乳腺癌前哨淋巴結活檢術新型示蹤劑的動物模型研究

田崇麟，孫 曉，劉雁冰，趙 桐，陳 鵬，叢斌斌，李盼盼，張 燕，王永勝,31.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 5000；.山東大學附屬山東省腫瘤醫(yī)院，乳腺病中心，山東 濟南 50117；3.山東省醫(yī)學科學院，山東 濟南 5006

乳腺癌前哨淋巴結活檢術新型示蹤劑的動物模型研究

田崇麟1,2，孫 曉2，劉雁冰2，趙 桐2，陳 鵬2，叢斌斌1,2，李盼盼1,2，張 燕1,2，王永勝2,3
1.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東 濟南 250200；2.山東大學附屬山東省腫瘤醫(yī)院，乳腺病中心，山東 濟南 250117；3.山東省醫(yī)學科學院，山東 濟南 250062

背景與目的：前哨淋巴結活檢已成為臨床腋淋巴結陰性早期乳腺癌患者的標準處理模式，并對疾病的分期和治療方案的選擇至關重要。該研究將吲哚菁綠和利妥昔單抗進行偶聯(lián)作為新型示蹤劑，采用小鼠后肢引流作為動物模型，模擬乳腺癌前哨淋巴結活檢術，探索其定位效應。方法：小鼠后肢腳背皮下注射不同劑量的示蹤劑，應用熒光脈管系統(tǒng)成像儀連續(xù)觀測腘窩淋巴結（作為前哨淋巴結）至3 h，探索最佳注射劑量和顯像時間。注射最佳劑量的示蹤劑，觀察至24 h，探索其持續(xù)定位效應。結果：隨著注射劑量的增加，前哨淋巴結開始顯像與達到最佳顯像的時間均逐漸縮短，次級及第3級淋巴結顯像率逐漸升高。新型示蹤劑的最佳注射劑量為0.12 μg（吲哚菁綠的含量），達最佳顯像時間約為34 min。觀察至24 h，前哨淋巴結顯像率維持在100%，次級及第3級淋巴結顯像率由6 h的0%和0%上升至20%和10%。結論：吲哚菁綠-利妥昔單抗能清晰定位前哨淋巴結且6 h內無次級淋巴結顯像，具有較高的臨床應用價值。

乳腺癌；前哨淋巴結新型示蹤劑；吲哚菁綠-利妥昔單抗

目前，前哨淋巴結（sentinel lymph node，SLN）活檢術（sentinel lymph node biopsy，SLNB）已替代腋淋巴結清掃術成為臨床腋淋巴結陰性的早期乳腺癌患者的標準處理模式［1］。國內外指南推薦的示蹤劑為核素和藍染料聯(lián)用。然而，核素示蹤劑存在放射性核素污染、其載體（硫膠體）并未通過中國食品藥品監(jiān)督管理局的批準、患者對于放射性核素檢查的排斥及基層醫(yī)院無核醫(yī)學科等問題，限制了核素示蹤劑在國內的推廣［2］。因此，部分醫(yī)院仍然單用染料法進行SLNB，易造成較高的假陰性率。

吲哚菁綠是近年來新興的熒光示蹤劑，但其具有顆粒小、次級淋巴結顯影率高的缺點；利妥昔單抗是針對淋巴結中B淋巴細胞膜上CD20分子的特異性人源化單克隆抗體［3］。鑒于兩種物質特殊的分子特性，我們設想可將吲哚菁綠和利妥昔單抗進行偶聯(lián)，作為新型示蹤劑進行乳腺癌SLNB，預計該示蹤劑將兼顧熒光示蹤劑和淋巴靶向藥物的優(yōu)點，具有良好的臨床應用前景。本研究采用小鼠后肢引流作為動物模型，應用新型示蹤劑模擬乳腺癌患者的SLNB，以確定新型示蹤劑定位小鼠SLN的最佳注射劑量、達到最佳顯像的時間、次級淋巴結顯像率等指標，為臨床應用奠定基礎。

1　材料和方法

1.1主要實驗材料

利妥昔單抗購自上海羅氏制藥有限公司；注射用吲哚菁綠購自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責任公司；半透膜直徑22 mm，截留相對分子質量為4×103～6×103，購自美國光譜醫(yī)學公司；MDM-I型熒光脈管系統(tǒng)成像儀購自廊坊明德生物醫(yī)藥技術有限公司。BALB/c小鼠，18～22 g，雌性，無菌級，購自北京華阜康生物技術股份有限公司。

1.2新型示蹤劑的制備

我們的前期基礎研究證實，吲哚菁綠和利妥昔單抗的最佳偶聯(lián)質量比為1∶4，且結合后仍保持了利妥昔單抗的免疫原性［4］。

① 室溫避光條件下，按無菌原則將100 mg利妥昔單抗用10 mL注射用水配制成10 mg/mL的溶液，將25 mg吲哚菁綠用10 mL注射用水配制成質量濃度為2.5 mg/mL的溶液。

② 按照最佳偶聯(lián)比將吲哚菁綠溶液緩慢滴入利妥昔單抗溶液中，迅速用電磁攪拌器振蕩混勻5 min。將裝有偶聯(lián)反應物的離心管進行離心沉淀（2 012×g，20 min）后，取上清液置于用半透膜制成的透析袋中。

③ 偶聯(lián)反應物混合液與滅菌注射用水按體積比為1∶200的比例進行透析，每2 h更換滅菌注射用水透析液，后收集吲哚菁綠-利妥昔單抗的偶聯(lián)物。

1.3小鼠前哨淋巴結動物模型的建立

結合文獻對小鼠淋巴結解剖的命名標準［5］，前期我們應用聯(lián)合法對10只BALB/c小鼠進行了實驗，于小鼠后肢腳背皮下注射99Tcm-硫膠體10 μL（5 μCi），3 h后脫頸椎處死小鼠，解剖腘窩及后續(xù)引流淋巴結。解剖前5 min以同樣方式注射亞甲藍，染料法取出腘淋巴結、髂淋巴結、主動脈旁淋巴結和腎旁淋巴結。γ手持探測儀測量核素計數(shù)平均值分別為35.50±6.75、2.00±1.15、0.00±0.00和0.00±0.00。按核素法大于最高計數(shù)10%為SLN，我們定義腘窩淋巴結為后肢引流的SLN，髂淋巴結為次級淋巴結，主動脈旁或腎旁淋巴結為第3級淋巴結（個別小鼠主動脈旁淋巴結缺如，此時選取腎旁淋巴結為第3級淋巴結）（圖1）。

1.4實驗步驟

1.4.1最佳注射劑量與最佳顯像時間研究

選取BALB/c小鼠（18～22 g），每10只1組。

⑴ 實驗組：于小鼠后肢腳背皮下注射吲哚菁綠-利妥昔單抗10 μL，每組注射的吲哚菁綠的含量從0.48 μg（通過王雪鵑等［6］關于99Tcm-IT-利妥昔單抗的動物實驗研究及預實驗結果確定）開始做爬坡實驗，分別為：0.48、0.24、0.12 和0.06 μg。熒光脈管系統(tǒng)成像儀連續(xù)觀測腘窩SLN至開始顯像，后每隔5 min觀察1次持續(xù)至3 h，記錄SLN熒光開始顯像以及達最佳顯像的時間。3 h后脫頸椎處死小鼠，解剖腘窩及后續(xù)引流淋巴結。解剖前5 min以同樣方式注射亞甲藍，染料法取出SLN、次級淋巴結及第3級淋巴結，應用熒光脈管系統(tǒng)成像儀測量有無熒光顯像。

⑵ 對照組：小鼠后肢腳背皮下注射吲哚菁綠10 μL（吲哚菁綠的含量為0.12 μg）。熒光脈管系統(tǒng)成像儀連續(xù)觀測腘窩SLN至開始顯像，后每隔5 min觀察一次持續(xù)3 h，記錄SLN熒光開始顯像以及達最佳顯像的時間。余步驟同前。

1.4.2SLN持續(xù)定位效應研究

⑴ 實驗組：小鼠后肢腳背皮下注射吲哚菁綠-利妥昔單抗（10 μL，吲哚菁綠的含量為0.12 μg）分3組，分別于6、12和4 h脫頸椎處死小鼠，解剖腘窩及后續(xù)引流區(qū)域淋巴結。解剖前5 min以同樣方式注射亞甲藍。染料法取出SLN、次級淋巴結及第3級淋巴結，應用熒光脈管系統(tǒng)成像儀測量有無熒光顯像。

⑵ 對照組：小鼠后肢腳背皮下注射吲哚菁綠（10 μL，吲哚菁綠的含量為0.12 μg）分3組，余步驟同前。

2　結　果

2.1最佳注射劑量與最佳顯像時間

隨著新型示蹤劑注射劑量的增加，SLN開始顯像的時間與達到最佳顯像的時間均逐漸縮短，分別由0.06 μg的18.4和39.6 min縮短至0.48 μg的8.0和21.9 min（表1）。隨示蹤劑注射劑量的增加，次級及第3級淋巴結的顯像率逐漸升高，分別由0.06 μg的0%和0%上升至0.48 μg的90%和90%。而單純吲哚菁綠對照組3 h時次級及第3級淋巴結的顯像率分別為100%和90%。當新型示蹤劑的劑量增加到0.24 μg時，次級及第3級淋巴結開始顯像，而劑量為0.06 μg時熒光脈管系統(tǒng)成像儀測量的SLN亮度較低，因此，選定0.12 μg為最佳注射劑量，對應的最佳顯像時間為34 min（圖2）。

表1　吲哚菁綠-利妥昔單抗注射劑量對各級淋巴結顯像的影響Tab.1　Lymph nodes imaging at all levels efected by diferent doses of ICG-R

圖2　新型示蹤劑高低劑量對比Fig.2　Comparison between high-dose and low-dose of the novel tracer

2.2SLN持續(xù)定位效應

在注射最佳劑量后，隨時間的延長，吲哚菁綠-利妥昔單抗組SLN的顯像率維持在100%，次級及第3級淋巴結的顯像率分別由6 h的0%和0%上升至24 h的20%和10%（圖3）。單純吲哚菁綠組SLN的顯像率逐漸降低，由6 h的100%降低為24 h的10%，次級及第3級淋巴結的顯像率逐漸降低，分別由6 h的80%和70%降低為24 h的0%和0%（表2）。

圖3　12 h各級淋巴結顯像情況Fig.3　Lymph node imaging at all levels after 12 h

表2　3 h后各級淋巴結顯像情況Tab.2　Lymph node imaging at all levels after 3 h

3　討　論

作為一項腋窩準確分期的微創(chuàng)活檢技術，SLNB代表目前乳腺癌外科治療的發(fā)展水平［7］。目前推薦聯(lián)合使用核素和藍染料進行SLNB，以獲得較高的成功率和較低的假陰性率［2］。然而，種種因素限制了核素示蹤劑在國內醫(yī)院中的推廣使用。SLNB在中國的現(xiàn)狀是，部分醫(yī)院仍然單用染料法進行SLNB，單用染料法對外科醫(yī)生的手術操作有極高的要求，易造成較高的假陰性率。

熒光成像技術是當前新型示蹤技術研究的亮點。吲哚菁綠作為常用的熒光示蹤劑，其注射于乳腺組織后，通過熒光脈管成像系統(tǒng)的近紅外光源（760 nm）激發(fā)產生熒光（820～830 nm），熒光穿透人體組織，利用成像儀可清晰直觀地觀察到淋巴管的引流途徑和SLN。但由于吲哚菁綠的顆粒較小，該方法具有SLN顯像持續(xù)時間短、次級淋巴結顯影率高、需在暗光下操作且易損傷淋巴管污染術區(qū)等缺點［10-12］。利妥昔單抗是針對淋巴結中B淋巴細胞膜上CD20分子的特異性人源化單克隆抗體，可與淋巴結中的CD20分子特異性結合，另外，其具備有與其他小分子結合的結構域，能夠與小分子物質進行偶聯(lián)反應。我們探索的新型示蹤劑吲哚菁綠-利妥昔單抗是熒光示蹤劑和淋巴結靶向治療藥物的結合物，其中大分子的利妥昔單抗與小分子的吲哚菁綠進行偶聯(lián)。新形成的偶聯(lián)物綜合了以上兩種物質的特點，其制備工藝簡單，無放射性，既能在近紅外線的激發(fā)下使SLN熒光顯像，又能特異地定位SLN。因此，進行SLNB時不必再循熒光顯像的淋巴管找尋SLN，只需術中用紅外線熒光顯像系統(tǒng)探測熒光顯像SLN的位置，將SLN周圍組織解剖游離后，直接解剖檢出熒光顯像定位的SLN，從而避免了SLN的漏檢和周圍組織熒光顯像污染的情況。

小鼠SLN動物模型技術簡單、可行，具有嚙齒動物模型成本效益佳的優(yōu)點。從動物模型的研究結果可以看出，吲哚菁綠-利妥昔單抗的注射劑量可影響SLN及次級引流淋巴結的顯像，SLN開始顯像的時間與達到最佳顯像的時間隨注射劑量的增加均逐漸縮短，次級及第3級淋巴結的顯像率隨注射劑量的增加逐漸升高。這說明吲哚菁綠-利妥昔單抗具有飽和性，當注入的吲哚菁綠-利妥昔單抗超過SLN內B細胞CD20的結合能力時，多余的示蹤劑將向下級淋巴結引流，從而導致次級及第3級淋巴結顯像。當吲哚菁綠-利妥昔單抗注射劑量為0.12 μg（吲哚菁綠的含量）時，6 h內次級及第3級淋巴結均不顯像，并且在后續(xù)24 h內SLN顯像率始終維持在100%，次級及第3級淋巴結顯像率低于20%，而相同劑量的單純吲哚菁綠，在3 h時次級及第3級淋巴結的顯像率為100%和90%，后續(xù)24 h內SLN、次級及第3級淋巴結顯像率均逐漸降低。由此說明，吲哚菁綠在進入引流區(qū)域淋巴結后，由于沒有偶聯(lián)利妥昔單抗不能與淋巴結內CD20分子特異性結合而進入血液，最后在肝臟內被代謝。因此，隨時間延長，SLN、次級及第3級淋巴結顯像率逐漸降低。

需要指出的是，應用吲哚菁綠-利妥昔單抗組12 h次級及第3級淋巴結開始顯像，顯像率雖然很低，且次級淋巴結相對于SLN的亮度明顯降低，但不能保證后續(xù)淋巴結100%不顯像。因此，在后續(xù)工作中，我們將對新型示蹤劑獲取的SLN進行熒光強度的探索，將有無熒光顯像的定性資料轉為不同熒光強度的定量數(shù)據(jù)，制定熒光示蹤劑進行SLNB的閾值規(guī)范，同時將進一步研究吲哚菁綠-利妥昔單抗在乳腺癌方面的應用，以盡快在臨床推廣應用。

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The study of a novel tracer for breast cancer sentinel lymph node biopsy in an animal model

TIAN Chonglin1，2，SUN Xiao2，LIU Yanbing2，ZHAO Tong2，CHEN Peng2，CONG Binbin1，2，LI Panpan1，2，ZHANG Yan1，2，WANG Yongsheng2，3（1.School of Medicine and Life Sciences，University of Jinan and Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250200，Shandong Province，China； 2.Breast Cancer Center，Shandong Cancer Hospital Afliated to Shandong University，Jinan 250117，Shandong Province，China； 3.Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，Shandong Province，China）

Correspondence to: WANG YongshengE-mail: wangysh2008@aliyun.com

Background and purpose： Sentinel lymph node biopsy has replaced axillary lymph node dissection as the standard staging procedure in early breast cancer patients with clinically negative axillary lymph nodes.It is a critical step for staging and treatment.This study investigated the localization efect of a novel tracer for breast cancer sentinel lymph node biopsy ［indocyanine green （ICG）-rituximab （R）］，using the hind limb drainage in mice as an animal model.Methods： For exploring the optimal dose and imaging time，diferent doses of ICG-R were injected subcutaneously to the dorsum of the foot in the BALB/c mice.Then the fuorescence vasculature imaging instrument was used continuously to observe the popliteal fossa lymph node （as sentinel lymph node） from the injection to 3 h after injection.For exploring the sustained localization efect，the optimal dose of ICG-R was injected and the imaging instrument was used from imaging to 24 h after injection.Results： The time from injection to imaging and the time from injection to the optimal imaging were shortened with the increased doses，and the imaging rate of the second or third level node increased accordingly.The best dosage of the novel tracer was 0.12 μg （dosage of indocyanine green） and the time from injection to the optimal imaging was about 34 min.After the observation for 24 h，the imaging rate of sentinel lymphnode was maintained at 100%，and the imaging rate of the second and the third level lymph node increased from 0% to 20% and 10%，respectively.Conclusion： ICG-R could clearly locate the sentinel lymph node.There is no imaging of the second level lymph node within 6 h.The novel tracer has high value in the clinical application.

Breast cancer； A novel tracer for sentinel lymph node； Indocyanine green （ICG）-rituximab （R）

10.19401/j.cnki.1007-3639.2016.07.002

R737.9

A

1007-3639（2016）07-0569-05

山東省自然科學基金重點項目（2014ZRC03036）；山東省重點研發(fā)技術項目（2015GSF118136）。

王永勝 E-mail:wangysh2008@ aliyun.com

2015-12-10

2016-03-23）