醇類對木醋桿菌JMCW-1合成細(xì)菌纖維素的影響

張子揚(yáng)，程　斐，李若云，胡加明，樂超文，李選奎，洪晨琿，周高峰

醇類對木醋桿菌JMCW-1合成細(xì)菌纖維素的影響

張子揚(yáng)1，程斐2，李若云1，胡加明1，樂超文1，李選奎1，洪晨琿1，周高峰1*

（1.紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312032）

研究了不同醇類對木醋桿菌JMCW-1的影響。結(jié)果表明，不同醇類的添加對發(fā)酵液的pH影響不大；添加乙醇、丙三醇、乙二醇的發(fā)酵液中殘?zhí)呛烤h(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組，添加聚乙二醇的發(fā)酵液中殘?zhí)呛侩S添加量的增加先稍稍降低再升高隨后又降低，添加聚乙烯醇的發(fā)酵液殘?zhí)呛侩S添加量的增加逐漸降低；添加乙二醇的發(fā)酵液OD值降低，添加其他5種醇的發(fā)酵液OD值升高；添加乙醇、丙三醇和聚乙烯醇可以提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，乙醇添加量為3.5%時，細(xì)菌纖維素的干質(zhì)量最高，達(dá)到22.6 g/L，為未添加時的7倍；甲醇的添加對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量無明顯影響。添加聚乙二醇、乙二醇對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有一定的抑制作用。

細(xì)菌纖維素；醇類；木醋桿菌

細(xì)菌纖維素是由產(chǎn)纖維素細(xì)菌產(chǎn)生的一種區(qū)別于植物纖維素的高分子化合物。與植物纖維素相比，其具有結(jié)晶度高、純度高、聚合度高的特點(diǎn)，并且細(xì)菌纖維素具有較高的生物相容性、適應(yīng)性和良好的生物可降解性。其彈性模量為一般植物纖維的數(shù)十倍，且抗張強(qiáng)度高，因此可作為一種新型的生物材料廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、造紙、醫(yī)藥等領(lǐng)域［1］。日本已將細(xì)菌纖維素應(yīng)用到了造紙行業(yè)中，將細(xì)菌纖維素加入紙漿，不僅可提高紙張強(qiáng)度和耐用性，而且解決了廢紙回收再利用后紙的纖維強(qiáng)度大為下降的問題。在普通紙漿中加入細(xì)菌纖維素可造出高品質(zhì)用紙（如印制紙幣），具有抗水性好、強(qiáng)度高的優(yōu)點(diǎn)［2-4］。目前細(xì)菌纖維素還是一種新型、重要的食品基料和膳食纖維。如傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中，由醋酸菌純種培養(yǎng)或醋酸菌和其他微生物混合培養(yǎng)，可產(chǎn)生含有豐富纖維素的發(fā)酵食品。目前對細(xì)菌纖維素的研究主要集中于如何提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量、降低細(xì)菌纖維素的成本［5-9］。在黃酒生產(chǎn)過程中會有大量的米漿水被當(dāng)作廢水排出，由于富含糖類等營養(yǎng)物質(zhì)會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化污染環(huán)境［10］。但是米漿水卻是產(chǎn)纖維素菌的良好培養(yǎng)基，因此可利用米漿水來生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，既保護(hù)了環(huán)境又節(jié)約了成本［11］。研究表明醇類對產(chǎn)細(xì)菌纖維素的有一定的影響［12-15］。

本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的6種醇類物質(zhì)，通過細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量等指標(biāo)的測定，來研究醇類物質(zhì)對所試菌株生長及產(chǎn)細(xì)菌纖維素的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

木醋桿菌（Acetobacter xylinus）JMCW-1：本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母浸膏0.5%，磷酸氫二鈉0.27%，檸檬酸0.115%，硫酸鎂0.025%，pH值為5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，酵母0.5%，磷酸氫二鈉0.5%，檸檬酸0.115%，硫酸鎂0.025%，pH值為5。

1.1.3試劑

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸鎂、甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、聚乙烯醇、聚乙二醇（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HWP-16型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-40SB1型立式高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；DHG-9070AS型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備公司；UV752型紫外分光光度計：尤尼克（上海）儀器公司。

1.3方法

1.3.1種子液的制備

配制種子培養(yǎng)基，分裝到錐形瓶中滅菌。按5%的接種量接入木醋桿菌，190 r/min、30℃搖床培養(yǎng)24 h左右，觀察菌的生長狀況，取出置于冰箱內(nèi)備用。

1.3.2醇類添加試驗(yàn)

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入體積分?jǐn)?shù)1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的甲醇、乙醇、乙二醇、丙三醇、聚乙二醇、聚乙烯醇，得到含醇發(fā)酵培養(yǎng)基。

將1.3.1中的種子液按5%的接種量接入含醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個平行樣品，以普通發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。在30℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，測定細(xì)菌纖維素膜的干質(zhì)、培養(yǎng)液pH值、總糖、總酸及菌體濃度。

1.3.3測定方法

纖維素膜產(chǎn)量的測定［3］：挑出纖維素膜。用蒸餾水洗凈，用4%的NaOH浸沒，80℃條件下浸泡2h。用蒸餾水將纖維素膜洗至pH為7，放進(jìn)烘箱干燥至質(zhì)量恒定，計算纖維素產(chǎn)量；發(fā)酵液pH的測定：用pH計測定；發(fā)酵液菌體濃度的測定［3］：纖維素膜用蒸餾水洗凈，加50 mL醋酸鈉-醋酸緩沖液，2mL纖維素酶液，放進(jìn)搖床內(nèi)振蕩，待纖維素膜全部溶解，過濾取濾液，用紫外分光光度計在波長600nm處測其吸光度值OD600nm，即為菌體濃度；發(fā)酵液總酸的測定［16］：滴定法；發(fā)酵液殘?zhí)堑臏y定［16］：亞鐵氰化鉀法測定。

2　結(jié)果與分析

2.1醇類對發(fā)酵液pH的影響

由圖1可知，添加各種醇類對各發(fā)酵液的pH變化影響有一定差異，丙三醇、乙醇對pH呈先下降再上升的趨勢，聚乙二醇和聚乙烯醇對pH值呈先上升后波動的趨勢，但是各種醇類的不同添加量對發(fā)酵液最終pH值影響不大［15］。

圖1　醇類添加量對發(fā)酵液pH的影響Fig.1 Effect of alcohols addition on the pH in fermentation broth

2.2醇類對發(fā)酵液殘?zhí)堑挠绊?/p>

圖2　醇類添加量對發(fā)酵液殘?zhí)呛康挠绊慒ig.2 Effect of alcohols addition on residual sugar content in fermentation broth

由圖2可知，乙醇、丙三醇、乙二醇發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮烤h(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對照組（添加量為0），可見添加這3種醇類物質(zhì)后糖被分解利用的量比較少。在聚乙烯醇添加量0～1.5%范圍內(nèi)殘?zhí)呛可撸诖穗A段聚乙烯醇可能作為能源物質(zhì)被分解利用；但隨著其添加量的增加殘?zhí)呛恐饾u降低，菌體大量利用培養(yǎng)基中的糖類，不利用聚乙烯醇，從而使培養(yǎng)液中殘?zhí)呛拷档?。在甲醇添加?～2.5%范圍內(nèi)殘?zhí)呛侩S醇添加量的增加而降低，甲醇添加量繼續(xù)增加，發(fā)酵液的殘?zhí)呛恳仓饾u增加，可能是因?yàn)榧状继砑恿吭?～2.5%范圍內(nèi)由于甲醇含量比較低不能被分解利用，但隨著甲醇含量的增加，甲醇逐漸被當(dāng)作能源物質(zhì)利用。

2.3醇類對菌體濃度的影響

由圖3可知，甲醇、乙醇、丙三醇、聚乙二醇、聚乙烯醇中菌體濃度均高于相應(yīng)空白對照組。雖然隨醇類添加量的增加菌體濃度也有所波動，但總體上菌體含量是高于空白對照組的，可見這5種醇對菌體的繁殖起到促進(jìn)作用。添加乙二醇的發(fā)酵液菌體濃度低于未添加乙二醇的發(fā)酵液菌體濃度，且隨乙二醇添加量的增加菌體濃度越來越少，可見即使微量的乙二醇也能夠抑制產(chǎn)纖維素菌的生長且隨添加量的增加抑制作用逐漸增強(qiáng)［16］。

圖3　醇類添加量對發(fā)酵液菌體濃度的影響Fig.3 Effect of alcohols addition on the biomass concentration in fermentation broth

2.4醇類對發(fā)酵液總酸的影響

表1　醇類添加量對發(fā)酵液總酸含量的影響Table 1 Effect of alcohols addition on the total acid content in fermentation broth　g/100 mL

由表1可知，添加乙醇的發(fā)酵液中總酸含量先增加后降低再增加，在添加量為3.5%時總酸含量最低。在丙三醇添加量為1.5%～2.5%時，發(fā)酵液中總酸含量低于空白對照組。聚乙二醇培養(yǎng)液中總酸含量隨添加量的增加依次升高并且高于空白對照組。添加甲醇時，總酸含量隨甲醇添加量的增加先降低后增加，添加乙二醇、聚乙烯醇時，發(fā)酵液中總酸含量隨醇添加量的增加先增加后降低。

2.5醇類對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖4　醇類對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of alcohols on bacterial cellulose production

由圖4可知，添加乙醇可以明顯提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，添加3.5%的乙醇，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到22.6 g/L，為未添加時的7倍；繼續(xù)增加乙醇添加量，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量變化不明顯。添加甲醇時細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量無明顯影響。添加聚乙二醇、乙二醇對細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有一定的抑制作用，抑制作用隨著聚乙二醇添加量的增加而加強(qiáng)，乙二醇在2.5%～3.5%抑制趨勢雖有所減弱但總體處于抑制狀態(tài)。添加丙三醇和聚乙烯醇，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有一定提高，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨著丙三醇添加量增加而增加；聚乙烯醇添加量為2.5%時達(dá)到最高，而后稍有降低。

3　結(jié)論

乙醇、丙三醇能夠促進(jìn)纖維素菌的生長繁殖，提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量，并且在其添加量為3.5%時細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量也最高；乙二醇和聚乙二醇對產(chǎn)細(xì)菌纖維素微生物的生長具有一定的抑制作用；適宜濃度的甲醇、聚乙烯醇能提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

［1］賈士儒，周竑宇.細(xì)菌纖維素的生物合成及其應(yīng)用［J］.化工科技市場，2001（2）：21-23.

［2］孫東平，徐軍，周伶俐，等.醋酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)雜志，2004，21（1）：12-22.

［3］常冬妹，盧紅梅，賈青慧，等.木醋桿菌合成細(xì)菌纖維素增效因子的篩選［J］.中國釀造，2015，34（5）：35-39.

［4］賈青慧，陳莉，張麗萍，等.增效因子對木醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素發(fā)酵液中物質(zhì)變化的影響［J］.中國釀造，2016，35（1）：14-18.

［5］施慶珊.細(xì)菌纖維素的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)雜志，2004，21（5）：12-15.

［6］MOHITE B V，SALUNKE B K，PATIL S V.Production of bacterial cellulose by usingGluconacetobacter hanseniiNCIM 2529 strain under shaking conditions［J］.Appl Biochem Biotechnol，2013，169（5）：1497-1511.

［7］李斌，鐘春燕，向東，等.椰纖果發(fā)酵液中降解細(xì)菌纖維素酵母菌株的分離及鑒定［J］.中國釀造，2014，33（7）：51-54.

［8］蘇建宇，喬長屈.木醋桿菌靜態(tài)培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究［J］.寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2001，21（1）：34-35.

［9］蔣雪薇，葉菁，周尚庭，等.成品醬油微生物污染變質(zhì)的風(fēng)險預(yù)警［J］.食品與機(jī)械，2016，32（4）：67-70.

［10］李海霞.黃酒工業(yè)米漿水回收利用關(guān)鍵技術(shù)研究及其應(yīng)用［D］.杭州：浙江大學(xué)，2012.

［11］俞衛(wèi)華.米漿水循環(huán)利用處理方法的研究［D］.杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2002.

［12］茍金霞，齊香君，賀小賢.乙醇對提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響［J］.食品研究與開發(fā)，2005，26（2）：55-57.

［13］王海波，關(guān)鳳梅，馬霞，等.改性細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)及性能測定［J］.食品科技，2009，34（5）：30-33.

［14］LI Y J，TIAN C J，TIAN H.Improvement of bacterial cellulose production by manipulating the metabolic pathways in which ethanol and sodium citrate involved［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2012，96（6）：1479-1487.

［15］KOSE R，SUNAGAWA N，YOSHIDA M，et al.One-step production of nanofibrillated bacterial cellulose（NFBC）from waste glycerol using Gluconacetobacter intermediusNEDO-01［J］.Cellulose，2013，20：2971-2979.

［16］王福榮.釀酒分析與檢測［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：201-203.

Effects of alcohols on the production of bacterial cellulose byAcetobacter xylinusJMCW-1

ZHANG Ziyang1，CHENG Fei2，LI Ruoyun1，HU Jiaming1，LE Chaowen1，LI Xuankui1，HONG Chenhui1，ZHOU Gaofeng1*
（1.College of Life Science，Shaoxing University，Shaoxing 312000，China；2.Zhejiang Pagoda Brand Shaoxing Rice Wine Co.，Ltd.，Shaoxing 312032，China）

The effect of different alcohols onAcetobacter xylinusJMCW-1 was studied.The results showed that different alcohols addition had little effect on the pH of fermentation broth.Residual sugar levels in the broth added ethanol，glycerol，ethylene glycol were much higher than that in control group.Residual sugar levels in the broth added polyethylene glycol first lowered and then increased slightly and subsequently reduced.Residual sugar levels in the broth added polyvinyl alcohol gradually decreased.The OD in the broth added glycol decreased，and the OD in the broth added other alcohols increased.Ethanol，glycerol，and polyvinyl alcohol can increase the yield of bacterial cellulose；the dry weight of bacterial cellulose reached the highest 22.6 g/L with ethanol addition 3.5%，which was seven times of the blank group.Methanol had no significant effect on bacterial cellulose production.Polyethylene glycol and ethylene glycol had a certain inhibition on bacterial cellulose production.

bacterial cellulose；alcohols；Acetobacter xylinus

Q939.97

0254-5071（2016）07-0099-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.021

2016-03-21

紹興文理學(xué)院校級科研項(xiàng)目（2013LG1007）

張子揚(yáng)（1993-），男，本科生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化。

周高峰（1986-），男，助教，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵原理。