慢病毒介導沉默食管癌細胞53BP1基因表達對裸鼠移植瘤放射敏感性的研究

劉志坤，張魏麗，祝淑釵，蘇景偉，李 娟，沈文斌.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放療三病區(qū)，河北 石家莊 0500；.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，河北 石家莊 05007

慢病毒介導沉默食管癌細胞53BP1基因表達對裸鼠移植瘤放射敏感性的研究

劉志坤1，張魏麗2，祝淑釵1，蘇景偉1，李 娟1，沈文斌1
1.河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院放療三病區(qū)，河北 石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，河北 石家莊 050017

背景與目的：p53結合蛋白1（p53 binding protein，53BP1）在多種正常組織和腫瘤細胞中有表達，與放射線照射后細胞周期阻滯有關。體外實驗證實抑制53BP1的蛋白表達可有效地消除腫瘤細胞照射后引起的周期阻滯，增加放射敏感性。但體內實驗國內尚未見相關報道。該研究旨在探討沉默食管癌細胞53BP1基因對裸鼠移植瘤放射敏感性的影響。方法：將48只BALB/c/nu裸鼠按隨機數字表法分為對照組、單純照射組、空載體組、空載體加照射組、沉默53BP1組以及沉默53BP1加照射組，每組8只，于裸鼠皮下接種相應食管癌細胞ECA109，制備裸鼠模型，給予15 Gy放射線單次照射，受照后1 h每組處死3只裸鼠，將腫瘤標本按蛋白［質］印跡法（Western blot）及流式細胞分析要求處理，Western blot檢測移植瘤組織中CHK1、CHK2和磷酸化CHK2-T68的表達，流式細胞術分析裸鼠腫瘤組織中細胞周期分布和細胞凋亡。觀察各組剩余裸鼠移植瘤照射后的生長情況，移植瘤體積變化情況。結果：所有接種裸鼠均成活并有腫瘤形成，各組之間腫瘤體積大小差異無統(tǒng)計學意義（F=0.67，P=0.69）；單純照射組和空載體照射組裸鼠的腫瘤生長速度慢于未照射組（P=0.02），沉默53BP1加照射組裸鼠的腫瘤生長速度最慢（P=0.03），沉默53BP1加照射組的相對生長速率較空載體加照射組和單純照射組降低，生長抑制率增加（P=0.01）。沉默53BP1加照射組的q值為1.45；沉默53BP1加照射組裸鼠體內CHK1和CHK2的蛋白表達產物未見明顯變化（P=0.71），CHK2-T68的磷酸化水平較單純照射組和空載體照射組明顯下降（P=0.03），各組裸鼠的瘤組織中細胞周期分布和凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.45）。結論：體內研究顯示沉默53BP1基因可以提高食管癌放射敏感性。

食管癌；53BP1；移植瘤；放射敏感性；RNA干擾

照射后細胞周期阻滯為受損細胞修復創(chuàng)造了條件，消除照射后G2期阻滯，促使照射后G2期未修復的細胞進入有絲分裂期，可以增加放射敏感性［1］。我們前期研究采用RNA干擾技術抑制食管癌細胞ECA109中細胞周期檢測點激酶p53結合蛋白1（p53 binding protein 1，53BP1）的表達后，發(fā)現CHK2-pT68的磷酸化水平明顯降低［2］，很大程度上消除了對G2/M期的阻滯，克隆形成實驗證實放射敏感性增加。但體內與體外實驗的微環(huán)境變化很大，對實驗結果的影響也不一致。本研究利用體內實驗研究觀察沉默食管癌細胞ECA109中53BP1基因表達后對BALB/c/nu裸鼠移植瘤體積的影響以及照射后不同組間移植瘤體積的變化，并觀察各組移植瘤的蛋白表達特點及細胞周期分布，為基因治療聯合放射治療提供實驗依據。

1　材料和方法

1.1細胞培養(yǎng)及主要試劑

食管癌細胞系ECA109由中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院楊偉志教授惠贈。空病毒載體細胞（ECA109/N）、沉默53BP1基因表達的ECA109細胞（ECA109/B）為本實驗室構建［2］。細胞貼壁生長于含100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的10% FBS的H-DMEM培養(yǎng)液中，置CO2體積分數為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 2～3 d傳代1次。兔抗人53BP1單克隆抗體購自美國Chemion公司；堿性磷酸酶標記的IgG羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；BCIP/ NBT底物顯色試劑盒購自美國Ameresco公司；鼠抗單克隆抗體CHK1、CHK2和β-actin購自美國Santa Cruz公司；兔抗磷酸化CHK2-T68抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2實驗動物及飼養(yǎng)

BALB/c/nu裸鼠SPF級，4～8周齡，體質量18～20 g，雄性，共48只，由中國協和醫(yī)科大學中國醫(yī)學科學院動物研究所提供，其特性已鑒定。合格證書編號：SCXK（京）2005-0013。裸鼠由河北醫(yī)科大學實驗動物中心在新鮮空氣中高度除塵除菌，在無特殊病原體SPF層流室的恒溫（25～27 ℃）、恒濕（45%～50%）環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h光照和12 h黑夜交替。所用的墊木、飲水、飼料及其與動物接觸的物品均經高壓滅菌處理，喂養(yǎng)符合衛(wèi)生部頒布的“醫(yī)學實驗動物全價營養(yǎng)飼料標準”。

1.3實驗動物分組及接種

將48只BALB/c/nu裸鼠隨機分6組：① 對照組（ECA109組）；② 單純照射組（ECA109/R組）；③ 空載體組（ECA109/N組）；④ 空載體加照射組（ECA109/NR組）；⑤ 53BP1轉染組（ECA109/B組）；⑥ 53BP1轉染加照射組（ECA109/ BR組）。每組各8只BALB/c/nu裸鼠。爪墊用0.5%碘伏消毒，將食管癌ECA109、ECA109/N和ECA109/B細胞置于含10%胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)液中單層培養(yǎng)，于對數生長期時用胰酶消化液處理，錐蟲藍拒染法判斷細胞活力，計算活細胞數必須大于85%，Hanks液洗滌3次后制成細胞懸液，細胞密度為2×107個/mL。在裸鼠后爪墊皮下接種ECA109、ECA109/N、ECA109/B細胞，每只接種細胞數為2× 106個/100 μL，制備裸鼠食管癌模型，成瘤后隔日觀察1次，觀察腫瘤的生長時間、成瘤大小和宿主的全身情況。

1.4裸鼠照射

移植瘤最大徑達到0.8 cm 時，采用60Co γ射線15 Gy單次照射，照射時裸鼠未經麻醉，置于與外界空氣隔絕的自行設計的放射屏蔽盒中，將裸鼠后肢固定暴露于照射野內。照射前動物接觸的物品均經高壓滅菌處理，使用密封一次性膠布固定。

1.5腫瘤體積測量

按照上述分組處理后，每2 d測量腫瘤最大徑a值和最短徑b值，根據公式v=ab2π/6計算腫瘤體積；相對生長速率：實驗結束時腫瘤體積與實驗開始體積的比值；生長抑制率和q值：以公式“生長抑制率=1-實驗組體積/對照組體積”計算各實驗組腫瘤的生長抑制率，以公式q=EA+B/（EA+EB-EA×EB）計算是否有增敏作用，其中 EA+B表示各放射增敏組對腫瘤的生長抑制率，EA、EB分別表示照射組、轉染組對腫瘤的生長抑制率。q＞1說明有增敏作用，q=1說明有相加作用，q＜1說明有拮抗作用。

1.6蛋白［質］印跡法（Western blot）檢測腫瘤組織標本中相關蛋白（CHK1、CHK2和CHK2-T68）的表達

照射后1 h處死裸鼠收集腫瘤組織標本，按每100 mg組織加1 000 μL裂解液及10 μL 的PMSF比例，在冰浴條件下加入裂解液及PMSF，置勻漿器中反復研磨，使組織充分勻漿化。冰浴30 min后，低溫離心4 ℃、12 000 r/min離心15 min。小心吸取上清液即為組織蛋白。按考馬斯亮藍G250法測定蛋白濃度。按上述方法準備電泳樣品，按照每樣品40 μg上樣，然后進行SDS-PAGE、電轉印、封閉，一抗、二抗溫育，BCIP/NBT顯色，結果掃描后在凝膠成像儀上分析，測定灰度值，分別讀取3遍取平均值。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期分布

取腫瘤組織標本加適量的0.9%的NaCl溶液將其剪碎，用200目網過濾，離心半徑12 cm，12 000 r/min離心，去上清液，將組織細胞迅速注入4 ℃、70%冷乙醇中，4 ℃冰箱保存，固定24 h，取1 mL細胞懸液，加入0.5%胃蛋白酶2 mL，37 ℃水浴中溫育30 min，同時振蕩懸浮2次，PBS 液10 mL終止消化；12 000 r/min離心2 min，棄上清液，加入1 mL EB 染液（50 μg/ mL），采用一步插入法進行DNA染色，0～4 ℃保存 30 min，用 500目銅網過濾后上機分析。

1.9統(tǒng)計學處理

2　結　果

2.153BP1基因轉染對裸鼠體內ECA109細胞成瘤的影響

所有裸鼠均成活并有腫瘤形成，接種點無紅腫破潰表現。接種后1周左右可見所有裸鼠的爪下均形成移植瘤，照射前對照組、空載體組、53BP1轉染組、單純照射組、空載體加照射組、53BP1轉染加照射組移植瘤的體積差異無統(tǒng)計學意義（P=0.69，表1），提示單純53BP1轉染對ECA109細胞的生長增殖能力未見明顯影響。

表1　不同組別裸鼠移植瘤體積照射前腫瘤體積Tab.1　The volume of nude mice transplantation tumors before irradiation　±s

表1　不同組別裸鼠移植瘤體積照射前腫瘤體積Tab.1　The volume of nude mice transplantation tumors before irradiation　±s

GroupDose D/Gy Tumor volume V/mm3FP value ECA1090415.21± 83.75 ECA109/N0314.44±143.41 ECA109/B0389.32± 77.91 ECA109/R15340.00±170.18 ECA109/NR15327.42± 73.60 ECA109/BR15328.16± 88.02 0.670.69

2.2放射線照射后腫瘤體積的變化

按照實驗分組的情況給予各組相應放射線照射。繼續(xù)觀察放射線照射后4周各組腫瘤體積變化情況，由表2可以看出，未接受放射線照射的裸鼠，其腫瘤生長速度較快，未接受照射的3組裸鼠移植瘤的腫瘤體積在觀察期間未見明顯的差異。15 Gy放射線照射后，單純照射組和空載體加照射組裸鼠的腫瘤生長速度慢于未照射組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），53BP1轉染加照射組裸鼠的腫瘤生長速度最慢。而且與單純照射組和空載體加照射組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3腫瘤相對生長速率、生長抑制率和q值

由表3可見，與對照組、53BP1轉染組和單純照射組比較，53BP1轉染加照射組的相對生長速率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而生長抑制率增加。53BP1轉染加照射組的q值為1.45，表明沉默食管癌細胞中53BP1基因的蛋白表達后，確實起到了放射增敏作用。

2.4流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡的變化

各組裸鼠移植瘤在接受15 Gy的放射線照射后1 h，瘤組織內G2/M期細胞占總細胞數的比例與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（F=0.584，P=0.759），而且上述各組與未照射組之間差異也無統(tǒng)計學意義（F=0.584，P=0.759）；同時我們也觀察并檢測了照射后瘤組織內凋亡細胞的比例，發(fā)現各組裸鼠的瘤組織內凋亡細胞的比例差異無統(tǒng)計學意義（F=0.380，P=0.901，表4）。

表2　不同組別裸鼠移植瘤15 Gy照射后不同時間腫瘤體積（mm3）Tab.2　The volume of nude mice transplantation tumors at diferent time after irradiation by 15 Gy V/mm3，±s

表2　不同組別裸鼠移植瘤15 Gy照射后不同時間腫瘤體積（mm3）Tab.2　The volume of nude mice transplantation tumors at diferent time after irradiation by 15 Gy V/mm3，±s

*: P＜0.05，as compared with ECA109/BR；△: P＜0.05，as compared with ECA109/NR；#: P＜0.05，as compared with ECA109/R

GroupDose D/GyWeek 1Week 2Week 3Week 4 ECA1090601.92±19.54*1 432.07±146.30*△#3 057.74±53.09*△#5 318.27±105.26*△#ECA109/N0497.10±31.551 353.25±65.98*△#2 978.49±93.77*△#5 101.33±187.01*△#ECA109/B0574.79±61.37*1 469.01±55.74*△#3 160.28±120.24*△#5 128.67±280.27*△#ECA109/R15508.62±36.281 093.49±79.67*2 347.35±45.16*△3 384.32±154.27*△ECA109/NR15491.61±37.781 019.70±53.352 416.90±71.16*3 387.44±192.27*ECA109/BR15482.55±34.74　910.84±59.011 628.53±51.842 139.67±139.75

表3　不同組別裸鼠移植瘤照射后的相對生長速率、生長抑制率及q值Tab.3　The relative growth rate，growth inhibition rate and q value of nude mice transplantation tumors after irradiatio　±s

表3　不同組別裸鼠移植瘤照射后的相對生長速率、生長抑制率及q值Tab.3　The relative growth rate，growth inhibition rate and q value of nude mice transplantation tumors after irradiatio　±s

GroupDose D/GyRelative growth rateGrowth inhibition rateq value ECA109014.29±0.89-ECA109/N011.54±0.780.41 ECA109/B013.96±1.010.04 ECA109/R1511.25±0.730.37 ECA109/NR1511.13±0.840.44 ECA109/BR15 7.46±0.220.581.45

表4　15 Gy放射線照射后1 h不同組別裸鼠移植瘤的細胞周期分布及凋亡Tab.4　Distribution of cell cycle of diferent esophageal carcinoma cell types before irradiation and 1 h after irradiation by 15 Gy　±s

表4　15 Gy放射線照射后1 h不同組別裸鼠移植瘤的細胞周期分布及凋亡Tab.4　Distribution of cell cycle of diferent esophageal carcinoma cell types before irradiation and 1 h after irradiation by 15 Gy　±s

GroupDose D/Gy Percentage/% G1G2/MSPI ECA109024.27±1.6027.50±0.8748.30±0.871.47±0.40 ECA109/N022.70±1.6025.20±3.8252.13±4.461.72±0.93 ECA109/B024.13±1.9231.83±2.6544.00±3.362.17±0.50 ECA109/R1524.47±2.4729.70±2.0845.87±1.971.65±0.63 ECA109/NR1522.60±0.7832.10±4.2245.33±4.101.62±0.78 ECA109/BR1525.03±1.7030.53±2.5544.43±2.341.33±0.39

2.553BP1轉染聯合照射對瘤組織中CHK1和CHK2蛋白表達的影響

53BP1轉染加照射組的裸鼠移植瘤標本中CHK1和CHK2的蛋白表達產物未見明顯變化，其相對光密度比值與對照組和單純照射組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但53BP1轉染加照射組移植瘤標本中CHK2-T68的磷酸化水平較單純照射組和空載體照射組明顯降低（P＜0.05）（圖1、表5）。

圖1　不同組別裸鼠移植瘤15 Gy照射后1 h CHK1、CHK2及CHK2-T68的蛋白表達情況Fig.1　The protein expressions of CHK1，CHK2 and CHK2-T68 in diferent groups of nude mice transplantation tumors 1 h after irradiation by 15 Gy

表5　不同組別裸鼠移植瘤15 Gy照射后1 h CHK1、CHK2及CHK2-T68的蛋白表達情況Tab.5　The protein expressions of CHK1，CHK2 and CHK2-T68 in diferent groups of nude mice transplantation tumors 1 h after irradiation by 15 Gy　±s

表5　不同組別裸鼠移植瘤15 Gy照射后1 h CHK1、CHK2及CHK2-T68的蛋白表達情況Tab.5　The protein expressions of CHK1，CHK2 and CHK2-T68 in diferent groups of nude mice transplantation tumors 1 h after irradiation by 15 Gy　±s

*: P＜0.05，as compared with ECA109-N，with irradiation；△: P＜0.05，as compared with ECA109，with irradiation

GroupDose D/GyCHK1CHK2CHK2-T68 ECA10900.82±0.071.03±0.050.55±0.06*△ECA109/N00.86±0.041.07±0.070.59±0.08*△ECA109/B00.89±0.120.93±0.040.60±0.05*△ECA109/R150.91±0.081.09±0.041.07±0.07 ECA109/NR150.94±0.051.00±0.041.09±0.08 ECA109/BR150.91±0.311.04±0.090.70±0.07*△

3　討　論

食管癌是嚴重危害人類健康的消化道惡性腫瘤之一，放射治療為該病的主要治療手段之一。放療后局部未控或復發(fā)率高達60%～80%。雖然放療新技術的開展使食管癌放療后局部控制率有了較大改善，但總體仍不近人意。出于保護正常組織的目的提高放射劑量的方法難有突破，如何在目前醫(yī)療條件下提高食管癌的放射敏感性是廣大醫(yī)療工作者關注的熱點，電離輻射的核心是DNA雙鏈斷裂，而細胞周期檢測點激酶53BP1在檢測DNA損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。

關于食管癌RNA干擾53BP1蛋白表達與放射線照射相結合的實驗，國內目前鮮有相關報道。在我們前期體外研究中，采用RNA干擾技術抑制53BP1蛋白表達，采用流式細胞術檢測發(fā)現由于照射引起的細胞周期阻滯得到明顯解除，Western blot檢測照射后DNA損傷信號轉導通路中的下游相關蛋白CHK2-T68的表達較對照組明顯下降，克隆形成實驗也證實沉默53BP1蛋白表達后食管癌細胞的放射敏感性增強，體外實驗研究證實，細胞周期檢測點激酶在調節(jié)DNA損傷修復過程中發(fā)揮重要作用［2］。但體外生長環(huán)境與腫瘤在體內環(huán)境的生長情況有所不同，致使該研究結果有一定的局限性，基因治療的最終目的是應用于臨床實踐，所以本課題主要研究沉默53BP1蛋白表達對裸鼠移植瘤放射敏感性。

本研究選用BALB/c/nu裸鼠作為體內實驗的動物模型，BALB/c/nu裸鼠具有易成瘤、易飼養(yǎng)、重復性好、易觀察及相對穩(wěn)定等優(yōu)點，適于觀察腫瘤細胞在體內生長情況，是研究食管癌病因、發(fā)病機制及腫瘤防治的首選實驗動物。我們將ECA109、ECA109/N、ECA109/B腫瘤細胞制備成單細胞懸液，采用碘伏常規(guī)消毒后，于裸鼠爪墊注射等量、足量的細胞。在接種細胞7 d左右，各組裸鼠爪下均形成移植瘤，在國內首次成功構建了沉默53BP1基因的穩(wěn)轉細胞株荷瘤裸鼠模型，且在未接受放射線照射的情況下，各組裸鼠的腫瘤生長速度、腫瘤體積未見明顯差別（P＞0.05），說明慢病毒介導轉染對細胞的生長增殖沒有明顯的影響，也可能體內環(huán)境下腫瘤的生長更依賴于損傷應答通路的完整，一旦這種完整性遭到破壞，腫瘤的生長就會受到抑制［3-4］。但是在給予放射線照射后，隨著照射時間的延長，各組裸鼠移植瘤的腫瘤生長速度的差異逐漸表現出來。53BP1轉染加照射組的腫瘤生長速度明顯慢于其余各組。本研究結果顯示，當觀察點接近終點時，ECA109/BR組的腫瘤體積與其實驗開始時體積的比值即相對生長速率均低于單純照射組和53BP1轉染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。通過采用評價兩種處理方式聯合作用的公式計算相應的增敏因子q值，發(fā)現ECA109/BR組的q值為1.45，其值大于1，說明體內實驗證實采用RNA干擾技術抑制基因53BP1的蛋白表達后，確實對放射線起到了增敏作用。Ward等［5］曾采用RNA干擾技術轉染、觀察53BP1基因對惡性胸腺瘤生物學行為的影響，結果發(fā)現53BP1基因敲除組受照射后，與對照組相比，小鼠體內腫瘤生長速度明顯減慢，且對放射線的敏感性顯著增強，本研究與其結果類似。而且我們采用Western blot 技術檢測各組裸鼠腫瘤組織中CHK1、CHK2及磷酸化CHK2-T68的蛋白表達水平。結果顯示，ECA109/BR組的腫瘤組織中CHK1和CHK2的蛋白表達與對照組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但磷酸化CHK2-T68的表達水平卻明顯低于對照組（P＜0.05）。采用RNA干擾技術抑制基因53BP1的蛋白表達后，對照射后CHK1和CHK2的總蛋白表達量影響并不大，但是對CHK2的磷酸化水平作用明顯，該結果提示53BP1蛋白可能主要是通過CHK2的磷酸化來對下游相關效應蛋白進行調節(jié)的。在酵母菌中，DNA損傷導致蛋白激酶Rad9的磷酸化，磷酸化的Rad9可以促進Rad53聚集到Mec1復合體進行活化或直接活化Rad53［6-9］；在哺乳動物細胞中，目前所知有3種蛋白的結構和功能與Rad9類似［10-11］，這3種蛋白均含有BRCT結構域，分別是MDC1、BRCA1和53BP1［12-15］。研究表明，53BP1只是部分調節(jié)G2/M期檢測點和CHK2的功能［16-18］。這些研究結果表明，53BP1在CHK2的磷酸化過程中發(fā)揮著非常重要的作用［16-18］。本課題研究中各組細胞周期和凋亡之間未見明顯的差異，可能因為組織取材僅僅在裸鼠接受放射線照射1 h，受照射的時間太短，細胞周期和凋亡尚未發(fā)生明顯變化。

本次實驗采用慢病毒介導的方法沉默食管癌ECA109細胞的基因53BP1，并成功構建出沉默53BP1基因的穩(wěn)轉細胞株荷瘤裸鼠模型，而且該病毒載體對裸鼠腫瘤的生長未見明顯影響，而對裸鼠移植瘤接受照射后腫瘤的生長、細胞周期相關蛋白表達產生明顯影響，可能與DNA損傷信號轉導通路中相關信號蛋白的相互作用減弱有關，總之，53BP1可能是基因治療聯合放療具有應用前景的靶向基因之一。

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Efect of silencing 53BP1 gene on radiosensitivity to esophageal cancer ECA109 cell xenograft in nude mice

LIU Zhikun1，ZHANG Weili2，ZHU Shuchai1，SU Jingwei1，LI Juan1，SHEN Wenbin1（1.Department of Radiation Oncology，the Fourth Afliated Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，Hebei Province，China； 2.School of Public Health of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，Hebei Province，China）

Correspondence to: ZHU ShuchaiE-mail: zhikunliu1978@163.com

Background and purpose： p53 binding protein （53BP1） expresses in many normal and tumor cells.In vitro experiments have confrmed that inhibition of the protein expression of 53BP1 can efectively eliminate cycle arrest of tumor cells，and increase the radiosensitivity after irradiation.However，the in vivo experiment has not been reported.This study aimed to explore the efect of silencing 53BP1 gene on the growth and radiosensitivity to esophageal cancer cell ECA109 xenograft in nude mice.Methods： Forty-eight male BALB/c/nu nude mice were randomly divided into 6 groups: ECA109，ECA109/R，ECA109/N，ECA109/NR，ECA109/B and ECA109/BR.Three kinds of prepared cells （ECA109，ECA109/N and ECA109/B） were subcutaneously injected into the paw pads of mice （2×106/100 μL per mouse）.The nude mice in ECA109/R，ECA109/NR，and ECA109/BR groups were irradiated with 15 Gy.Tumor growth was monitored every other day on the 6thday after injection.Tumor volume was measured with calipers.Theexpression levels of CHK1，CHK2 and phosphorylated CHK2-T68 protein were examined in diferent groups by Western blot.Apoptotic cell and cell cycle distribution were detected by fow cytometry assay.Results： Visible tumors were detectable by day 7 after implantation，and the tumor volumes showed no signifcant diferences among all the groups （F=0.67，P=0.69）.After irradiation with 15 Gy，tumor volumes in ECA109/BR group were smaller than those in other groups （P=0.03）； the growth inhibition rate increased，but the relative growth rate decreased signifcantly （P=0.01）.The q value which refected the radiosensitizing efect in ECA109/BR group was 1.45.The expressions of CHK1 and CHK2 at protein level in ECA109/BR group were not infuenced （P=0.71）.However，the level of phosphorylated CHK2-T68 expression decreased signifcantly after irradiation with 15 Gy （P=0.03）.Cell cycle distribution and apoptosis were not signifcantly diferent among all the groups （P=0.45）.Conclusion： Silencing 53BP1 gene expression could inhibit the growth of esophageal cancer cell xenograft and increase the radiosensitivity to tumors in the nude mice.

Esophageal cancer； 53BP1； Xenograft； Radiosensitivity； RNA interference

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.07.003

R735.1

A

1007-3639（2016）07-0574-07

國家自然科學基金資助項目（30470524）；國家自然科學基金資助項目（30870743）；國家自然科學基金資助項目（8157111792）；河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目（20100416）。

祝淑釵 E-mail:zhikunliu1978@163.com

2015-05-07

2015-10-20）