MECP2基因甲基化和羥甲基化水平的性別差異研究

劉亞卉　鄭煜芳　劉　星　王紅艷　蔡春泉

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·論著·

MECP2基因甲基化和羥甲基化水平的性別差異研究

劉亞卉1鄭煜芳1劉星2王紅艷1蔡春泉3

目的探討MECP2在不同性別腦組織中是否有表達(dá)差異，從而與孤獨(dú)癥等疾病的性別差異相關(guān)。方法利用4例非疾病流產(chǎn)胎兒腦標(biāo)本，采用酚氯仿方法提取基因組DNA。在MethPrimer在線軟件上檢測(cè)MECP2基因-1 000 bp至+1 200 bp區(qū)間的CpG 島。甲基化檢測(cè)采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(使用EZ DNA Methylation-goldTMKit 試劑盒)。對(duì)于超聲斷裂后的基因組DNA，用基因組羥甲基化試劑盒(diagenode，hMeDIP kit)進(jìn)行ChIP反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄cDNA采用FastQuant RT Kit(With gDNase)試劑盒，定量PCR檢測(cè)MECP2表達(dá)量采用 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒。結(jié)果標(biāo)本1男，重量106 g，長(zhǎng)度17.4 cm；標(biāo)本2女，重量100 g，長(zhǎng)度19.1 cm；標(biāo)本3男，重量500 g，長(zhǎng)度28.3 cm；標(biāo)本4女，重量510 g，長(zhǎng)度31.5 cm。MECP2表達(dá)量男性胚胎(標(biāo)本1=0.0367，標(biāo)本3=0.0155)高于女性胚胎(標(biāo)本2=0.0177，標(biāo)本4=0.0088)。MECP2的甲基化水平女性個(gè)體平均1條X染色體上MECP2的甲基化程度顯著高于男性，特別是在啟動(dòng)子的核心區(qū)域-309 bp至-179 bp，男性MECP2上幾乎沒(méi)有甲基化，而羥甲基化水平男性高于女性。結(jié)論男性MECP2基因的DNA修飾促進(jìn)其表達(dá)，可能提高了男性胚胎對(duì)MECP2基因突變的易感性，從而影響MECP2基因突變導(dǎo)致的患病人群的性別差異。

MECP2基因；甲基化；羥甲基化

孤獨(dú)癥(ASD)是兒童發(fā)育障礙中最為嚴(yán)重的疾病之一，典型的臨床特征包括社交障礙、重復(fù)的刻板行為、智力發(fā)育遲緩和自主的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等[1]。ASD主要發(fā)生在男性中，男女比例約為4∶1。與ASD同屬于廣泛性發(fā)育障礙的Rett綜合征(RTT)卻表現(xiàn)為女性為主。這2種疾病在致病基因、臨床表現(xiàn)和病程進(jìn)展中有諸多重疊，臨床上>60%的RTT患者同時(shí)可有ASD的表現(xiàn)，甚至導(dǎo)致RTT被誤診為ASD[2]。然而2種疾病為何在男女患病比例上存在差異，長(zhǎng)期以來(lái)始終不明。

甲基化CpG結(jié)合蛋白2(MECP2)基因位于X染色體，基因全長(zhǎng)約為75.9 kb，包含5′UTR區(qū)，長(zhǎng)達(dá)8.4 kb的3′UTR區(qū)以及4個(gè)外顯子。MECP2蛋白是一種結(jié)合甲基化DNA的轉(zhuǎn)錄因子，包含2個(gè)具有重要的功能結(jié)構(gòu)域，即甲基化結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄抑制域[3]。小鼠研究顯示，MECP2在全身有廣泛性表達(dá)，但也顯示了一定的組織特異性和發(fā)育階段特異性表達(dá)譜。MECP2在腦的表達(dá)相對(duì)于其他組織要高，特別是在成熟的神經(jīng)細(xì)胞[4]。MECP2蛋白在胚胎發(fā)育時(shí)水平較低，但在出生后神經(jīng)元成熟階段其蛋白表達(dá)水平逐漸增多[4～9]。

1999年Amir首先確認(rèn)了MECP2是RTT的主要致病基因[10]，之后研究發(fā)現(xiàn)90%的RTT患者存在MECP2突變[1]；也有研究顯示，MECP2基因突變與ASD也密切相關(guān)[10～17]。共同的致病基因?yàn)樘剿鰽SD和RTT男女患病比例差異的原因提供了切入點(diǎn)。已知在正常個(gè)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，MECP2 的表達(dá)量受到嚴(yán)格的調(diào)控，表達(dá)量過(guò)高或過(guò)低對(duì)于ASD等疾病的癥狀都有影響，而甲基化和羥甲基化是調(diào)控基因表達(dá)最常見(jiàn)的表觀遺傳修飾。因此，推測(cè)MECP2在不同性別人群中的甲基化和羥甲基化水平可能存在差異，并可能是導(dǎo)致MECP2相關(guān)疾病如ASD和RTT發(fā)病性別差異的因素。為驗(yàn)證該假說(shuō)，設(shè)計(jì)了從表觀遺傳的角度探索MECP2的表達(dá)水平是否與性別相關(guān)的實(shí)驗(yàn)。

1　方法

1.1標(biāo)本及其來(lái)源本研究腦組織來(lái)自于天津市兒童醫(yī)院外科非疾病因素流產(chǎn)的胎兒。

1.2知情同意和倫理胎兒腦組織的收集均獲得流產(chǎn)胎兒家屬的知情同意。本研究得到復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)(倫理審批號(hào)：216)。

1.3組織DNA提取取胎兒腦組織樣本，采用酚氯仿的方法提取基因組DNA。擴(kuò)增MECP2編碼區(qū)以及潛在的啟動(dòng)子區(qū)(-1 375 bp至+1 bp)，檢測(cè)是否存在基因突變，所用引物見(jiàn)表1。

表1PCR擴(kuò)增引物序列

正向引物反向引物1TGCCAGGCATAGTCTCTCCTCTTCGGCAGAAGCAGCAAAG2GGGCAGGCTCGGATGAAATAGAGGGTAGAGAGGAGGGACG3ACTGTGTGTTACGTGCCAGTCCTTTCAGGGCTCAGGGAAG4GAGTGTATGATGGCCTGGGGCCACCCTGGGCACATACATT5AGAGCGTTGTCACCACCATCGCCTTTGGGGACTCTGAGTG6GAAAAGCAAGGAGAGCAGCCCCCTGAAGCCACGAAACTCT

1.4胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤(CpG)島預(yù)測(cè)在MethPrimer在線軟件(http://www.urogene.org/methprimer/)上檢測(cè)MECP2基因-1 000 bp至+1 200 bp區(qū)間的CpG 島。參數(shù)設(shè)置為Island size>200 bp, GC Percent >50.0, Obs/Exp >0.6。

1.5甲基化檢測(cè)甲基化檢測(cè)采用亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法(EZ DNA Methylation-goldTMKit 試劑盒)。其原理是，對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾后，其胞嘧啶如被甲基化，則保持胞嘧啶不變，如胞嘧啶沒(méi)有被甲基化，則經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后變?yōu)槟蜞奏?。亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)，純化，連T載體，挑單克隆，測(cè)序后與原序列對(duì)比，即可判斷該胞嘧啶是否被甲基化。

1.6羥甲基化檢測(cè)將3 μg基因組DNA超聲斷裂成小的片段，片段范圍為200～500 bp。超聲斷裂后的基因組DNA用基因組羥甲基化試劑盒(diagenode，hMeDIP kit)進(jìn)行ChIP反應(yīng)，純化和定量PCR(Takara，SYBR?Primemix Ex TaqTMKit)。操作按照實(shí)際和操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.7MECP2表達(dá)量檢測(cè)胎兒腦組織經(jīng)酚氯仿方法提取的基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA采用FastQuant RT Kit(With gDNase)試劑盒，定量PCR采用 SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑盒。

2　結(jié)果

2.1胎兒標(biāo)本一般情況標(biāo)本1男，重量106 g，長(zhǎng)度17.4 cm；標(biāo)本2女，重量100 g，長(zhǎng)度19.1 cm；標(biāo)本3男，重量500 g，長(zhǎng)度28.3 cm；標(biāo)本4女，重量510 g，長(zhǎng)度31.5 cm；標(biāo)本1和2重量和長(zhǎng)度相似，標(biāo)本3和4重量和長(zhǎng)度相似。

2.2MECP2啟動(dòng)子區(qū)甲基化的狀態(tài)圖1顯示，在MECP2基因-1 000 bp至+1 200 bp區(qū)間共找到2個(gè)CpG島，第1個(gè)CpG島為1 137 bp，位于-506 bp至+631 bp。第2個(gè)CpG島為251 bp，位于+841 bp至+1 091 bp。

圖1MeCP2的CpG島

用重硫酸鹽處理的4個(gè)胎兒腦組織標(biāo)本的DNA，對(duì)MECP2 -613 bp至+77 bp內(nèi)的38個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行亞硫酸氫鈉測(cè)序檢測(cè)(硫化測(cè)序PCR引物見(jiàn)表2)，PCR純化之后將DNA片段連接到T載體上，每個(gè)樣品挑10個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序和統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出CpG位點(diǎn)的甲基化百分比(圖2)。結(jié)果顯示，女性個(gè)體平均1條X染色體上MECP2的甲基化程度顯著高于男性，特別是在啟動(dòng)子的核心區(qū)域-309 bp至-179 bp，男性MECP2上幾乎沒(méi)有甲基化。

表2硫化測(cè)序PCR引物

編號(hào)正向引物反向引物覆蓋區(qū)域1AAATTAAGGTTTTTTAGTTGGGGTAATTAACCCTCTATCCACAAATACACC-613bp至-466bp2TTAGGTTTTTATTTGTTTTAGTATTCTCCAACTATTAATTAACTACTTTC-431bp至-290bp3GGGCYGGTTAAGAGGGCGGGGYGACTTTTACCACAACCCTCTCTCC-110bp至-10bp4GGAGAGAGGGTTGTGGTAAAAGTCCCACTCACAATCTCTCCTCCTC-33bp至+77bp

圖2標(biāo)本1～4的X染色體上MECP2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況

2.3MECP2啟動(dòng)子區(qū)羥甲基化的狀態(tài)標(biāo)本1～4的MECP2基因的-406 bp至+77 bp區(qū)域羥甲基化檢測(cè)引物見(jiàn)表3。圖3顯示，與甲基化富集程度相反，女性個(gè)體平均1條X染色體上MECP2的羥甲基化富集程度低于男性。

表3羥甲基化檢測(cè)引物

編號(hào)正向引物反向引物覆蓋區(qū)域/bp1CGCAAGGGTCCATTAATCCTTAACCTCCAGCTGTTGATTGGC-406～-2892CCGAAAGCAGCCAATCAACACGTCATTGGCTGTGATGGC-317～-1673GGAGAGAGGGCTGTGGTAAAGTCCCACTCACAGTCTCTCC-34～+73

圖3標(biāo)本1～4的MECP2基因啟動(dòng)子區(qū)平均1條X染色體上的羥甲基化狀況

2.4腦組織中MECP2定量PCR結(jié)果利用定量PCR的引物對(duì)MECP2 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量，定量PCR的引物：①M(fèi)ECP2-qPCR正向引物GGACCCATGTATGATGACCCC，反向引物CCGTGAAGTCAAAAT-CATTAGGGT；②GAPDH-qPCR正向引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，反向引物GAAGATGGTGATGGGATTTC。結(jié)果顯示，腦組織中MECP2表達(dá)量男性標(biāo)本1(0.0367)和3(0.0155)比女性標(biāo)本2(0.0177)和4(0.0088)高，MECP2的表達(dá)量比值胚胎期較晚的腦組織(標(biāo)本3/標(biāo)本4=1.76)比胚胎期較早的腦組織(標(biāo)本1/標(biāo)本2=2.07)低。

3　討論

甲基化和羥甲基化是調(diào)控基因表達(dá)的常見(jiàn)表觀遺傳修飾?；蚪M中的胞嘧啶上會(huì)發(fā)生甲基化修飾，通常是位于CpG上的胞嘧啶。約40%的基因在其啟動(dòng)子區(qū)域包含CpG島，其甲基化通常與基因沉默相關(guān)[27]。而羥甲基化修飾的作用與甲基化相反，可促進(jìn)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)羥甲基化修飾在大腦中最為豐富，特別是在皮質(zhì)和腦干[28, 29]，是其他組織中的10多倍[29～31]。羥甲基化與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育密切相關(guān)，和甲基化共同參與神經(jīng)元的分化以及海馬區(qū)神經(jīng)元的發(fā)生，并與小腦的發(fā)育呈正相關(guān)[32～35]，提示羥甲基化在大腦中是一個(gè)穩(wěn)定的遺傳標(biāo)記。有研究發(fā)現(xiàn)在各種分化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中5-羥甲基化富集在有活性基因上，而甲基化在這些區(qū)域顯著減少[36]。

本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，女性MECP2平均1條X染色體上的甲基化程度明顯高于男性，并且在檢測(cè)的2個(gè)男性胎兒腦組織中，MECP2啟動(dòng)子區(qū)幾乎沒(méi)有甲基化富集，而MECP2啟動(dòng)子區(qū)的羥甲基化富集程度男性高于女性?？紤]到甲基化對(duì)基因的沉默和羥甲基化促進(jìn)基因的表達(dá)，猜測(cè)在男性中，5-羥甲基化的富集和5-甲基化的缺乏可能導(dǎo)致MECP2在男性大腦中的表達(dá)高于女性。本文4個(gè)腦組織標(biāo)本MECP2表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果顯示，男性MECP2表達(dá)量比女性高，印證了上述推測(cè)。

之前的研究證實(shí)RTT是一種由MECP2基因突變引起的X染色體連鎖性ASD，患者主要是女性，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為男女比例的嚴(yán)重失調(diào)，是因?yàn)閿y帶純合突變基因的男性在胚胎早期即死亡，但在近年的研究也發(fā)現(xiàn)了男性 RTT 的病例，均表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)發(fā)育異常[37]。ASD主要發(fā)生在男性，目前的研究認(rèn)為ASD病因多樣化，與多基因和染色體區(qū)域相關(guān)?；颊叩哪信町惪赡苁桥杂心撤N特異性的保護(hù)機(jī)制，因此可能需要更多的致病因素(遺傳或環(huán)境)才能達(dá)到診斷的閾值[38]。這也表明ASD是一種X連鎖的疾病，因此性別層面顯得尤為重要。此外，在ASD及其他神經(jīng)發(fā)育障礙中觀察到MECP2基因突變或表達(dá)缺陷[11～15]。

由于MECP2對(duì)于大腦的發(fā)育非常重要，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)受嚴(yán)格調(diào)控，因此在男女腦組織中的表達(dá)差異，提示不同性別對(duì)其表達(dá)的敏感度不同。因此推測(cè)，如果攜帶了MECP2突變，男性受到的影響更大，這可能與ASD患者男女性別差異相關(guān)。而當(dāng)MECP2突變效應(yīng)太強(qiáng)時(shí)，男性胚胎很可能難以存活，因而RTT主要表現(xiàn)為女性患者。

本研究局限性在于樣本量太小，后續(xù)將進(jìn)一步收集不同胚胎期匹配的男女腦組織標(biāo)本擴(kuò)大驗(yàn)證；同時(shí)收集年齡相匹配的男女性ASD患者和非ASD對(duì)照，以外周血或皮膚成纖維細(xì)胞為對(duì)象，觀察MECP2基因甲基化、羥甲基化以及基因表達(dá)的情況，深入驗(yàn)證所得結(jié)果。

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(本文編輯：張崇凡)

Gender differences in methylation and hydroxymethylation levels of MECP2

LIUYa-hui1，ZHENGYu-fang1，LIUXing2，WANGHong-yan1，CAIChun-quan3

(1StateKeyLaboratoryofGeneticEnginering-MinistryofEducationKeyLaboratoryofContemporaryAnthropology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433；2NationalEngineeringCenterforBiochipatShanghai,Shanghai201203； 3DepartmentofSurgery,TianjingChildren′sHospital,Tianjing300074；China)

CAI Chun-quan，E-mail:tjpns@126.com

Objective To understand whether there are expressional differences ofMECP2 between male and female brains, which may contribute to the gender differences inMECP2 associated diseases, e.g. autism. MethodsGenomic DNA of brain tissues from four normal aborted fetuses was obtained by phenol-chloroform extraction. By using MethPrimer online software, the CpG island ofMECP2 gene was enriched between -1 000 bp to + 1 200 bp. To detect the level of methylation, bisulfite sequencing method was used (by using the EZ DNA Methylation-goldTMKit ). For ultrasound fractured genomic DNA, ChIP assay was performed with genomic hydroxymethyl kit (diagenode, hMeDIP Kit). The expression levels ofMECP2 in brain tissues were detected with cDNA that was obtained by FastQuant RT Kit (With gDNase) and were quantitated using SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) kits.ResultsSample 1, male,weight 106 g, length 17.4 cm;sample 2, female, weight 100 g,length 19.1 cm; sample 3, male, weight 500 g, length 28.3 cm; sample 4, female, weight 510 g, length 31.5 cm.The expression level ofMECP2 in brain of male (sample1=0.0367, sample3=0.0155) was higher than that in female (sample2=0.0177, sample 4=0.0088) during early embryonic stage. The methylation level of the core promoter region ofMECP2 in male was significantly lower than that in female per X chromosome, especially in the core promoter region -309 bp to -179 bp. Almost no methylation appeared onMECP2 in brain of male while the hydroxymethylation level was the opposite. ConclusionThese results indicated that the gene modifications onMECP2 in male may contribute to its expression. This may in turn increase the susceptibility of male toMECP2 mutations in disease such as autism and result in sex ratio changes in patient population.

MECP2; Methylation; Hydroxymethylation

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.02.011

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃：14JCYBJC25000

1 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海，200433；2 生物芯片上海國(guó)家工程研究中心上海，201203；3 天津市兒童醫(yī)院外科天津，300074

蔡春泉，E-mail:tjpns@126.com

2016-03-10

2016-04-03)