體外消化對(duì)玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性的影響

許瑞雪，劉曉蘭，王俊彤，鄭喜群（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

體外消化對(duì)玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性的影響

許瑞雪，劉曉蘭*，王俊彤，鄭喜群
（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

以玉米蛋白粉為原料提取玉米谷蛋白，利用蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，制備蛋白水解物，再用胃蛋白酶及胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)一步消化處理，以抗氧化活性為指標(biāo)對(duì)消化過程中蛋白酶加量進(jìn)行優(yōu)化，制備富含谷氨酰胺的具有抗氧化功能的蛋白水解物。結(jié)果表明，玉米谷蛋白經(jīng)復(fù)合蛋白酶水解后，蛋白收率（54.41±3.26）%，水解物的羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力分別達(dá)到（29.50±0.31）%、（73.33±0.62）%及0.50±0.01；二步消化后蛋白水解物羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力分別達(dá)到（55.88±0.94）%、（90.44±0.01）%及0.40±0.01。

玉米谷蛋白；消化；胃蛋白酶；胰蛋白酶

玉米是世界上的三大糧食作物之一，2014年～2015年我國(guó)玉米產(chǎn)量為2.155億t（國(guó)際谷物理事會(huì)（IGC）發(fā)布），位居世界第二位［1］。隨著玉米產(chǎn)量的逐年增加，玉米深加工的領(lǐng)域也得到不斷的擴(kuò)展。玉米蛋白粉，又稱玉米黃粉，是玉米濕法生產(chǎn)淀粉過程中的副產(chǎn)物，其中含62%～71%的蛋白質(zhì)，主要組分為玉米醇溶蛋白（65%～68%）和谷蛋白（22%～23%）還有少量的球蛋白（1.2%）和白蛋白［2］。

Gln可以有效的改善人體酸堿平衡，改善胃腸道功能，提高機(jī)體免疫力［3］，還可以增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，或是直接抑制自由基的產(chǎn)生［4］，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。但直接將Gln應(yīng)用于食品或醫(yī)藥中非常困難，因?yàn)槠渥陨砣芙舛鹊颓也环€(wěn)定［5］。玉米谷蛋白含大量門冬酰胺和谷氨酰胺（Gln）氨基酸，其中谷氨酰胺含量約占總氨基酸的1/3［5］。用蛋白酶將玉米谷蛋白水解后，生成的蛋白水解物中含大量谷氨酰胺肽，含谷氨酰胺肽在胃和小腸內(nèi)經(jīng)消化易分解出谷氨酰胺。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)不同地區(qū)有7%～41%的人口具有功能性消化不良癥狀［6］，針對(duì)這類人群，將富含谷氨酰胺的蛋白質(zhì)水解物進(jìn)行體外消化，制備具有改善胃腸道功能的抗氧化功能性食品基料具有必要性。本文利用復(fù)合蛋白酶先對(duì)玉米谷蛋白進(jìn)行酶解，然后利用胃蛋白酶、胰蛋白酶模擬體內(nèi)消化處理，順序水解玉米谷蛋白水解物，對(duì)胃蛋白酶、胰蛋白酶的加酶量進(jìn)行優(yōu)化，制備富含谷氨酰胺的具有抗氧化活性的蛋白水解物，為其在食品工業(yè)的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

玉米黃粉：購(gòu)自黑龍江省龍鳳玉米開發(fā)有限公司；復(fù)合蛋白酶（1.5 AU/g）：購(gòu)自丹麥NovoNordisk公司；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶2 500）：購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2玉米谷蛋白的制備

擠壓膨化：參考鄭喜群報(bào)道的方法［7］。將玉米黃粉含水量調(diào)節(jié)為16%，放置過夜后，在160℃～180℃和1 MPa條件下，利用雙螺桿膨化機(jī)進(jìn)行玉米黃粉的膨化，膨化后的樣品粉碎后備用。

去除淀粉：用pH6.5的PBS緩沖液配制濃度為10%的膨化玉米黃粉懸浮液，加入α-淀粉酶（30 U/g）于懸浮液中，在pH6.5和60℃條件下反應(yīng)2 h。取出懸浮液于3 000 r/min離心20 min，取沉淀，用與PBS緩沖液等量的水洗滌濾餅3次。

去除醇溶蛋白：將去除淀粉后的玉米黃粉用70%乙醇60℃萃取2 h，料液比為1∶10（g/mL），取出懸浮液于3 000 r/min離心20 min（重復(fù)2次），取沉淀晾干后即得到粗的玉米谷蛋白。

玉米谷蛋白的提取純化（堿提酸沉法）：用0.1 mol/L NaOH進(jìn)行提取，料液比為1∶10（g/mL），60℃水浴震蕩2 h，取出懸浮液于3 000 r/min離心20 min，取上清液（重復(fù)以上方法，繼續(xù)反應(yīng)1 h），將兩次離心得到的上清液，用4 mol/L HCl調(diào)pH至4.8（谷蛋白等電點(diǎn)），混合液于3 000 r/min條件下離心20 min，將沉淀用70%乙醇溶液洗滌兩遍，用蒸餾水洗滌兩遍，所得濾餅冷凍干燥即可。

1.3玉米谷蛋白的酶解

以玉米谷蛋白為底物，溶于0.02 mol/L pH7.0的PBS緩沖液中（底物濃度為5%），利用復(fù)合蛋白酶酶解［（加酶量0.81%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）］，在50℃條件下反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后將水解物置于沸水浴中5 min滅酶，將樣液于3 000 r/min條件下離心20 min后，取上清液冷凍干燥，備用。

1.4玉米谷蛋白水解物的消化

一步消化：取酶解后的蛋白水解物，加入不同含量的胃蛋白酶，于37℃、pH2.0條件下反應(yīng)2 h，試驗(yàn)結(jié)束后將水解物置于沸水浴中滅酶5 min，對(duì)冷卻后的水解物進(jìn)行離心取上清液調(diào)pH至7.0后冷凍干燥，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性分析。

二步消化：取酶解后的水解物，按照已優(yōu)化的加酶量向其中加入胃蛋白酶，于37℃、pH2.0條件下反應(yīng)2 h后，加入不同含量的胰蛋白酶，于37℃、pH8.0條件下繼續(xù)反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后將水解物置于沸水浴滅酶5 min，將水解物離心后取上清液冷凍干燥，對(duì)二步消化產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化活性分析。

1.5水解物各性能指標(biāo)的測(cè)定

玉米谷蛋白總氮含量的測(cè)定采用凱氏定氮法［8］，樣品中可溶蛋白含量的測(cè)定采用Folin-酚法［9］，樣品水解度的測(cè)定采用pH-滴定法［10］，水解物分子量分布采用凝膠層析法［7］，溶解性的測(cè)定參考王俊彤報(bào)道的方法［11］。

樣品蛋白回收率（PR）/%=（水解后蛋白含量/原料蛋白含量）×100。

1.6羥基自由基清除率的測(cè)定

參考王曉杰報(bào)道的方法，有改動(dòng)［12］。采用固定反應(yīng)體系，在試管中依次加入0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，2.0 mL樣品溶液，0.5 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，6.5 mL水，以及0.5 mL、8.8 mmol/L的H2O2溶液，混合液于37℃水浴30 min，反應(yīng)結(jié)束后在510 nm處測(cè)量樣品的吸光值A(chǔ)1；取0.25 mL蒸餾水代替FeSO4溶液所測(cè)得的吸光值為A2，取2.0 mL蒸餾水代替樣品溶液所測(cè)得吸光值為A3，樣品對(duì)·OH的清除率Y/%= ［1-（A1-A2）/A3］×100。

1.7亞鐵離子螯合能力的測(cè)定

參考Kong等方法，有改動(dòng)［13］。取1 mL的蛋白水解物溶液加入試管中，加入0.05 mL 2 mmol/L FeSO4溶液，混勻后加入1.85 mL雙蒸水，然后加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪溶液，劇烈震蕩混勻，在室溫下放置10 min，測(cè)定反應(yīng)物在562 nm處的吸光值A(chǔ)s，以蒸餾水代替樣品作對(duì)照測(cè)得吸光值為Ac。則樣品對(duì)亞鐵離子的螯合能力為Y/%=［1-As/Ac］×100。

1.8還原力的測(cè)定

參考Oyaizu等方法，有改動(dòng)［14］。在試管中先加入2 mL的蛋白水解物溶液，然后再加入2 mL 0.2 mol/L 的pH6.6的PBS緩沖液，2 mL 1%鐵氰化鉀溶液搖勻，將試管放置在50℃水浴中反應(yīng)20 min，再加入2 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液，迅速震蕩搖勻后在4000r/min條件下離心10 min。離心結(jié)束后，取2 mL上清液，2 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液于試管中，迅速震蕩搖勻，將混合液在50℃水浴下反應(yīng)10 min，測(cè)定其在700 nm處的吸光值。

2　結(jié)果與討論

2.1玉米谷蛋白的酶解

玉米谷蛋白在食品工業(yè)常用的近中性pH條件下的水溶性差，可將其用蛋白酶水解予以改善。復(fù)合蛋白酶是經(jīng)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵而制得，作用位點(diǎn)廣泛，專一性不強(qiáng)。采用復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白，其水解度、可溶蛋白含量、蛋白回收率以及水解物的抗氧化活性如表1所示，水解物的分子量分布如圖1所示。

表1　復(fù)合蛋白酶酶解玉米谷蛋白水解度、可溶蛋白含量、蛋白回收率及抗氧化活性Table 1　DH，soluble protein content，yield and antioxidative activities of corn glutelin hydrolysate by protamex

圖1　復(fù)合蛋白酶水解玉米蛋白水解物的分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution profiles of the hydrolysates of CGM by Protamex

利用復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白，水解物的水解度只達(dá)到（5.05±0.44）%，但是蛋白水解物有較好的可溶性蛋白含量及蛋白回收率，且水解物的溶解性從（1.99±0.28）%升高到（92.67±0.40）%，溶解性得到了非常顯著的改善；而且水解物表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性。用凝膠色譜法分析的水解物的分子量分布結(jié)果表明，當(dāng)復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白的反應(yīng)時(shí)間為120 min時(shí)，有21%的水解物分子量大于6.5 kDa，40%水解物的分子量分布在1 kDa～6.5 kDa之間，而分子量分布小于1 kDa的水解物占39%。

一般來說，小分子量的水解物更容易被人體吸收利用，也常常表現(xiàn)出更好的生理活性?？紤]到上述用復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白的水解度偏低，水解物中分子量大于1 kDa的組分比例還較高，針對(duì)功能性消化不良癥狀人群，進(jìn)一步將富含谷氨酰胺的蛋白質(zhì)水解物進(jìn)行體外消化，可使水解物釋放出更小的肽段和功能性。

2.2一步消化加酶量對(duì)蛋白水解物抗氧化活性的影響

水解物經(jīng)過胃蛋白酶的消化易分解出谷氨酰胺，谷氨酰胺可以有效改善胃腸道功能，且胃蛋白酶水解蛋白可將蛋白質(zhì)多聚體水解成小分子的肽，使原來包埋于分子內(nèi)部的具有抗氧化作用的氨基酸暴露出來。但胃蛋白酶的用量將直接影響著產(chǎn)物抗氧化活性的高低，當(dāng)胃蛋白酶加酶量在0.1%～3%時(shí)，其對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響如表2所示。

表2　0.1%～3%的胃蛋白酶加酶量對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響Table 2　Effect of the concentration of pepsin between 0.1%and 3%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

由表2整體趨勢(shì)看出，玉米谷蛋白水解物經(jīng)胃蛋白酶進(jìn)一步水解后，其亞鐵離子螯合能力和還原力較一步消化前有小幅度的下降趨勢(shì)，但其羥基自由基清除率明顯提高。隨著消化反應(yīng)的進(jìn)行，肽鍵的斷裂和氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的暴露，都直接影響著消化產(chǎn)物的抗氧化活性。胃蛋白酶的加入使水解物生成更多的短肽，產(chǎn)物疏水性降低，從而使其與羥基基團(tuán)等的作用增強(qiáng)，起到了強(qiáng)化抗氧化的效果。當(dāng)胃蛋白酶加酶量為3%時(shí)產(chǎn)物的各項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)均與加1%胃蛋白酶時(shí)接近，但都較加0.1%胃蛋白酶時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化活性高，說明胃蛋白酶加酶量的增加使玉米蛋白水解物消化的更完全，綜合考慮，選定在1%～3%胃蛋白酶加酶量區(qū)間進(jìn)一步優(yōu)化來縮小蛋白酶的添加量范圍，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3看出，產(chǎn)物的各項(xiàng)指標(biāo)均隨著胃蛋白酶加酶量的增加有先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加1.5%的胃蛋白酶時(shí)，羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力均達(dá)到最大值，分別為（79.86±0.81）%、（63.32±1.20）% 及0.48±0.00。說明此時(shí)胃蛋白酶作用的位點(diǎn)已經(jīng)水解完全，所以選定其為適合的胃蛋白酶加酶量。

2.3二步消化胰蛋白酶量對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響

水解物進(jìn)入體內(nèi)，經(jīng)過胃進(jìn)入小腸，胰蛋白酶存在于小腸中，可以將蛋白質(zhì)水解為肽，進(jìn)而分解為氨基酸，這是蛋白質(zhì)能被機(jī)體吸收的必要過程。用加酶量為1%～7%的胰蛋白酶對(duì)玉米谷蛋白水解物經(jīng)胃蛋白酶作用后的產(chǎn)物進(jìn)行二步消化，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表4看出，谷蛋白水解物一步消化產(chǎn)物經(jīng)過胰蛋白酶進(jìn)一步作用后，產(chǎn)物的羥基自由基清除率，還原力有輕微下降的趨勢(shì)，但亞鐵離子螯合能力較一步消化后產(chǎn)物明顯升高，說明胰蛋白酶的加入阻礙了更多的Fe2+去催化反應(yīng)形成氧自由基的渠道，增強(qiáng)產(chǎn)物的抗氧化活性，且隨著胰蛋白酶加酶量的增大，各項(xiàng)抗氧化活性均有增大趨勢(shì)，當(dāng)加酶量達(dá)到7%時(shí)趨于穩(wěn)定，綜合考慮，當(dāng)胰蛋白酶加酶量在5%～7%之間抗氧化活性更好，但此試驗(yàn)區(qū)間范圍間隔較大，所以選定此區(qū)間進(jìn)一步優(yōu)化，以確定達(dá)到最佳抗氧化活性時(shí)的蛋白酶加酶量，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

由表5看出，經(jīng)過不同胰蛋白酶加酶量水解的產(chǎn)物各項(xiàng)指標(biāo)的作用效果都較為接近，若選用高濃度的胰蛋白酶進(jìn)行消化，造成了資源的浪費(fèi)，且胰蛋白酶的增加并不能更利于機(jī)體的消化，綜上，選用最少的加酶量即添加5%胰蛋白酶時(shí)為最優(yōu)比例，既節(jié)約成本，又達(dá)到了很好的抗氧化效果，此時(shí)羥基自由基清除率為（55.88±0.94）%；亞鐵離子螯合能力為（90.44± 0.67）%；還原力為0.40±0.01。

表31%～3%的胃蛋白酶加酶量對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響Table 3　Effect of the concentration of pepsin between 1%and 3%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

表41%～7%的胰蛋白酶加酶量對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響Table 4　Effect of the concentration of trypsin between 1%and 7%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

表55%～7%的胰蛋白酶加酶量對(duì)玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影響Table 5　Effect of the concentration of trypsin between 5%and 7%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

3　結(jié)論

本文以玉米蛋白粉為原料提取玉米谷蛋白，利用復(fù)合蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，得到的玉米谷蛋白水解物經(jīng)過胃蛋白酶及胰蛋白酶進(jìn)一步消化處理，以羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力為指標(biāo)對(duì)消化過程蛋白酶加酶量進(jìn)行優(yōu)化。復(fù)合蛋白酶水解玉米谷蛋白的水解物可溶性蛋白含量、蛋白回收率及水解度分別為（26.72±1.71）mg/mL、（54.41±3.26）%及（5.05± 0.44）%，其羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力分別達(dá)到（29.50±0.31）%、（73.33±0.62）%及0.50±0.01；1.5%胃蛋白酶消化上述水解物后，其羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力分別為（79.86±0.81）%、（63.32±1.20）%及0.48±0.00；5%胰蛋白酶二次消化酶解物的羥基自由基清除率、亞鐵離子螯合能力及還原力分別為（55.88±0.94）%、（90.44± 0.67）%及0.40±0.01。玉米谷蛋白經(jīng)復(fù)合蛋白酶和體外消化處理，生成富含谷氨酰胺的具有良好抗氧化活性的小肽混合物，其可作為適用于功能性消化不良癥狀人群的功能性食品基料。

［1］齊濤.中國(guó)玉米國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力研究［D］.西安：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011：1-3

［2］Magoichi Y，Masayasu T，Osamu N，et al.Preparation of corn peptide from gluten meal and its administration effect on alcohol metabolis in stroke-prone spontaneausly hypertensive rats［J］.J Nutr Sci Vitaminol，1996，42（3）：219-312

［3］Julie E，Hardwick.Enzymic hydrolysis of corn gluten meal［J］.Food Chem，1989，37（4）：1188-1192

［4］陳瑾，周小秋，馮琳.谷氨酰胺對(duì)動(dòng)物腸道抗氧化能力的影響［J］.飼料工業(yè)，2009，30（2）：55-57

［5］沈蓓英.玉米蛋白深層次開發(fā)［J］.糧食與油脂，1998（3）：39-40

［6］黃載偉.功能性胃腸病數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與功能分析［D］.廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2015：1-3

［7］鄭喜群.玉米黃粉酶解工藝及抗氧化活性肽制備［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：16-35

［8］張旭.蛋白質(zhì)的定量法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：29-38

［9］Lowry O H，Rosebrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurement with Folin phenol-reagent［J］.Journal of Biologyical Chemistry，1951，193 （1）：265-275

［10］Jens A N.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins［M］.London and New York：Elsevier Applied Science Publishers，1986：122-144

［11］王俊彤.改性玉米谷蛋白結(jié)構(gòu)、物性及水解物ACE抑制活性的研究［D］.齊齊哈爾：齊齊哈爾大學(xué)，2013：45

［12］王曉杰，鄭喜群，劉曉蘭，等.雙酶復(fù)合水解對(duì)玉米肽抗氧化活性的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（8）：102-105

［13］Kong B H，Xiong Y L.Antioxidant activity of zein hydrolysates in a liposome system and the possible mode of action［J］.J Agric Food Chem，2006，54（16）：6059-6068

［14］Oyaizu M.Studies on products of browing reaction：antioxidative activities of products of browing reaction prepared from glucosamine ［J］.Jpn J Nutr，1986，44（6）：307-315

Effect of in vitro Digestion on the Antioxidant Activities of Hydrolysate from Corn Glutelin

XU Rui-xue，LIU Xiao-lan*，WANG Jun-tong，ZHENG Xi-qun
（College of Food and Biotechnology，Qiqihar University/Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

In present paper，the corn glutelin was extracted from corn gluten meal（CGM），and then it was hydrolyzed by protamax.Further，the hydrolysate was digested by pepsin and trypsin，the concentrations of pepsin and trypsin were optimized when antioxidant activities of the hydrolysates as an evaluation criteria for the preparation of hydrolysate，which were rich in Gln.The results showed that the yield of hydrolysate by protamex was （54.41±3.26）%，and its hydroxy radical scavenging capacity，ferrous ion chelating ability and reducing power were（29.50±0.31）%，（73.33±0.62）%and 0.50±0.01，respectively.The hydroxy radical scavenging capacity，ferrous ion chelating ability and reducing power of the hydrolysates after the digestion were（55.88±0.94）%，（90.44±0.01）%and 0.40±0.01，respectively.

corn glutelin；digest；pepsin；trypsin

2016-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371726）；黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（ZD2016005）；黑龍江省高?？萍汲晒a(chǎn)業(yè)化前期研發(fā)培育項(xiàng)目資助計(jì)劃（1252CGZH05）；齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)局資助項(xiàng)目（GYGG-201208）；齊齊哈爾大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目（YJSCX2015-025X）

許瑞雪（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微生物遺傳學(xué)。

劉曉蘭（1962—），女（漢），教授，博士，研究方向：微生物遺傳學(xué)，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。