HPLC法同時(shí)測(cè)定玉泉丸中5個(gè)成分的含量

李少光， 蔡林雪， 姚　宏， 黃麗英， 陳　冰， 林新華

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HPLC法同時(shí)測(cè)定玉泉丸中5個(gè)成分的含量

李少光1， 蔡林雪2， 姚宏1， 黃麗英1， 陳冰1， 林新華1

目的建立同時(shí)測(cè)定玉泉丸中5個(gè)成分(葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸)的方法。方法采用反相高效液相色譜-二極管陣列紫外檢測(cè)器(RP-HPLC-DAD)，在UltimateTMXB-C18色譜柱(250×4.6 mm,5 μm)上，優(yōu)化獲得以乙腈(B)-水(0.2%甲酸)(A)為流動(dòng)相的梯度洗脫條件；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254，280和340 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果5個(gè)活性成分的分離度良好，在各自測(cè)定的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r≥0.997)，平均加樣回收率為87.5%～104.3%。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤3.3%(n=6)。結(jié)論本方法操作簡便、快速，具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，可為玉泉丸質(zhì)量控制提供定量分析方法。

玉泉丸； 葛根素； 甘草； 異黃酮類； 甘草酸； 色譜法, 高壓液相

玉泉丸，源于《仁齋直指》(宋代)、《古今醫(yī)鑒》(明代)和《種福堂公選良方》(清代)的三朝名方“玉泉散”，是由葛根、天花粉、地黃、麥冬、五味子及甘草六味中藥組方而成的現(xiàn)代制劑——濃縮丸。主治“消渴”癥(胰島功能減退的糖尿病)，具有辨因求治，對(duì)證治療的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。玉泉丸屬國家中藥保護(hù)品種、國家醫(yī)保甲類用藥，但衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中未收載其含量測(cè)定項(xiàng)[1]，且已有文獻(xiàn)檢測(cè)指標(biāo)單一(1～2個(gè)成分)或分析耗時(shí)較長[2-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在建立同時(shí)測(cè)定玉泉丸中5個(gè)活性成分葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸含量的高效液相色譜方法(其中葛根素和大豆苷元為君藥葛根中已報(bào)道的主要降血糖藥效成分；甘草苷、異甘草苷和甘草酸歸屬使藥甘草，也有明確的降血糖活性報(bào)道[5-8])，為玉泉丸的質(zhì)量控制提供更簡便、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)，也為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供方法學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1儀器和試劑高效液相色譜儀(Agilent 1260型，美國安捷倫科技有限公司)，配備自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元低壓混合泵、二極管陣列紫外檢測(cè)器。色譜柱(UltimateTMXB-C18，250 × 4.6 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)。電子天平(BS124S，德國賽多利斯集團(tuán))，數(shù)控超聲微波清洗器(KQ-250DE型，功率250 W，頻率40 KHz，昆山市超聲儀器有限公司)。乙腈(美國Sigma公司)、甲酸(上海晶純生化科技股份有限公司)、雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制，其他試劑均為分析純。葛根素對(duì)照品(批號(hào)：MUST-14061203，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院與北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)研究公司)；甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：0633)、異甘草苷對(duì)照品(批號(hào)：0401)和大豆苷元對(duì)照品(批號(hào)：1302)均購自北京索萊寶科技有限公司；甘草酸對(duì)照品(批號(hào)：MUST-14081812，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院與北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)研究公司),純度均≥98%。玉泉丸濃縮丸(成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司，批號(hào)121103，130103和140301)購自福建省福州市回春藥店。

1.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取葛根素20 mg、甘草苷10 mg、異甘草苷10 mg、大豆苷元20 mg和甘草酸20 mg，分別置于2 mL容量瓶中，葛根素加50%甲醇，甘草苷加甲醇，異甘草苷、大豆苷元及甘草酸加無水乙醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度分別為10，5，5，10和10 mg/mL。

1.3供試品溶液的制備精密稱定玉泉丸6 g，置于具塞錐形瓶，加水10 mL，震蕩10 min使成混懸液，加入40 mL甲醇，稱總質(zhì)量后超聲提取60 min(功率250 W，頻率40 kHz)，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，靜置10 min，取上清液13 mL于離心管中加蓋離心10 min(3 000 r/min)，用0.45 μm微孔濾膜過濾后，精密移取10 mL置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用甲醇復(fù)溶后定容于10 mL容量瓶。進(jìn)樣分析前微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續(xù)濾液為供試品溶液。

1.4陰性對(duì)照樣品的制備根據(jù)待測(cè)目標(biāo)組分歸屬，葛根素和大豆苷元為葛根中的主要成分，甘草苷、異甘草苷和甘草酸為甘草中的主要成分，故進(jìn)行專屬性試驗(yàn)時(shí)，只需設(shè)定不含葛根組和不含甘草組。由于玉泉丸為國家中藥保護(hù)品種，其組方劑量尚未公開，參照其古方“玉泉散”中各味藥組方劑量范圍(10～60 g)，設(shè)定天花粉、地黃、麥冬和五味子各30 g，再加入葛根或甘草30 g，組成上述2組藥材缺失的陰性樣品。分別剪碎后，用250 mL 80%的甲醇溶液浸泡12 h，參照1.3項(xiàng)下提取方法制備。

1.5色譜條件在高效液相色譜儀(配備四元低壓混合泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器)上，采用UltimateTMXB-C18色譜柱，以乙腈(B)-水(0.2%甲酸)(A)為流動(dòng)相，線性洗脫梯度為B：12%～34%(0～8 min)，34%等度(8～15 min)，34%～53%(15～16 min)，53%等度(16～22 min)，53%～99%(22～22.1 min)，99%等度(22.1～27 min)，99%～12%(27～27.1 min)，12%等度(27.1～33 min)，平衡時(shí)間為10 min。流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254，280和340 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣10 μL。上述玉泉丸供試液的色譜結(jié)果如圖1所示：供試液中大多數(shù)成分實(shí)現(xiàn)了很好的基線分離，兩組陰性對(duì)照樣品分別在葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸的色譜峰位置無干擾峰出現(xiàn)，且一次色譜分析時(shí)間<33 min。

2　結(jié)　果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密吸取1.2項(xiàng)下各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，加入80%乙醇稀釋至刻度得每1 mL含葛根素500 μg、甘草苷250 μg、異甘草苷25 μg、大豆苷元100 μg和甘草酸750 μg的混合對(duì)照品溶液備用。

分別精密吸取2，4，6，8，10，15和20 μL依次進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出5個(gè)對(duì)照品的回歸方程和線性范圍，詳見表1。

表1　5個(gè)對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限

y:對(duì)照品的峰面積；x:對(duì)照品的含量.LOQ：定量限.

2.2精密度試驗(yàn)取2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按1.5項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)峰面積分別計(jì)算得葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸的RSD為0.16%，0.25%，1.5%，0.19%及0.25%。

2.3重復(fù)性試驗(yàn)取同批次(批號(hào)為121103)玉泉丸濃縮丸6份，分別按1.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按1.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)得樣品中葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元、甘草酸的RSD分別為0.29%，0.62%，1.9%，0.45%及1.2%。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液1份，室溫放置，按1.5項(xiàng)下色譜條件，于0，2，4，6，8，10，24，36，48 h各進(jìn)樣1次分析，記錄峰面積，計(jì)算得葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸含量的RSD分別為1.2%，0.9%，2.1%，0.7%及1.6%。結(jié)果表明供試液中葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的樣品(批號(hào)：140301)6份，每份6.0 g。精密稱定，每份加入相同量的葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸混合對(duì)照品(含量分別為：0.025，0.012 5，0.001 25，0.005和0.037 5 mg)，按1.3項(xiàng)下方法處理得到供試液，分別按1.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算平均加樣回收率分別為98.8%，96.1%，104.3%，103.5%和87.5%。RSD分別為1.3%，1.1%，2.8%，1.5%和3.3%。

2.6樣品含量測(cè)定取3批待測(cè)樣品，按1.3項(xiàng)下方法制備成供試液，按1.5項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣分析。以外標(biāo)法分別計(jì)算樣品中葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸的含量，結(jié)果見表2。

表2　5個(gè)化合物在3批玉泉丸中的含量

3　討　論

在色譜條件的考察過程中，對(duì)檢測(cè)波長和流動(dòng)相組成均做了考察。葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸對(duì)照品的紫外光譜掃描結(jié)果顯示：葛根素、大豆苷元和甘草酸在210，254 nm有最大吸收，甘草苷在280 nm有最大吸收，異甘草苷在340 nm有最大吸收。故設(shè)置3個(gè)檢測(cè)波長為254，280和340 nm。

對(duì)比甲醇-水和乙腈-水體系，發(fā)現(xiàn)乙腈-水體系能在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)較好的色譜分離。同時(shí)，為避免成分色譜峰拖尾及縮短分析時(shí)間，水相體系加入適當(dāng)比例的甲酸或乙酸，結(jié)果表明乙腈-水(0.2%甲酸)體系能滿足色譜峰出峰早、分離度好、峰形尖銳、基線波動(dòng)較小的色譜分離要求。故用于玉泉丸供試液HPLC分析。

玉泉丸由葛根、天花粉、地黃、麥冬、五味子及甘草六味中藥組方而成。其中葛根為君藥，生津止渴，主消渴；天花粉、地黃為臣藥，可滋陰清熱，生津止渴；麥冬和五味子為佐藥，麥冬主清肺養(yǎng)陰，益胃生津，五味子可益氣生津，寧心止煩渴；甘草為使藥，調(diào)和全方藥材適用于消渴病，肺胃陰虧。中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜，課題組前期采用高相液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了玉泉丸供試液中的化學(xué)成分，明確鑒定了葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸等多個(gè)成分。已有文獻(xiàn)報(bào)道，葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸具有明確降糖作用[5-8]，是方中含量較高且較穩(wěn)定的活性成分。故選取該5種活性成分為含量測(cè)定指標(biāo)成分，可更全面、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)玉泉丸質(zhì)量。

該研究建立了RP-HPLC同時(shí)測(cè)定玉泉丸中葛根素、甘草苷、異甘草苷、大豆苷元和甘草酸這5個(gè)有效成分含量的方法。經(jīng)上述方法學(xué)實(shí)驗(yàn)證明該方法精密度和準(zhǔn)確性均良好，完全符合藥品檢測(cè)要求。并將其成功應(yīng)用于3個(gè)批次(121103，130103和140301)的玉泉丸中5個(gè)有效成分的含量測(cè)定。結(jié)果顯示在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)(該研究在2015年)，這3個(gè)批次玉泉丸中的5個(gè)活性成分含量較穩(wěn)定。該含量檢測(cè)方法可用于玉泉丸的質(zhì)量檢測(cè)及相關(guān)研究。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部. WS3-B-3802-98《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二十冊(cè)[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998:Z20.

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(編輯：張慧茹)

Simultaneous Determination of Five Bioactive Components in Yuquan Pills by RP-HPLC

LI Shaoguang1, CAI Linxue2, YAO Hong1, HUANG Liying1, CHEN Bing1,LIN Xinhua1

1.Faculty of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350108, China;2.No 476 Hospital of Fuzhou General Hospital of Nanjing Army,Fuzhou 350002,China

ObjectiveTo establish a quality control method by using reversed-phase high performance liquid chromatography coupled with DAD detector (RP-HPLC-DAD) to simultaneously determine five components (puerarin, liquirtin, isoliquiritin, daidzein, glycyrrhizic acid) in Yuquan pills.MethodChromatographic experiment was carried out on an UltimateTMXB-C18 column(250×4.6 mm, 5 μm)with a gradient elution composed of acetonitrile (B) and 0.2% formic acid(A).The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength were 254, 280, 340 nm.The column temperature was set at 30 ℃.ResultsThe calibration curves of five components (puerarin, liquirtin, isoliquiritin, daidzein, glycyrrhizic acid) showed good linearity in their concentration ranges withr≥0.997.The average recovery was 87.5%～104.3% with relative standard deviation (RSD) less than 3.3%(n=6).ConclusionThe method is rapid, simple, and with good repeatability and stability, and it can be used in quality control of Yuquan pills.

Yuquan pill； puerarin； glycyrrhiza uralensis； isoflavones； glycyrrhizic acid； chromatography, high pressure liquid

2016-01-29

國家863項(xiàng)目(2012AA022604);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202987);福建省高校新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(JA14128)；福建省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016J01368)；福建省教育廳科技項(xiàng)目(JA15209)；福建醫(yī)科大學(xué)苗圃科研基金(2014MP010)

1．福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州 350801；2．南京軍區(qū)福州總醫(yī)院第四七六醫(yī)院 藥劑科，福州350002

李少光(1984-)，女，講師，藥理學(xué)博士

林新華. Email:Xhlin1963@sina.com

R284；R284.1；R285.5；R289.5；R927.2

A

1672-4194(2016)03-0155-04