新疆塔城地區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中酵母菌的分離鑒定

蘆文娟，李寶坤，盧士玲

新疆塔城地區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中酵母菌的分離鑒定

蘆文娟，李寶坤*，盧士玲

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

為保護(hù)新疆哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中的優(yōu)良酵母菌株，從新疆塔城牧區(qū)不同牧場(chǎng)采集的10份哈薩克族傳統(tǒng)奶酪樣品中，分離得到44株酵母菌。采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定、5.8SrDNA序列同源性分析相結(jié)合的方法，對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定。共鑒定出5個(gè)種，其中34株庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），為優(yōu)勢(shì)菌株，6株戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii），2株乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis），1株馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），1株發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）。結(jié)果表明，哈薩克族傳統(tǒng)奶酪制品中所含酵母菌與其他地區(qū)的存在差異性，有其獨(dú)特的酵母菌資源。

奶酪；奶酪；酵母菌；分離鑒定

新疆屬溫帶大陸性干旱氣候，年溫差與日溫差極大，在降水和氣溫方面，地區(qū)的差異也非常顯著［1］，新疆也是中國(guó)四大牧場(chǎng)之一，世代生存游牧民族，有很多的少數(shù)民族，他們一直保留著自制并食用傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的習(xí)慣，使得新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品具有鮮明的地域特點(diǎn)。奶酪就是各族少數(shù)民族非常喜歡食用一類(lèi)自制發(fā)酵乳制品。奶酪具有獨(dú)特的風(fēng)味，不僅能夠增強(qiáng)人體的抵抗力，還能夠促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，增強(qiáng)活力；膽固醇含量較低，對(duì)心血管健康有一定的益處；同時(shí)奶酪還是含鈣最多的奶制品，這些鈣類(lèi)也較易被吸收［2］。當(dāng)?shù)鼐用裱赜霉爬隙鴤鹘y(tǒng)的方法生產(chǎn)發(fā)酵奶酪，這種原生態(tài)的制作方法，較好地保留了發(fā)酵乳制品的風(fēng)味，富含了當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的豐富的微生物資源，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，并具有較好的益生作用［3］。
但隨著工業(yè)化的發(fā)展，游牧生活日漸減少，這種傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的制作也隨之減少，其中富含的豐富微生物資源面臨丟失的困境。近幾年，許多學(xué)者對(duì)新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的微生物進(jìn)行了研究，但傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中對(duì)酵母菌種的研究相對(duì)乳酸菌還非常少，并且由于所采樣品地區(qū)和民族之間的差異，使分離得到的微生物種類(lèi)和數(shù)量存在較大的差異性［4］。

本研究以新疆塔城牧區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪為原料，采用形態(tài)學(xué)、生理生化特性、5.8S rDNA序列同源性分析相結(jié)合的方法對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，并對(duì)奶酪中酵母菌的分布和種類(lèi)的多樣性進(jìn)行分析。不僅能夠系統(tǒng)地收集和保存新疆塔城牧區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中的酵母菌，豐富我國(guó)的酵母菌資源；也有利于更加深入準(zhǔn)確地了解酵母菌種資源在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中的分布。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品來(lái)源

新疆哈薩克族奶酪：采自新疆塔城喀拉也木勒、烏宗布拉克、二道橋等10個(gè)牧場(chǎng)。

1.1.2培養(yǎng)基［5］

菌種的分離使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，純化和保存使用酵母膏胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YEPD）平板和斜面培養(yǎng)基。

鑒定用培養(yǎng)基使用Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基、氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基、糖發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)酯基礎(chǔ)培養(yǎng)基、產(chǎn)類(lèi)淀粉培養(yǎng)基。

1.1.3主要試劑

酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、2xTaq PCR MasterMix：天根生化科技有限公司；GoldView核酸染色劑：北京索萊寶科技有限公司；引物ITS1和ITS4：上海生工生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

W-CJ-1Cg超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備公司；5417R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；COVER-015普通光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；TC-512聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chainreaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國(guó)Techne公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1酵母菌的分離與純化

取1 g奶酪樣品，溶于9 mL無(wú)菌水中，采取稀釋平板法涂于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離，平板置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，觀察并記錄菌落特征，挑取不同形態(tài)單個(gè)菌落，進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，觀察細(xì)胞形態(tài)，重復(fù)幾次純化酵母菌，直至鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于YEPD固體斜面培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)36～48 h后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2酵母菌的生理生化特性鑒定

酵母菌分離菌株主要通過(guò)繁殖方式觀察、子囊孢子形成實(shí)驗(yàn)、擲孢子形成實(shí)驗(yàn)、菌絲形成實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳源同化實(shí)驗(yàn)、氮源同化實(shí)驗(yàn)、類(lèi)淀粉化合物生成實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)等生理生化特征進(jìn)行鑒定［5-6］。

1.3.3酵母菌的5.8S rDNA分析

（1）酵母菌基因組DNA的提取

將上述純化的酵母菌接種于YEPD液體培養(yǎng)基中置于25℃培養(yǎng)36 h后，取1 mL活化菌懸液，12 000 r/min離心1 min，收集沉淀即為菌體。按照酵母菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）說(shuō)明書(shū)上的方法進(jìn)行操作，然后將所提取的DNA于-20℃保存。

（2）5.8S rDNA PCR擴(kuò)增

將上述制備的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，使用引物ITS 1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS 4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［7］對(duì)5.8S-ITS區(qū)域酵母菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增；采用50μL反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，ITS1（10 μmol/L）2 μL，ITS4（10 μmol/L）2 μL，2xTaqPCR MasterMix 25 μL，加ddH2O補(bǔ)至50 μL。

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)為35次；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓100 V，電泳液為1×TAE。電泳后，用GoldView染色20 min，紫外燈下觀察，拍照。

（3）擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)合格后，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的5.8S rDNA基因序列，采用軟件Mega5.0中的Neighbor-Joining方法與標(biāo)準(zhǔn)菌株基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1分離菌株形態(tài)特征

酵母菌在經(jīng)YEPD培養(yǎng)基活化后，將分離菌株在普通光學(xué)顯微鏡下，觀察菌落和細(xì)胞形態(tài)。酵母菌菌落形態(tài)如圖1、表1所示，細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式見(jiàn)表2。

圖1　分離酵母菌株菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated yeasts

由圖1和表1可知，采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)分離的方法，從采集的10個(gè)奶酪樣品中，經(jīng)過(guò)菌種的分離純化，共得到44株酵母菌，酵母菌菌落形態(tài)呈圓形或橢圓形，顏色呈乳白色或淡黃色，表面光滑或干燥，邊緣整齊，表面凸起，呈現(xiàn)半透明狀或不透明。由表2可知，分離菌株繁殖方式多為無(wú)性繁殖，且無(wú)菌絲或有假菌絲，細(xì)胞形態(tài)多為圓和橢圓形，細(xì)胞形態(tài)符合酵母菌特征。

表1　分離菌株的菌落形態(tài)鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of colony morphology of isolated strains

續(xù)表

表2　分離菌株細(xì)胞形態(tài)和繁殖方式鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of cell morphology and reproductive modes of isolated strains

2.2分離菌株的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果

酵母菌的理化性質(zhì)鑒定結(jié)果見(jiàn)表3，碳源、氮源同化鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

表3　酵母菌的生理生化性質(zhì)鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of physiological and biochemical properties of yeasts

表4　碳源、氮源同化鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of carbon and nitrogen source assimilation

由表3、表4可知，采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性方法對(duì)酵母菌進(jìn)行鑒定，依據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株均為芽殖，有些有假菌絲，在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，除葡萄糖發(fā)酵外不發(fā)酵其他被檢糖，在碳源同化實(shí)驗(yàn)中可同化乙醇和檸檬酸，氮源同化實(shí)驗(yàn)中不能同化硝酸鹽，屬于畢赤氏酵母屬（Pichia）；部分分離菌株（如菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4和9-6）葡萄糖發(fā)酵陽(yáng)性，硝酸鹽還原、類(lèi)淀粉物質(zhì)的生成試驗(yàn)陰性，屬于有孢圓酵母屬（Torulaspora）；還有部分菌株僅依據(jù)生理生化鑒定結(jié)果，無(wú)法對(duì)其種屬進(jìn)行判斷。

2.3酵母菌的5.8S rDNA鑒定

2.3.1分離菌株5.8S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)44株酵母菌分離株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在450～750 bp之間獲得特異性擴(kuò)增條帶，符合酵母菌5.8S rDNA區(qū)理論預(yù)期值［8］，可初步鑒定為酵母菌。

圖2　分離菌株5.8S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification products electrophoretogram of 5.8S rDNA of isolated strain

2.3.2基于5.8S rDNA基因序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析44株分離酵母菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果如表5所示。

表5　44株酵母菌的ITS序列鑒定結(jié)果Table 5 Identification results of ITS sequence of 44 yeast strains

由表5可知，奶酪中的44株分離株，經(jīng)鑒定屬于3屬5種，其中庫(kù)德畢赤酵母（P.kudriavzevii）為優(yōu)勢(shì)菌株，占總分離菌株中的77%；其次為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）。

從44株分離菌株中挑選出生長(zhǎng)較為旺盛、生理生化特征典型、具有代表性的15株分離菌株（1-1、2-1、3-5、4-2、 4-5、5-3、6-2、7-1、8-1、9-3、9-4、9-6、10-3、10-4、10-6），在NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列搜索，以比較分離出的酵母菌菌株與已知酵母菌菌株相應(yīng)序列的相似程度，基于ITS區(qū)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示。

圖3　15株分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 15 isolated strains

由圖3可知，分離菌株10-4與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性為97%，根據(jù)酵母種類(lèi)的劃分依據(jù)，同源相似率低于99%的，不能劃為同一個(gè)種［9］，但結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，可判斷此菌株為馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。其余所有分離菌株與之對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在99%及以上，表明其具有較近的親緣性。菌株4-2、4-5、7-1、9-3、9-4、9-6鑒定為戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）；菌株10-3鑒定為乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）；菌株10-6鑒定為發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）；菌株1-1、2-1、3-5、5-3、6-2、8-1鑒定為庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）。

JAKOBSEN M等［10］發(fā)現(xiàn)奶酪中漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、溶磷白地霉（Galactomyces geothricum）和解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）是最主要的酵母種屬；LOPANDIC K等［11］研究表明，新鮮奶酪中常分離出涎沫假絲酵母菌（Candida zeylanoides）、馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）；MOGENS J等［12］認(rèn)為通常干酪中的酵母主要有白地霉（Geotrichum candidum）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）、鏈形念珠菌（Candida catenulate）、解脂耶羅維亞酵母（Yarrowia lipolytica）；馬春燕等［13］對(duì)新疆哈薩克族傳統(tǒng)手工發(fā)酵制作的乳酪中所含發(fā)酵菌的種類(lèi)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明其中的主要酵母菌為單孢釀酒酵母（Saccharomyces unisporus）和東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）；李宇輝等［14］從新疆伊犁牧區(qū)采集奶酪樣品20份，經(jīng)鑒定主要的酵母菌為發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由此來(lái)看，本研究分離得到的酵母菌有其獨(dú)特的發(fā)酵菌種類(lèi)，可能與其傳統(tǒng)的制作方法，當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境、氣候、發(fā)酵溫度［15］等因素有關(guān)。但從目前許多對(duì)發(fā)酵乳制品中酵母菌的研究來(lái)看，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)傳統(tǒng)乳制品中庫(kù)德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）的詳盡報(bào)道。

3　結(jié)論

本研究對(duì)新疆塔城地區(qū)哈薩克族傳統(tǒng)奶酪中的酵母菌進(jìn)行分離鑒定，從采集的10份樣品中分離純化得到44株酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和對(duì)5.8S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明，44株酵母菌中有6株為戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）；2株為乳酸克魯維酵母（K.lactis）；1株為發(fā)酵畢赤酵母（P. fermentans）；1株為馬克思克魯維酵母（K.marxianus）；剩余34株均為庫(kù)德畢赤酵母（P.kudriavzevii）。

全面系統(tǒng)地了解塔城牧區(qū)奶酪中酵母菌的構(gòu)成，并對(duì)其中性能優(yōu)良的酵母菌菌種進(jìn)行收集和保存，使這一寶貴的資源得到保護(hù)，避免酵母菌資源的丟失，深入地研究和認(rèn)識(shí)酵母菌資源，這對(duì)我國(guó)酵母菌資源的保護(hù)、開(kāi)發(fā)和利用有著重要意義。

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［2］董曉婉.新疆和布克賽爾縣哈薩克族和蒙古族傳統(tǒng)乳制品中乳酸菌菌群多樣性的研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2014.

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Isolation and identification of yeast from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang

LU Wenjuan，LI Baokun*，LU Shiling
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

In order to protect superior yeast strains from traditional cheese of Kazak in Tacheng region of Xinjiang，44 yeast strains were isolated from 10 samples of traditional cheese.The isolated strains were identified by colonial morphology，physiological and biochemical characteristics identification and 5.8S rDNA sequence homology analysis.Five species were identified，including 34 strains ofPichia kudriavzevii，six strains ofTorulaspora delbrueckii，two strains ofKluyveromyces lactis，one strain ofKluyveromyces marxianusand one strain ofPichia fermentans.Results showed that the yeasts in traditional cheese of Kazak were different with that in other regions，and had its unique resources.

cheese；yeast；isolation and identification

TS201.3

0254-5071（2016）07-0024-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.006

2016-03-07

國(guó)家自然基金地區(qū)項(xiàng)目（31460007）

蘆文娟（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿橹破肺⑸铩?/p>

李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿橹破肺⑸铩?/p>