D-101大孔吸附樹脂純化玉米須總黃酮工藝研究

包京姍，韓鳳波，畢　博*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林132101）

D-101大孔吸附樹脂純化玉米須總黃酮工藝研究

包京姍1，韓鳳波2，畢博2*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院，吉林吉林132101）

通過超聲波提取玉米須總黃酮，采用D-101大孔樹脂進行分離純化，得到最佳工藝參數(shù)：5 g大孔吸附樹脂，玉米須總黃酮上樣液質量濃度7 mg/m L，體積1 m L，以HCl調節(jié)pH=3，體積分數(shù)60%乙醇洗脫，洗脫體積5 BV，流速1.0 m L/m in。在此條件下，玉米須總黃酮的純度由41.35%提高到69.20%。

D-101大孔吸附樹脂；玉米須；總黃酮；純化

玉米須（Stigma maydis）為禾本科植物玉蜀屬植物玉米（Zea mays L.）的花柱與柱頭［1］。其味淡、性平，歸陽明經(jīng)，現(xiàn)代藥理研究證明，玉米須有顯著的利尿、降血糖、降壓、抑菌、抗癌、增強免疫等功效，用于治療腎炎、膽結石、糖尿病、黃疸、乳糜血尿、麻疹、血崩等癥，玉米須在民間常用于藥茶、藥膳中，作為糖尿病、高血壓的輔助治療藥物［2-5］。劉璐等［6-7］研究表明玉米須總黃酮具有抗氧化活性；王燕［8］研究結果顯示玉米須總黃酮對四氯化碳誘使肝損傷的保護作用；景怡等［9］研究顯示：玉米須總黃酮可有效降低糖尿病高脂血癥大鼠血糖及血脂水平，提高抗氧化能力。黃曉巍等［10］研究玉米須總黃酮能減降低糖尿病合并心肌缺血大鼠血清中乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LD）、糖化血紅蛋白（haemoglobin Alc，HbAlc）含量，達到治療糖尿病的效果，可見玉米須具有開發(fā)前景。

黃酮類化合物是玉米須中主要成分之一，本實驗采用超聲波提取玉米須總黃酮，大孔樹脂分離純化，考察純化率。通過考察D-101上樣液pH值、上樣濃度、洗脫劑濃度、洗脫體積、流速［11-13］，確定優(yōu)化分離純化工藝，研究結果為工業(yè)化生產(chǎn)及進一步開發(fā)利用玉米須提供一定的理論參考和指導，具有重要的現(xiàn)實意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

玉米須采自吉林農(nóng)業(yè)大學試驗田；D-101大孔樹脂：河北祥泰藍星精細化工有限公司；蘆丁標準品：中國藥品生物制品檢定所；Al（NO3）3、NaNO2、NaOH、HCl、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等（均為分析純）：北京化工廠。

1.2儀器與設備

AUW 120D電子天平：日本島津公司；SY-180超聲波清洗器：上海寧商超聲儀有限公司；EYEAL N-1100旋轉蒸發(fā)儀：日本東京理化公司；U-2900紫外可見分光光度計：日本日立有限公司；TS-100C恒溫搖床：上海善志儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1樣品液制備

鮮玉米須去雜，60℃干燥至質量恒定。取體積分數(shù)50%乙醇，料液比1∶30（g∶m L），超聲溫度60℃，超聲時間30 m in，超聲功率400 W［14-17］條件下超聲提取，旋轉蒸發(fā)濃縮至棕褐色浸膏，石油醚萃取，重復至石油醚層無色，取脫脂后水層，用乙酸乙酯萃取，重復上述操作3次。合并乙酸乙酯萃取液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至浸膏狀，60℃恒溫烘干，得玉米須總黃酮粗提物。

1.3.2檢測波長的確定以及蘆丁標準曲線的制備

精密稱取干燥至質量恒定的蘆丁標準品5.25 mg置于25 m L的容量瓶中，用體積分數(shù)50%乙醇定容，制得質量濃度0.21 mg/m L的對照品溶液。取蘆丁對照品溶液1 m L，置于10 m L容量瓶中并加入5%NaNO20.3 m L搖勻，放置6 m in后，再加入0.3 m L 10%Al（NO3）3，搖勻，靜置6 min后再加入3 m L 1 mol/L NaOH，混勻，用體積分數(shù)50%乙醇定容至刻度，放置15 min。取體積分數(shù)50%乙醇1 m L同上操作作為空白對照溶液。在波長200～800 nm的范圍內掃描吸收曲線。結果表明，在波長506 nm處吸光度值達到最大。精密量取蘆丁對照品溶液1.0 m L、1.5 m L、2.0 m L、2.5 m L、3.0 m L、3.5 m L、4.0 m L分別放置于10 m L容量瓶中，按上述總黃酮檢測方法，在波長506 nm處測定其吸光度值，以蘆丁質量濃度-吸光度值作圖，繪制蘆丁標準曲線。

1.3.3玉米須總黃酮含量測定

精密稱取玉米須總黃酮粗提物0.594 4 g，置于10 m L容量瓶中，用體積分數(shù)50%乙醇定容，取1 m L溶液在波長506 nm處測定吸光度值A，稀釋適宜倍數(shù)，按照標準曲線回歸方程計算玉米須總黃酮的含量。玉米須中總黃酮純度計算公式如下：

式中：C為測出的吸光度值對應的黃酮質量分數(shù)，mg/g；n為稀釋倍數(shù)；V為樣品的體積，mL；W為樣品質量，g。

1.3.4大孔樹脂吸附率測定

取玉米須總黃酮上樣液6份，每份各1 m L，以HCl調節(jié)pH，分別加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后過濾，采用1.3.3方法測定吸光度值，重復3次，計算吸附率，其計算公式如下：

吸附率=［初始質量濃度（mg/m L）-吸附后質量濃度（mg/mL）］×溶液體積（mL）/樹脂質量（g）×100%

1.3.5D-101大孔樹脂純化工藝優(yōu)化

D-101大孔樹脂，用蒸餾水充分淋洗干凈，除去表面雜質，用無水乙醇浸泡24 h，充分泡脹后，棄無水乙醇，用蒸餾水洗滌至無醇味，以5%HCl溶液浸泡，用蒸餾水洗至中性，再以5%NaOH溶液浸泡，蒸餾水洗至中性，備用。

（1）上樣液pH值的考察：取玉米須總黃酮上樣液6份，每份各1 m L，以HCl調節(jié)pH=1、2、3、4、5、6，分別加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后過濾，采用1.3.3方法測定吸光度值，重復三次，計算吸附率，確定適宜pH。

（2）洗脫液濃度的考察：取玉米須總黃酮上樣液6份，各1 m L，以HCl調節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后，分別加入體積分數(shù)分別為50%、60%、75%、90%的乙醇振搖24 h，過濾，測定吸光度值，確定最佳洗脫液濃度值。

（3）上樣液質量濃度的考察：取按照純度核算后的總黃酮提取液，稀釋成10mg/m L、9mg/m L、8mg/m L、7mg/m L、6 mg/m L、5 mg/m L（按照黃酮質量濃度計算）的玉米須總黃酮溶液1 m L，以HCl調節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，加入裝有5g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后，濾出上清液，以鹽酸-鎂粉反應檢測，確定上樣液質量濃度。

（4）洗脫流速的考察：取1.3.5（3）確定的上樣液濃度，調節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，13.4（2）確定的體積分數(shù)乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹脂柱，流速分別設為0.5 m L/m in、1.0 m L/m in、2.0 m L/m in、3.0 m L/min，收集洗脫液，測定吸光度值，確定最佳流速。

（5）洗脫液體積的考察：取1.3.5（3）確定的上樣液濃度，調節(jié)pH至1.3.5（1）確定的pH條件，1.3.5（2）確定的體積分數(shù)乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹脂柱，流速按照1.3.5（4）確定最佳流速，分別用體積為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV的洗脫液洗脫，取最后洗脫液約1 m L，計算總黃酮含量，確定最佳洗脫液體積。

2　結果與分析

2.1蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，波長506nm處的吸光度值（y）為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=8.605 4x-0.001 4，相關系數(shù)R2= 0.999 6。表明吸光度值與蘆丁質量濃度之間線性關系良好。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

2.2D-101大孔樹脂純化工藝優(yōu)化結果

2.2.1上樣液pH值的考察

取玉米須總黃酮提取物以體積分數(shù)50%乙醇稀釋，經(jīng)檢測為12.492 mg/m L，吸取6份作為上樣液，每份各1 m L，以HCl調節(jié)pH=1、2、3、4、5、6，分別加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后過濾，采用1.3.2方法測定吸光度值，重復三次，按1.3.4（1）計算吸附率。結果見圖2。

圖2　不同pH值對吸光度值的影響Fig.2 Effects of d ifferent pH on absorbance value

由圖2可知，不同的pH條件對于黃酮類存在形式有影響，且會導致D-101大孔樹脂對于黃酮類成分的吸附性能改變，pH=3的吸光度值最低，被吸附的黃酮成分最多，經(jīng)過計算，吸附率達到90.3%，黃酮類成分以更易于大孔樹脂吸附的形式存在，故確定上樣液的pH=3。

2.2.2洗脫液濃度的考察

取12.492 mg/m L的上樣液6份，各1 m L，以HCl調節(jié)pH=3，加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后，分別加入體積分數(shù)為50%、60%、75%、90%的乙醇振搖24 h，過濾，測定吸光度值，確定最佳乙醇體積分數(shù)，結果見圖3。

圖3　不同乙醇體積分數(shù)對吸光度值的影響Fig.3 Effects of different ethanol concentration on absorbance value

由圖3可知，以不同體積分數(shù)的乙醇洗脫樹脂，60%乙醇洗脫液吸光度值最大，故選擇體積分數(shù)60%的乙醇作為洗脫劑。

2.2.3上樣液質量濃度的考察

取按照純度核算后的總黃酮提取液，稀釋成10 mg/m L、9 mg/m L、8 mg/m L、7 mg/m L、6 mg/m L、5 mg/m L（按照總黃酮質量濃度計算）的玉米須總黃酮溶液1 m L，以HCl調節(jié)pH=3，加入裝有5 g D-101大孔樹脂的磨口錐形瓶中，置于恒溫搖床中振搖24 h后，濾出上清液，以鹽酸-鎂粉反應檢測，確定上樣濃度，結果見表1。

表1　最佳上樣濃度的確定Table 1 Determination o f loading concentration

由表1可見，1 m L溶液含有玉米須總黃酮8 mg時，鹽酸鎂粉反應陽性，顯示未完全吸附，7mg時陰性反應顯示完全被吸附，吸附量在7～8 mg之間，為了減少損失，確定D-101大孔吸附樹脂的最佳上樣濃度以總黃酮核算為7 mg/m L。

2.2.4洗脫流速的考察

取7 mg/m L上樣液，調節(jié)pH=3，體積分數(shù)60%乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入5 g D-101大孔樹脂柱，流速分別設為0.5 m L/min、1.0 m L/min、2.0 m L/min、3.0 m L/min，收集洗脫液，測定吸光度值，確定最佳流速，結果見圖4。

圖4　不同解吸流速對吸光度值的影響Fig.4 Effects of different desorption velocity on absorbance value

由圖4可知，吸光度值隨著流速的增加反而減小，也就是洗脫率隨著流速的增加而減小，但是流速為0.5 m L/m in和1.0 m L/m in時，吸光度值沒有明顯變化?？紤]到流速過慢，會影響實驗進程和生產(chǎn)效率，所以確定1.0 m L/min作為最佳流速。

2.2.5洗脫液體積的考察

圖5　不同洗脫體積對于吸光度值的影響Fig.5 Effects of different elution volume on absorbance value

以上述優(yōu)化條件，取7 mg/m L上樣液，調節(jié)pH=3，體積分數(shù)60%乙醇洗脫，吸取1 m L樣液，加入裝有5 g D-101大孔樹脂柱，流速分別設為1.0 m L/min，分別用體積為2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV、7 BV、8 BV的洗脫液洗脫，取最后洗脫液約1 m L，測定總黃酮含量，考察洗脫程度，確定最佳洗脫液體積，結果見圖5。

由圖5可知，隨著洗脫液體積增多，總黃酮含量逐漸減少，當洗脫液體積從5 BV增加到7 BV時，黃酮含量幾乎為0，說明在洗脫體積5 BV條件下洗脫基本完全。為減小浪費，故選擇洗脫液體積為5 BV。

2.3驗證試驗

確定的純化工藝為：按5 g D101大孔吸附樹脂計算，取質量濃度為7 mg/m L的玉米須總黃酮溶液（以玉米須總黃酮計）1 m L，用HCl調節(jié)pH=3，以5 BV體積分數(shù)為60%乙醇洗脫，流速1.0 m L/min，可以達到純化目的。按照確定工藝的四倍放大，進一步考察工藝的穩(wěn)定性，取處理好的D-101大孔樹脂20 g，按照確定的最佳工藝純化，烘干洗脫液至質量恒定，測定總黃酮含量，計算純度，重復3次，考察工藝穩(wěn)定性，計算相對標準偏差（relativestandard deviation，RSD），結果見表2。

表2　驗證試驗及穩(wěn)定性考察結果Table 2 Results o f verification test and stability test

由表2可知，在優(yōu)化的工藝條件下，通過D-101大孔樹脂對玉米須總黃酮進行純化，玉米須總黃酮純度由41.35%提高到69.20%，統(tǒng)計結果結果顯示：三次平行試驗RSD偏差小，條件比較穩(wěn)定，工藝可行。

3　結論

玉米須提取后，經(jīng)石油醚脫脂，乙酸乙酯初步純化后，D-101型大孔吸附樹脂可以用于玉米須總黃酮的分離純化。確定了純化最佳工藝參數(shù)為：玉米須總黃酮提取液上樣液質量濃度為7 mg/m L（以玉米須總黃酮計），用HCl調節(jié)pH=3，以5 BV體積分數(shù)為60%乙醇洗脫，流速1.0 m L/m in，可以達到純化玉米須總黃酮的目的，純化后玉米須總黃酮的純度由41.35%提高到了69.20%。D-101型大孔吸附樹脂作為純化手段現(xiàn)已普遍應用到大生產(chǎn)中，本研究結果簡便易行，純度有所提高，達到69.20%，分離量大，條件可控，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

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Purification process of total flavonoid from Stigma maydis by D-101 macroporous adsorption resins

BAO Jingshan1，HAN Fengbo2，BI Bo2*
（1.College of Traditional Medicine，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China；2.Jilin Agricultural Science and Techno logy University，Jilin 132101，China）

Total flavonoids were extracted from Stigma maydis by ultrasonic extraction，and then they were separated and purified by D-101 macroporous adsorption resin.The optimal extraction condition was that D-101 macroporous adsorption resin 5 g，samples concentration 7.0 mg/m l，volume 1 m l，then adjust to pH 3 w ith HCl，elute w ith concentration 60%ethanol，w ith elute colume 5 BV and velocity 1.0 m l/min.The purification degree of total flavonoids in S.maydis increased from 41.35%to 69.20%.

D-101 macroporous adsorption resin；Stigma maydis；total flavonoids；purification

R284．2

0254-5071（2016）05-0171-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．036

2015-11-21

吉林農(nóng)業(yè)科技學院中藥學省級重點學科培育資助項目（吉農(nóng)院合字2014第z016號）

包京姍（1982-），女，實驗師，博士，研究方向為藥用植物提取與分離。

畢博（1982-），男，講師，博士，研究方向為藥用植物提取、分離、分析。