pH對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)菌素抑菌性的影響

鄭麗雪，郭晨，謝建松，唐亞進(jìn)，王立梅，齊斌，*（.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟25500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟25500）

pH對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)菌素抑菌性的影響

鄭麗雪1，2，郭晨1，謝建松1，唐亞進(jìn)1，王立梅1，2，齊斌1，*
（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇常熟215500）

以實(shí)驗(yàn)室保存的一株費(fèi)氏丙酸桿菌CS1420（Propionibacterium freudenreichii CS1420）為試驗(yàn)菌株。首先考察了不同初始pH下對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響。結(jié)果表明：以大腸桿菌ATCC25922為指示菌，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)，細(xì)菌素抑菌效果最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515為指示菌，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5.5時(shí)，細(xì)菌素抑菌效果最好。然后用丙酸調(diào)節(jié)細(xì)菌素粗提物的pH進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明，pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌性影響很大，當(dāng)用丙酸將細(xì)菌素溶液的pH調(diào)至5.5時(shí)，細(xì)菌素的抑菌活性有顯著提高。

費(fèi)氏丙酸桿菌；pH；細(xì)菌素；抑菌性

丙酸桿菌屬?gòu)V泛存在于自然界中［1-2］，被分為兩大類，一類是痤瘡型丙酸桿菌［3］，另一類是乳品丙酸桿菌。乳品丙酸桿菌主要包括費(fèi)氏丙酸桿菌（P.freudenreichii）、詹氏丙酸桿菌（P.jensenii）、特氏丙酸桿菌（P. thoenii）等，是從乳制品、青貯飼料中分離出來(lái)的無(wú)致病性的一類丙酸桿菌，現(xiàn)在食品工業(yè)中主要用于生產(chǎn)丙酸、維生素B12、葉酸、乳品發(fā)酵劑、發(fā)酵蔬菜、露蘆糖等［4-6］。另外，乳品丙酸桿菌在代謝過(guò)程中會(huì)合成特殊的肽或蛋白質(zhì)，這類代謝物（細(xì)菌素）是丙酸桿菌產(chǎn)生的異型抑菌物質(zhì)，有很好的特性［7-9］，比如：其具有廣泛的抑菌作用，且抑菌效果優(yōu)于苯甲酸鈉、山梨酸鉀等常見(jiàn)的化學(xué)防腐劑，所以，丙酸桿菌細(xì)菌素在食品防腐保鮮中具有很好的應(yīng)用前景，受到了研究人員的廣泛關(guān)注。

如何去提高丙酸桿菌細(xì)菌素的抑菌活性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，已有研究表明，pH對(duì)費(fèi)氏丙酸桿菌細(xì)菌素抑菌性的影響很大。馮晗等［10］，榮紹豐等［11］分別研究了丙酸桿菌代謝物對(duì)惡臭假單胞菌、酵母菌的抑制活性，研究發(fā)現(xiàn)，pH越低，丙酸桿菌代謝物抑菌活性越高。馬悅培等人［12］研究了不同初始pH對(duì)丙酸桿菌細(xì)菌素發(fā)酵的影響，結(jié)果顯示，pH對(duì)丙酸桿菌細(xì)菌素發(fā)酵也有很大影響?；诖?，本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的一株費(fèi)氏丙酸桿菌CS1420為實(shí)驗(yàn)菌株，一方面考察不同初始pH對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌素的影響，另一方面，本研究將發(fā)酵產(chǎn)物中的細(xì)菌素進(jìn)行粗提處理，進(jìn)一步考察pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌活性的影響，這方面的研究?jī)?nèi)容目前鮮有人涉及。此研究旨在為后續(xù)的擴(kuò)大試驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種

費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，簡(jiǎn)稱為P.freudenreichii CS1420）、大腸桿菌（ATCC25922）、酵母菌（Saccharomycescerevisiae2-10515，以下簡(jiǎn)稱為S.cerevisiae 2-10515）：均為常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存。

1.2儀器

LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；FA604A型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；LHR-250型霉菌培養(yǎng)箱：上海索譜儀器有限公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；SW-CJ-1B超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；Bio-Rad xMark酶標(biāo)儀、Bio-Rad 1575洗板機(jī)：美國(guó)Bio-Rad公司；Milli-Q Advantage超純水儀：美國(guó)Millipore公司。

1.3培養(yǎng)基

丙酸桿菌培養(yǎng)基：改良PYG培養(yǎng)基［13］；大腸桿菌培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g；蒸餾水1000 mL，pH 7.0；酵母菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基［14］。

1.4菌種活化

將保存的P.freudenreichii CS1420菌株劃線接種到改良的PYG固體培養(yǎng)基上，30℃厭氧培養(yǎng)2.5 d，連續(xù)活化兩代。

挑取平板上活化好的大腸桿菌ATCC25922接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h；挑取平板上活化好的S.cerevisiae 2-10515單菌落接種于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h。

1.5不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌的抑制作用

將活化好的P.freudenreichii CS1420的種子液，分別接種到不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0）的改良PYG培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10 d，每天取樣，離心取上清液留樣備用。取若干只試管，每只試管中加入1 mL活化好的大腸桿菌菌液和0.5 mL P.freudenreichii CS1420發(fā)酵上清液，以加1 mL的無(wú)菌的大腸桿菌培養(yǎng)基和0.5 mL無(wú)菌的PYG培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37℃條件下培養(yǎng)12 h，分別取200 μL于酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)測(cè)定OD620?？疾觳煌跏紁H條件下，不同發(fā)酵時(shí)間細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌ATCC25922的抑制作用。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.6不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)酵母菌的抑制作用

另取若干只試管，每只試管中加入1 mL活化好的酵母菌菌液和1.5中處理好的0.5 mL P.freudenreichii CS1420發(fā)酵上清液，以加1 mL的無(wú)菌的酵母菌培養(yǎng)基和0.5 mL無(wú)菌的PYG培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37℃條件下培養(yǎng)24 h，分別取200 μL于酶標(biāo)板上，在酶標(biāo)儀上讀數(shù)測(cè)定OD560。考察不同初始pH條件下，不同發(fā)酵時(shí)間細(xì)菌素對(duì)Saccharomyces cerevisiae 2-10515的抑制作用。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.7不同pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌性的影響

將P.freudenreichiiCS1420發(fā)酵液在4℃、8000r/min條件下離心10 min，在上清液中邊攪拌邊緩慢加入（NH4）2SO4粉末，使得（NH4）2SO4終濃度為70%，攪拌均勻后放置于4℃冰箱中沉淀過(guò)夜，然后于4℃、12 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，將沉淀加水溶解后，用分子量為1 000 Da的透析袋透析48 h，然后將透析液進(jìn)行冷凍干燥處理，冷凍干燥后加一定量的水溶解冷凍干燥后的沉淀物，并將其分成4份，分別用丙酸調(diào)節(jié)pH為5.1、5.3、5.5、5.7，分別取200 μL參照文獻(xiàn)［15］中改動(dòng)后的牛津杯-雙層平板法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，指示菌選用大腸桿菌ATCC25922。以此考察不同pH對(duì)純化得到的細(xì)菌素抑菌性的影響。

2　結(jié)果與討論

2.1不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌抑制作用

不同初始pH發(fā)酵時(shí)細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌抑制作用見(jiàn)圖1。

不同初始pH發(fā)酵時(shí)，P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌抑制作用如圖1所示，其中0 d為空白對(duì)照組，由圖可知，P.freudenreichii CS1420經(jīng)不同初始pH發(fā)酵后，不同時(shí)間的發(fā)酵液均有抑制大腸桿菌ATCC25922的作用，但是發(fā)酵前幾天抑菌作用不明顯，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌作用增強(qiáng)，發(fā)酵第8天～9天的代謝產(chǎn)物抑制作用最強(qiáng)，這和榮紹豐等人、馮晗等人的研究一致，即發(fā)酵后期（第8天左右）丙酸桿菌代謝物抑菌活性最高。另外，從圖中可以明顯看出，不同初始pH對(duì)P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素抑菌性有很大影響，當(dāng)初始pH為6.0時(shí)，P.freudenreichiiCS1420細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌ATCC25922抑制作用最強(qiáng)。

圖1 不同初始pH發(fā)酵時(shí)細(xì)菌素對(duì)大腸桿菌抑制作用Fig.1　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on E.coli

2.2不同初始pH發(fā)酵的P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)酵母菌抑制作用

不同初始pH發(fā)酵時(shí)細(xì)菌素對(duì)酵母菌抑制作用見(jiàn)圖2。

圖2 不同初始pH發(fā)酵時(shí)細(xì)菌素對(duì)酵母菌抑制作用Fig.2　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation on yeast

不同初始pH發(fā)酵時(shí)，P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)酵母菌抑制作用如圖2所示，由圖可知，P. freudenreichii CS1420經(jīng)不同初始pH發(fā)酵后，不同時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)Saccharomyces cerevisiae 2-10515也都有抑制作用，同樣是發(fā)酵前幾天抑菌作用不明顯，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液抑菌作用增強(qiáng)，發(fā)酵第8天～9天的代謝產(chǎn)物抑制作用最強(qiáng)。另外，當(dāng)初始pH為5.5時(shí)，P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素對(duì)Saccharomyces cerevisiae 2-10515抑制作用最強(qiáng)。

2.3不同pH對(duì)粗提得到細(xì)菌素抑菌性的影響

根據(jù)2.1、2.2的試驗(yàn)結(jié)果，選取第 9天的 P. freudenreichii CS1420發(fā)酵液按照1.7方法進(jìn)行鹽析、透析、冷凍干燥等處理后，用丙酸調(diào)節(jié)其pH分別為5.1、5.3、5.5、5.7，進(jìn)一步研究不同pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌性的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　不同pH對(duì)細(xì)菌素抑菌性的影響Fig．3　Inhibitory effects of bacteriocins at different initial pH fermentation

由圖3可知，pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌性影響很大，牛津杯A中細(xì)菌素溶液形成的抑菌圈直徑為12.8 mm，B為17.2 mm，C為23.3 mm，D為17.1 mm。結(jié)果表明，用丙酸將細(xì)菌素溶液的pH調(diào)節(jié)為5.5時(shí)，抑菌物質(zhì)的抑菌活性有顯著提高。所以，盡管丙酸桿菌細(xì)菌素具有廣泛的pH耐受范圍［16-17］，但在不同pH條件下，細(xì)菌素抑菌活性差別很大。

3　結(jié)論與展望

1）以大腸桿菌ATCC25922為指示菌，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)，P.freudenreichii CS1420產(chǎn)細(xì)菌素抑菌作用最好；以Saccharomyces cerevisiae 2-10515為指示菌，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5.5時(shí)，細(xì)菌素抑菌作用最好。

2）用丙酸調(diào)節(jié)粗提處理后的細(xì)菌素溶液的pH，然后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)粗提得到的細(xì)菌素抑菌性影響很大，當(dāng)用丙酸將細(xì)菌素溶液的pH調(diào)至5.5時(shí)，抑菌物質(zhì)的抑菌活性有顯著提高。

發(fā)酵條件的優(yōu)化與否直接影響到代謝方式及代謝流量的變化，從而影響目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者針對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量做過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化研究［18-20］，但是相關(guān)報(bào)道較少。所以，本研究待開(kāi)展的工作是進(jìn)一步對(duì)P.freudenreichii CS1420進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，得到發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌素的最佳條件，然后結(jié)合本研究的結(jié)果，最終獲取P.freudenreichii CS1420細(xì)菌素產(chǎn)生最大抑菌活性的條件，以期為工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論參考。

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Effect of pH on Antimicrobial Activity of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins

ZHENG Li-xue1，2，GUO Chen1，XIE Jian-song1，TANG Ya-jin1，WANG Li-mei1，2，QI Bin1，*
（1.College of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China；2.Suzhou Key Laboratory of Food and Biotechnology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Propionibacterium freudenreichii CS1420 was as experimental strains.Firstly，the effects of different pH on fermentation of Propionibacterium freudenreichii Bacteriocins were investigated.The result showed：the antimicrobial activity were best by using Eoli ATCC25922 as indicator strains when the medium initial pH was 6.0，the antimicrobial activity were best by using Saccharomyces cerevisiae 2-10515 as indicator strains when the medium initial pH was 5.5.Then，bacteriocins crude extract pH were adjusted and then bacteriostatic experiments were carried out.The result showed：the effect of pH on crude extract bacteriocins was tremendous.The antimicrobial activity of bacteriocins improved significantly when crude extract bacteriocins solution pH were adjusted 5.5 with propionic acid.

Propionibacterium freudenreichii；pH；bacteriocins；antimicrobial activity

2015-09-10

江蘇省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（BE2013339）；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201226）；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201417）；常熟理工學(xué)院大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

鄭麗雪（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。