神經(jīng)元mEPSCs。記錄電極為玻璃微電極(WPI)，電極內(nèi)液組成為(mmol/L)：145 KCl，5 NaCl，10 HEPES，5 EGTA，4 Mg-ATP，0.3 Na3-GTP。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1杏仁核注射U0126可治療芬太尼誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏

與正常組相比，OIH組機(jī)械縮足閾值和熱縮足潛伏期降低(均P<0.05)，CeA區(qū)給予U0126(而非U0124)可翻轉(zhuǎn)OIH組所致的上述改變(均P<0.05)(表1)。

表1　各組不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛和熱痛對(duì)比±s)

與正常組比較，aP<0.05；與OIH組比較，bP<0.05

2.2U0126可阻斷芬太尼誘導(dǎo)的杏仁核p-ERK2過(guò)度表達(dá)

與正常組比較，OIH組和U0124組大鼠中央杏仁核p-ERK2表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)，UO126組p-ERK2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與OIH組比較，U0126組p-ERK2表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，U0124組p-ERK2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組p-ERK1表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(圖1)。

A：Western blot檢測(cè)；B：p-ERK1/2相對(duì)吸光度；與正常組比較，*P<0.05圖1　各組CeA區(qū)p-ERK1/2表達(dá)的比較Fig.1 Comparison of p-ERK1/2 expression in CeA area between groups

2.3U0126對(duì)OIH大鼠杏仁核突觸傳遞的影響

與正常2組相比，OIH2組腦片全細(xì)胞膜片鉗記錄的mEPSCs的電流幅值及頻率均增加(均P<0.05)，但可被U0126逆轉(zhuǎn)(均P<0.05)，U0126對(duì)正常2組大鼠的mEPSCs無(wú)影響(圖2)。

A：20 s mEPSCs典型記錄；B，C：mEPSCs的幅值和頻率統(tǒng)計(jì)圖；*P<0.05圖2　ERK抑制劑U0126對(duì)CeA區(qū)神經(jīng)元mEPSCs的影響Fig.2 Effect of the ERK inhibitor U0126 on mEPSCs in CeA neurons

3　討論

本研究采用行為學(xué)測(cè)試、Western blot和腦片電生理技術(shù)探討杏仁核中ERK在OIH中的作用及機(jī)制。結(jié)果證明，給大鼠重復(fù)注射芬太尼后可誘導(dǎo)典型的痛覺(jué)過(guò)敏，這種痛覺(jué)過(guò)敏可被CeA區(qū)注射的ERK的抑制劑U0126逆轉(zhuǎn)，Western blot檢測(cè)證實(shí)OIH痛覺(jué)過(guò)敏與CeA區(qū)p-ERK2激活相關(guān)，為了進(jìn)一步探究ERK引起痛覺(jué)過(guò)敏的機(jī)制，研究采用腦片電生理技術(shù)記錄CeA區(qū)神經(jīng)元的mEPSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OIH時(shí)mEPSCs的電流幅值和頻率均增加，且能被急性給予的U0126逆轉(zhuǎn)。

杏仁核因其在疼痛調(diào)制中的重要作用，已被部分學(xué)者稱為“傷害性杏仁核”[9]，Schweinhardt等[10]研究表明，傷害性疼痛信息經(jīng)過(guò)CeA可上行傳導(dǎo)至前額皮質(zhì)(PFC)和前扣帶回皮質(zhì)(ACC)等腦區(qū)，下行經(jīng)中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)，延髓頭端腹內(nèi)側(cè)部(RVM)傳至脊髓背角調(diào)制傷害性疼痛的防御反應(yīng)。Carrasquillo等[11]的研究發(fā)現(xiàn)杏仁核ERK1和ERK2都參與調(diào)制甲醛溶液誘發(fā)的炎性痛大鼠的機(jī)械痛，但不影響熱痛[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，杏仁核p-ERK2而不是ERK1參與了阿片誘發(fā)的機(jī)械痛和熱痛的痛覺(jué)過(guò)敏的維持，且抑制杏仁核ERK活化可逆轉(zhuǎn)OIH。

Ren等[12]認(rèn)為mEPSCs的頻率反映突觸前膜遞質(zhì)釋放概率，而mEPSCs的幅值反映作用于突觸后膜的神經(jīng)遞質(zhì)量子化釋放的多少。本研究中，OIH時(shí)，mEPSCs的頻率和幅值均增加，表明，OIH時(shí)，杏仁核神經(jīng)元的突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放概率可能增大，且突觸后膜的神經(jīng)遞質(zhì)量子化釋放可能增加，由此導(dǎo)致杏仁核神經(jīng)元的突觸傳遞功能增強(qiáng)，杏仁核神經(jīng)元可能發(fā)生了功能上的突觸可塑性。而在給予ERK抑制劑U0126后，mEPSCs的頻率和幅值均降至正常，而U0126不影響對(duì)照組的mEPSCs。由此，我們可以推斷，OIH時(shí)，杏仁核神經(jīng)元的突觸傳遞功能增強(qiáng)與ERK的活化有關(guān)，這可能是ERK調(diào)制阿片誘發(fā)的痛覺(jué)過(guò)敏的作用機(jī)制之一。Woolf等[13]總結(jié)了大量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NMDA受體在傷害性疼痛的中樞敏化誘導(dǎo)中具有重要作用，值得注意的是，傷害性刺激誘導(dǎo)的NR1亞基的磷酸化需要ERK的參與，同時(shí)ERK還與脊髓Ⅱ?qū)由窠?jīng)元緩激肽誘導(dǎo)的NMDA電流的增強(qiáng)及AMPA的功能依賴性位點(diǎn)的激活有關(guān)。我們的研究結(jié)果也證實(shí)ERK參與調(diào)節(jié)OIH大鼠杏仁核突觸可塑性，但本研究中，ERK是否通過(guò)NMDA受體或AMPA受體增強(qiáng)OIH大鼠杏仁核的神經(jīng)元突觸傳遞功能，尚待進(jìn)一步探究。

綜上所述，杏仁核ERK對(duì)OIH的形成至關(guān)重要，其機(jī)制可能與其增強(qiáng)神經(jīng)元間的突觸傳遞有關(guān)。

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(2016-02-22收稿)

Role of Amygdala ERK in Fentanyl-induced Hyperalgesia in Rats

Luo Qiong，Yin Pingping，Luo Fang△

DepartmentofAnesthesiology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo explore the role of extracellular signal-regulated kinase(ERK)in amygdala in fentanyl-induced hyperalgesia and the possible mechanism.MethodsA total of 24 healthy male Sprague-Dawley rats，weighing 60—100 g，were implanted with a cannula in the right central nucleus of amygdala(CeA)，and divided into 4 groups：normal group，opioid-induced hyperalgesia(OIH)group，U0124 group and U0126 group.Rats in the latter three groups were subcutaneously injected with fentanyl to induce OIH according to a standard protocol，then injected via the cannula with 50% DMSO in OIH group，1.5 nmol U0124(an negative structural control analog of U0126)in U0124 group，and 1.5 nmol U0126(an ERK inhibitor)in U0126 group.Animals in the normal group were subcutaneously injected with saline，and then administered 0.3 μL of 50% DMSO through the cannula.The mechanical paw withdrawal threshold(PWT)and thermal paw withdrawal latency(PWL)were tested before OIH induction，7 h after fentanyl or saline injection and 0.5 h after CeA drug administration.After the last measurement of pain threshold，the rats were sacrificed，and right CeA tissues were sampled for detection of the expression of phosphorylated ERK1/2(p-ERK1/2)by Western blotting.Another 8 SD male rats were obtained and randomly divided into OIH2group and normal2group.Rats in OIH2group were induced to develop OIH with fentanyl and those in the normal2group were injected with saline as control group.Whole cell voltage-clamp recordings were conducted to detect miniature excitatory postsynaptic currents(mEPSCs)from visually identified right CeA neurons before and after the use of U0126 in brain slices with DIC-IR videomicroscopy.ResultsPWT and PWL were sharply decreased，and the expression of p-ERK2 in CeA was significantly increased in OIH group as compared with those in normal group(P<0.05).Intra-CeA injection of U0126，but not U0124，reversed both behaviors of hyperalgesia and molecular change of ERK(P<0.05).Both the frequency and amplitude of mEPSCs recorded on CeA neurons were significantly increased in OIH2group when compared with those in normal2group(P<0.05)，which were completely reversed by administration of U0126(P<0.05).Conclusionp-ERK2 may play a key role in the development of fentanyl-induced hyperalgesia by increasing the synaptic transmission in amygdala.

extracellular signal-regulated kinase；amygdala；synaptic plasticity；fentanyl；hyperalgesia

，Corresponding author，E-mail:1185045627@qq.com

R741.041

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.04.003

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81271234)

羅瓊，女，1986年生，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail:rojoan198617@163.com，現(xiàn)址:武漢大學(xué)中南醫(yī)院麻醉科，武漢 430071