肺炎支原體RNA檢測(cè)在兒童肺炎支原體肺炎療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

郭　麗　孫　琳　郭　琰　李勤靜　吳喜蓉　劉　芳　李穎佳　王杏云　王　婷

徐保平1　馮雪莉1　申阿東1

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·論著·

肺炎支原體RNA檢測(cè)在兒童肺炎支原體肺炎療效監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

郭麗1,2孫琳1郭琰1李勤靜1吳喜蓉1劉芳1李穎佳1王杏云1王婷1

徐保平1馮雪莉1申阿東1

目的探討應(yīng)用肺炎支原體RNA檢測(cè)(RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),MP-SAT)作為兒童肺炎支原體肺炎(MPP)治療效果監(jiān)測(cè)指標(biāo)的可行性和應(yīng)用價(jià)值。方法 納入北京市平谷區(qū)婦幼保健院住院的社區(qū)獲得性肺炎患兒，其中符合MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)者為MPP組，余為非MPP組。①以血清肺炎支原體(MP)抗體(MP-Ab)檢測(cè)為診斷MP感染的參照試驗(yàn)，考察MP-SAT診斷MP感染的敏感度和特異度。②對(duì)MP-SAT和血清MP-Ab均陽性MPP病例行動(dòng)態(tài)觀察，比較MP-SAT和血清MP-Ab在大環(huán)內(nèi)酯類藥物標(biāo)準(zhǔn)治療不同時(shí)間的陽性率， MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間和臨床痊愈時(shí)間。③比較不同MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間MPP病例發(fā)熱時(shí)間、入院24 h內(nèi)血常規(guī)(WBC、N、L)，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和血清乳酸脫氫酶(LDH)及胸部X線指標(biāo)的差異。結(jié)果MPP組73例，非MPP組150 例。MP-SAT診斷MP感染的敏感度和特異度分別為83.6%(61/73)、97.3%(146/150)。MPP組MP-SAT和血清MP-Ab均陽性61例，隨治療時(shí)間的延長，MP-SAT陽性率顯著降低(P<0.05)，而血清MP-Ab的陽性率呈增高趨勢(shì)(P<0.05)。61例臨床痊愈時(shí)間平均為(3.0±0.9)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間為(3.3±0.8)周，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時(shí)間越長，入院24 h內(nèi)中性粒細(xì)胞百分比、CRP、LDH水平越高，X線胸片大片實(shí)變比例越高，淋巴細(xì)胞百分比越低 (P<0. 05)。結(jié)論MP-SAT可作為評(píng)價(jià)MPP 轉(zhuǎn)歸以及判斷大環(huán)內(nèi)酯類藥物療效的指標(biāo)。

肺炎支原體；社區(qū)獲得性肺炎；RNA檢測(cè)；診斷；臨床療效；兒童

肺炎支原體(MP) 引起的肺炎支原體肺炎(MPP)占住院兒童社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的10%～40%[1,2]。既往認(rèn)為MP感染病情一般較輕，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素效果好，或呈自限性。但近年來發(fā)現(xiàn)MP 感染所致的大葉性肺炎逐漸增多，且病情較重，部分病例治療棘手[3,4]。目前，血清MP抗體(MP-Ab)檢測(cè)是臨床最常用的診斷MP感染方法，但MP感染后數(shù)月抗體仍能持續(xù)存在，無法準(zhǔn)確反映藥物的療效和預(yù)后。

作為肺炎支原體RNA檢測(cè)技術(shù)之一，RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(SAT)直接以病原體特異性RNA為擴(kuò)增靶標(biāo)，具無創(chuàng)性、操作簡單和快速等特點(diǎn)。SAT屬于活菌檢測(cè)技術(shù)，在死亡的病原體中幾乎檢測(cè)不到RNA。目前已成功應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌、沙門菌屬、 腸道輪狀病毒和泌尿生殖道沙眼衣原體等病原的檢測(cè)[5～8]，然而SAT應(yīng)用于兒童MPP檢測(cè)尚未見報(bào)道。

1　方法

1.1研究設(shè)計(jì)以MP-Ab檢測(cè)作為MPP診斷的參照試驗(yàn)，考察MP-SAT的診斷準(zhǔn)確性；采集兩者均陽性的病例于入院后24 h內(nèi)，治療后1、2、3、4和5周MP-SAT檢測(cè)數(shù)據(jù)，分析MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)CAP診斷依據(jù)《實(shí)用兒科學(xué)》第7版[9]和“兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013年修訂版)”[10]，本文MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)滿足以下任意1項(xiàng)：①入院24 h內(nèi)MP-Ab≥1∶160；②大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)治療方案治療4周內(nèi)每周行MP-Ab檢測(cè)，雙份血清≥4倍升高。

1.3臨床痊愈標(biāo)準(zhǔn)發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀消失，胸部X 線好轉(zhuǎn)、滲出基本吸收，血常規(guī)及CRP檢查結(jié)果恢復(fù)正常。

1.4納入和排除標(biāo)準(zhǔn)①北京市平谷區(qū)婦幼保健院(我院)住院的符合CAP診斷患兒；②排除患有肺結(jié)核、免疫功能低下、院外已經(jīng)應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療和首次MP-SAT陽性但未行復(fù)測(cè)的患兒。

1.5MP-Ab滴度測(cè)定血清標(biāo)本以顆粒凝集法檢測(cè)MP抗體。按照SERODIA-MycoⅡ試劑盒使用說明書(日本富士瑞必歐株式會(huì)社)操作。

1.6MP-SAT檢測(cè)方法醫(yī)用棉簽取咽部分泌物，將拭子頭置于1 mL生理鹽水浸泡貼管壁擠干，取500 μL加入到500 μL裂解液中備用。送至首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒研所檢測(cè)。

采用MP核酸檢測(cè)試劑盒(購自上海仁度生物科技有限公司)，待測(cè)樣本加400 μL裂解液，陰性、陽性對(duì)照與待測(cè)樣本同步進(jìn)行，加入洗滌液洗滌2次，每管加入40 μL擴(kuò)增反應(yīng)液，震蕩混勻，取30 μL磁珠懸液至微量反應(yīng)管中，60℃溫浴10 min，42℃溫浴5 min，每孔加入10 μL SAT酶，放入核酸擴(kuò)增儀檢測(cè)。反應(yīng)程序：熒光通道設(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；每分鐘采集熒光信號(hào)1次，共檢測(cè)40次；從40℃～80℃行溶解曲線分析。樣本曲線與閾值曲線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(監(jiān)測(cè)時(shí)間)為dt，dt≤35 min為陽性，dt>40 min為陰性；在35～40 min的樣本重新檢測(cè)，dt≤35 min為陽性，dt>35 min為陰性。

1.7MPP治療方案我院MPP常規(guī)治療為予阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1，每日1次，首個(gè)療程靜脈滴注5 d，第2、3或4個(gè)療程根據(jù)病情靜脈滴注或口服3 d，間隔時(shí)間為3 d。

1.8觀察指標(biāo)①基于入院24 h內(nèi)第1次MP-SAT檢測(cè)的診斷參數(shù)；②MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間和臨床痊愈時(shí)間；③MP-SAT 5周內(nèi)(每周1次)持續(xù)陽性病例的發(fā)熱時(shí)間，入院24 h內(nèi)血常規(guī)(WBC、N、L)，超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)，血清乳酸脫氫酶(LDH)及胸部X線指標(biāo)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。非正態(tài)分布資料以中位數(shù)(P25～P75)表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。計(jì)算MP-SAT診斷MPP的敏感度、特異度、陰性預(yù)測(cè)值和陽性預(yù)測(cè)值及其95%CI。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床痊愈時(shí)間和MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間采用GraphPad Prism 5軟件制作生存曲線。

2　結(jié)果

2.1一般情況2014 年12 月至2015 年9月我院收治CAP患兒264例，其中233例符合納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)入分析(圖1)，MPP 73例，年齡(4.9±2.7)歲 ，男33例；非MPP 150 例，年齡(4.3±2.0)歲， 男73例。 兩組年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1研究對(duì)象篩選流程

2.2MP-SAT診斷MPP的參數(shù)以MP-Ab為參照試驗(yàn)，MP-SAT診斷MP感染的真陽性值、真陰性值、假陽性值、假陰性值分別為61、146、12和4例；敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及其95%CI分別為83.6%(73.1%～91.2%)、97.3%(93.3%～99.3%)、93.8%(84.9%～96.3%)和92.4%(87.1%～96.1%)。

2.3MP-SAT和MP-Ab在不同觀察時(shí)點(diǎn)MP檢出率MP-SAT和血清MP-Ab同時(shí)陽性61例。表1顯示，MP-SAT檢出率隨大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療時(shí)間的延長顯著降低(P<0.05)，4周時(shí)點(diǎn)陽性率僅6.6%；MP-Ab陽性率呈增高趨勢(shì)，至3周和4周，陽性率升至100%；2周時(shí)點(diǎn)MP-SAT和MP-Ab檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余時(shí)點(diǎn)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間與臨床痊愈時(shí)間的相關(guān)性圖2顯示，61例MP-SAT和血清MP-Ab均陽性病例的臨床痊愈時(shí)間為(3.0±0.9)周，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間為(3.3±0.8)周，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.78，P>0.05)。

表1MP-SAT陽性肺炎支原體肺炎病例不同時(shí)點(diǎn)MP-Ab和MP-SAT檢出率[n(%)]

治療時(shí)間MP-SAT(n=61)MP-Ab(n=61)χ2P<24h61(100)34(55.7)34.67<0.011周60(98.4)40(65.6)22.18<0.012周52(85.5)59(96.7)4.890.0543周24(39.3)61(100)53.11<0.014周4(6.6)61(100)106.99<0.015周0未測(cè)--χ2185.0780.62P0.010.01

圖2MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間與臨床痊愈時(shí)間比較

2.5MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間與MPP嚴(yán)重程度的相關(guān)性表2顯示，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間越長的病例表現(xiàn)為發(fā)熱持續(xù)時(shí)間越長，入院24 h內(nèi)中性粒細(xì)胞百分比、CRP、LDH水平越高，X線胸片肺大片實(shí)變比例越高，淋巴細(xì)胞百分比越低，5個(gè)時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。

表2MP-SAT不同轉(zhuǎn)陰時(shí)間肺炎支原體肺炎患兒的臨床癥狀、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較[n(%)，M(P25,P75)]

指標(biāo)MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間1周(n=1)2周(n=8)3周(n=28)4周(n=20)5周(n=4)χ2P發(fā)熱天數(shù)/d12(0,3)3.5(3,4)6(5,6)6.5(5.3,7)42.81<0.01X線胸片大片肺實(shí)變0(0)0(0)2(7.1)5(25)4(100)16.96<0.01外周血WBC/×109·L-16.77.5(6.0,10.6)9.5(7.4,10.8)9.1(7.8,11.7)8.1(6.2,9.7)3.25>0.05淋巴細(xì)胞0.360.36(0.28,0.42)0.30(0.27,0.36)0.29(0.23,0.33)0.15(0.084,0.26)10.68<0.05中性粒細(xì)胞0.530.55(0.52,0.61)0.59(0.53,0.66)0.66(0.58,0.71)0.83(0.64,0.89)12.97<0.05CRP/mg·L-129.5(8.3,13.8)12(5.3,17.0)15.5(10,24.8)28.5(11.3,48.0)10.80<0.05乳酸脫氫酶/U·L-1156213(146,250)232(201,299)243(183,291)302(271,384)9.86<0.05

3　討論

MPP具臨床表現(xiàn)多樣，病程長和反復(fù)等特點(diǎn)，易發(fā)生肺外并發(fā)癥，故探索一種直接、快速、操作簡便方法，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)兒童MPP治療效果，有較重要的臨床意義。MP-SAT作為建立在RNA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上的新一代核酸檢測(cè)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于以MP RNA為靶標(biāo)進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)。由于RNA僅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，因此該方法的陽性可提示MP的近期感染，而不是既往感染。本研究以MP-Ab為診斷MP感染的參考標(biāo)準(zhǔn)，顯示MP-SAT的敏感度和特異度分別為83.6%和97.3%，提示其具有較好的診斷價(jià)值，且特異度非常高，陰性可排除MP感染。同時(shí)隨著治療病情好轉(zhuǎn)，體內(nèi)MP被殺滅后RNA快速降解，可用于MPP的預(yù)后判斷。本研究結(jié)果顯示， 3～4周規(guī)范大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療過程中，MP-SAT陽性率隨入院治療時(shí)間的延長顯著降低，治療3周時(shí)點(diǎn)其陽性率明顯下降(39.3%)，4周時(shí)點(diǎn)MP-SAT陽性率為6.6%；而傳統(tǒng)的血清MP-Ab檢測(cè)由于在MP感染的早期存在窗口期，隨治療療程延長其滴度反而持續(xù)升高，在入院后<24 h和1周內(nèi)的陽性率較低(約60%)，在2周及之后時(shí)點(diǎn)其陽性率顯著升高(>95%)。

兒科應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的療程2 ～3周, 但因考慮停藥過早易復(fù)發(fā), 總療程常達(dá)3～4周。目前，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素停藥主要依據(jù)臨床癥狀消失、肺部炎癥基本消失及炎性指標(biāo)恢復(fù)正常[11]，仍缺乏客觀的停藥指征。本研究結(jié)果顯示，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間與臨床痊愈時(shí)間更為接近，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MP-SAT 動(dòng)態(tài)變化可為臨床動(dòng)態(tài)觀察大環(huán)內(nèi)酯類抗生素治療效果提供依據(jù)。MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間長可能與體內(nèi)MP不易清除和存在較強(qiáng)的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)[12]，為此本研究還探討MPP患兒MP-SAT檢測(cè)結(jié)果與臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和X線胸片的相關(guān)性。結(jié)果顯示，發(fā)熱持續(xù)時(shí)間，入院24 h內(nèi)中性粒細(xì)胞百分比、CRP、X線胸片大片肺實(shí)變與MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間成正相關(guān)，均提示轉(zhuǎn)陰時(shí)間越長，患兒入院時(shí)的炎癥反應(yīng)越嚴(yán)重；此外，MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間越長，淋巴細(xì)胞百分比越低，可能與MP感染后免疫抑制有關(guān)[13]，淋巴細(xì)胞數(shù)量減低者可能對(duì)MP更為易感，發(fā)病后更易進(jìn)展為肺炎[14,15]。同時(shí)LDH水平亦與MP-SAT轉(zhuǎn)陰時(shí)間呈正相關(guān)，考慮可能病情嚴(yán)重導(dǎo)致的全身組織器官炎癥損害嚴(yán)重，重癥感染致使機(jī)體處于高碳酸血癥和缺氧狀態(tài)，缺氧時(shí)細(xì)胞膜通透性增加，使LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放至血液中[16]。提示對(duì)這部分病例臨床延長大環(huán)內(nèi)酯類抗生素療程及應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)治療可能會(huì)減輕相關(guān)臨床癥狀和減少后遺癥的發(fā)生。

綜上，MP-SAT與MPP的疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性較好，可作為評(píng)價(jià)MPP轉(zhuǎn)歸以及判斷大環(huán)內(nèi)酯類藥物療效的指標(biāo)。

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(本文編輯：丁俊杰)

SHEN A-dong，E-mail:shenad16@hotmail.com; FENG Xue-li，E-mail:13901212405@sina.com

Objective To evaluate the clinical utility ofMycoplasmapneumoniaRNA detection (real-time isothermal transcription-mediated RNA amplification assay, MP-SAT) in the treatment ofMycoplasmapneumoniaepneumonia in children.MethodsChildren with community-acquired pneumonia in Beijing Pinggu District Maternal and Child Health Care Hospital, according to theMycoplasmapneumoniaediagnostic criteria，were divided into theMycoplasmapneumoniaepneumonia and non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia groups. ①When the results of serological tests were considered as the standard，the sensitivity and specificity of MP-SAT were evaluated. ②MP - SAT and serum MP -Ab positive cases were observed dynamically，the detection rate of MP-SAT and MP-Ab in different treatment course and the times of MP-SAT turning to negative and clinical recovery were compared. ③The differences of fever duration after macrolide administration，blood routine inspection (WBC, N, L), hypersensitive c-reactive protein (hs-CRP), serum lactate dehydrogenase (LDH) and the imaging results admitted to hospital within 24 hours were compared.ResultsMycoplasmapneumoniaepneumonia group included 73 cases, non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia group included 150 cases. The sensitivity, specificity of MP-SAT were 83.6%(61/73) and 97.3%(146/150),respectively. Children with both MP-SAT and MP-Ab positive results were followed to evaluate the treatment effect. After the treatment, the detection rate of SAT reduced significantly (P<0.05), while detection rate of serum MP-Ab increased significantly (P<0.05). The time of clinical recovery was (3.0±0.9) weeks, similar to that of MP-SAT turning to negative(3.3±0.8) weeks (P>0.05). Those with longer time of turning to negative had a longer fever duration after macrolide administration，increasing neutrophil，decreasing lymphocyte， higher level CRP and LDH, and large field of consolidation were more frequently observed on X-ray film (P<0.05).ConclusionMP-SAT can be used as an index for evaluation of the treatment outcome of MPP.

Mycoplasmapneumoniae；Community-acquired pneumonia；RNA detection;Diagnosis;Clinical effect;Children

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.02.005

國家科技支撐計(jì)劃: 2013BAI09B11; 首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng):2014-1-2094,2016-1-2092

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京市兒科研究所，兒科學(xué)國家重點(diǎn)學(xué)科，教育部兒科重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，兒童呼吸道感染性疾病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京，100045；2 北京市平谷區(qū)婦幼保健院北京，101200

申阿東，E-mail:shenad16@hotmail.com; 馮雪莉，E-mail:13901212405@sina.com

Clinical value of Mycoplasma pneumoniae RNA detection in the monitoring of Mycoplasma pneumoniae pneumonia treatment in children

GUOLi1,2,SUNLin1,GUOYan1,LIQin-jing1,WUXi-rong1,LIUFang1,LIYing-jia1,WANGXing-yun1,WANGTing1,XUBao-ping1,FENGXue-li1,SHENA-dong1(1DepartmentofRespiratory,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases;KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation;NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases;RespiratoryInfectionDiseasesLab,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing, 100045; 2MaternalandChildHealthCareCenterofPingguDistrict;Beijing101200,China)

2016-02-18

2016-03-23)