培養(yǎng)條件對金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合生物被膜的影響

劉晶晶，陳晶瑜

培養(yǎng)條件對金黃色葡萄球菌-大腸桿菌混合生物被膜的影響

劉晶晶，陳晶瑜*

（中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083）

以常見食源性致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為研究對象，采用微孔板法對混合生物被膜形成過程中的不同影響因素進行了研究。結果表明：在25℃或30℃條件下，采用質量分數(shù)0.8%的胰酶大豆肉湯（TSB）或0.8%的腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基培養(yǎng)時，生物被膜形成量較高；添加適量的葡萄糖、乳糖、麥芽糖和蔗糖可提高混合生物被膜形成能力；培養(yǎng)基中NaCl質量分數(shù)＞8%時，混合生物被膜的生長明顯受到抑制。

金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；雙菌種生物被膜；培養(yǎng)條件

生物被膜（biofilm，BF）是指粘附于接觸表面，分泌胞外多聚物，將其自身包圍其中而形成的微生物群落［1］。在食品生產環(huán)境中，生物被膜一旦形成，常規(guī)消毒方法可能無法對其進行有效清除，而生物被膜中的細胞一旦脫離，就會發(fā)生食品交叉污染，因此給食品安全帶來極大威脅［2］。

在自然條件下，大多數(shù)生物被膜是由多種微生物組成的混合生物被膜，這增加了不同菌種之間的相互作用和胞外分泌物的復雜性，從而改變生物被膜菌種的生理特性以及整個被膜的功能［3］。有研究表明，由單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantaru）形成的混合生物被膜，其對消毒劑的抵抗能力比浮游態(tài)和單一菌株生物被膜態(tài)強［3］。ADAMB等［4］報導，在白色念珠菌（Candida albicans）與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）形成的混合菌種生物被膜中，表皮葡萄球菌分泌的胞外多聚物能有效抑制抗真菌藥物氟康唑的滲透，并為不產粘液的白色念珠菌形成保護膜。由此可見，食品加工環(huán)境中非生物表面上食源性病原菌混合生物被膜的研究是至關重要的。

影響生物被膜形成的因素有很多，而營養(yǎng)供應和環(huán)境條件被認為是調控微生物粘附行為以及生物被膜形成的重要因素。如在HAMANAKA D等［5］的實驗中，假單胞菌生物被膜明顯受到培養(yǎng)溫度和營養(yǎng)水平的影響。NGUYEN D等［6］在其研究中提出，可將生物被膜的生長溫度和pH作為柵欄因子從而達到控制生物被膜形成的目的。此外，靳嘉巍等［7］研究了葡萄糖對生物被膜誘導的分子機制，研究結果表明葡萄糖可能是通過誘導表皮葡萄球菌ica基因的表達和多聚β-1，6-2-脫氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖（PIA）的合成，促進生物被膜的形成。邢盼盼［8］對食品加工設備中金黃色葡萄球菌生物被膜的研究表明，麥芽糖對生物被膜的形成有微弱的誘導作用。由此可見，探究一些常見的環(huán)境條件參數(shù)對混合生物被膜形成的影響，可為探索食品生產過程中生物被膜的控制方法提供一定理論依據(jù)。本研究考察了不同培養(yǎng)條件對兩種常見食源性病原菌（大腸桿菌與金黃色葡萄球菌）混合生物被膜形成的影響，以期了解混合生物被膜的特性并為建立混合生物被膜的控制方法提供基礎數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌（Escherichia coli）：分離自北京市某農貿市場生肉區(qū)，本研究室分離、鑒定并保藏。

1.1.2試劑

蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、結晶紫、草酸銨、甲醇、冰醋酸（均為分析純）：北京北化精細有限責任公司。

1.1.3培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L。腦心浸出液培養(yǎng)基（brain-heart infusion medium，BHI）：蛋白胨10 g/L，脫水小牛腦浸粉12.5 g/L，脫水牛心浸粉5 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖2 g/L，磷酸氫二鈉2.5 g/L。

1.2儀器與設備

Wellscan MK3酶標儀：美國熱電有限公司；YW30Z高壓濕熱滅菌鍋：北京科瑞科學儀器材有限公司；LHR-150（F）生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；YT-CJ-2ND型潔凈工作臺：亞泰科隆儀器技術有限公司。

1.3方法

1.3.1種子液制備

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活化后分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)至OD600nm約為1.0左右，制成種子液備用［9］。

1.3.2雙菌種混合生物被膜的培養(yǎng)

首先向96孔細胞培養(yǎng)板中每孔添加200 μL制備好的無菌培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液按照體積比1∶1混勻后以1%的接種量進行接種。最后，將接種的孔板分別置于25℃、30℃、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每一實驗組及對照組設置3個平行，對照孔只加無菌培養(yǎng)基，每24 h更換一次新鮮培養(yǎng)基。

1.3.3結晶紫染色法對混合生物被膜形成能力的檢測

培養(yǎng)結束后，棄去培養(yǎng)基，并用300 μL無菌磷酸鹽緩沖液沖洗3次，洗去浮游菌體和雜質；然后于每孔中添加200μL無水甲醇固定15min，隨后將懸浮液移去，并于60℃烘箱中干燥固定1 h；于每孔中添加2%的結晶紫200 μL染色20 min，用自來水沖洗干凈，干燥；每孔添加體積分數(shù)為33%的冰醋酸300 μL，室溫靜置10 min；在波長630 nm處測定吸光度值［10］，吸光度值可反映生物被膜的形成能力，其值高于0.24均被認為可形成較厚的生物被膜［11］。

1.3.4培養(yǎng)基質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響

分別配制質量分數(shù)為0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、 6.4%的TSB和BHI培養(yǎng)基，每孔添加200 μL上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測如上所述，每一實驗組及對照組設置三個平行，對照孔只加無菌培養(yǎng)基，每24 h更換一次新鮮培養(yǎng)基［12］。

1.3.5 NaCl質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響

分別配制含NaCl質量分數(shù)為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的（3%，w/w）TSB培養(yǎng)基，每孔分別添加200 μL上述培養(yǎng)基，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測如上所述，平行試驗3次［13］。

1.3.6單一碳源對混合生物被膜形成能力的影響

為研究食品加工廠中常見碳源對混合生物被膜形成能力的影響，首先配制含不同質量分數(shù)0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%葡萄糖的（3%，w/w）TSB培養(yǎng)基，每孔添加200μL培養(yǎng)，培養(yǎng)方式和混合生物被膜形成能力的檢測如上所述，平行試驗3次，再以蔗糖、麥芽糖和乳糖替換葡萄糖來配制不同糖含量的TSB培養(yǎng)基（糖含量和生物被膜培養(yǎng)方式同上）檢測不同糖分對生物被膜形成能力的影響［14］。

1.3.7數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2　結果與分析

2.1不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)基質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響

在食品工廠中生長的細菌經常處于波動的營養(yǎng)環(huán)境中，而營養(yǎng)供應被認為是調控微生物黏附行為以及生物被膜形成的重要因素。HAMANAKA D等［5］對假單胞菌生物被膜的研究顯示，單菌種生物被膜在20倍稀釋的TSB培養(yǎng)基中比正常濃度的TSB培養(yǎng)基中生長狀況好。因此，本研究分別測定了TSB質量分數(shù)和BHI含量對混合生物被膜形成能力的影響，結果（見圖1）可知，在兩種培養(yǎng)基條件下混合生物被膜的形成呈現(xiàn)出相同的趨勢，即在較低培養(yǎng)溫度（25℃或30℃）下，當培養(yǎng)基質量分數(shù)由0.2%增加至0.8%時，混合生物被膜活菌數(shù)呈上升趨勢，隨后，隨著培養(yǎng)基質量分數(shù)的升高被膜形成量下降。這說明混合生物被膜在貧營養(yǎng)條件下生長較好，推測可能是由于貧營養(yǎng)條件給細菌造成了一個脅迫環(huán)境，導致細菌更加傾向于呈生物被膜態(tài)生長，最終處于相對安全的環(huán)境。所不同的是，在37℃條件下，隨TSB含量增加，混合生物被膜生長呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢；而在37℃下BHI環(huán)境中，混合生物被膜生長狀況與培養(yǎng)基質量分數(shù)卻沒有顯著的相關性。可能在不同溫度下，微生物形成被膜的最適營養(yǎng)濃度不同，而且混合生物被膜對營養(yǎng)物質具有一定的選擇性。由此得出，在25℃或30℃條件下，TSB和BHI培養(yǎng)基質量分數(shù)為0.8%時混合生物被膜生長較好，質量分數(shù)為3.2%～6.4%時，混合生物被膜被有效抑制。

圖1　不同培養(yǎng)溫度下TSB（A）和BHI（B）質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響Fig.1 Effect of TSB（A）and BHI（B）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.2不同培養(yǎng)溫度下NaCl質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響

由于生物被膜在非生物表面的形成給食品工業(yè)造成了重大隱患，因此控制生物被膜的生長對食品工廠至關重要。高濃度NaCl溶液可以產生滲透壓，讓細菌細胞脫水，導致其失水死亡，由此推斷NaCl溶液可以有效抑制生物被膜的生長。因此，本實驗研究了NaCl質量分數(shù)對混合生物被膜的影響，以期為開發(fā)安全有效的生物被膜清除方案提供基礎數(shù)據(jù)。不同溫度下NaCl質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著NaCl質量分數(shù)的升高，混合生物被膜的形成量逐漸下降，當NaCl質量分數(shù)＞8%時，不同培養(yǎng)溫度下金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合生物被膜的生長均受到明顯抑制。這一結果與單一菌種生物被膜的研究數(shù)據(jù)很相近；鄧旗等［13］研究報道，當NaCl質量分數(shù)為10%時，希瓦氏菌幾乎不能形成生物被膜。由此可見，一定含量的NaCl可以十分有效地抑制生物被膜的形成。此外，較低溫度條件下（25℃或30℃），NaCl質量分數(shù)＞2%時，混合生物被膜的生長受到明顯抑制。由此可見，在食品工業(yè)中，若有條件使用較高濃度的NaCl溶液來清洗食品接觸面并結合環(huán)境溫度，可以有效預防生物被膜的形成。

圖2　不同培養(yǎng)溫度下NaCl質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

圖3　不同培養(yǎng)溫度下麥芽糖（a），葡萄糖（b），乳糖（c），蔗糖（d）質量分數(shù)對混合生物被膜形成能力的影響Fig.3 Effect of maltose（a），glucose（b），lactose（c），sucrose（d）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.3單一碳源對混合生物被膜形成能力的影響

碳源是調控微生物黏附行為以及生物被膜形成的重要因素，對于控制生物被膜的形成有著重要意義［15］。在單一菌種生物被膜的研究中曾顯示，簡單碳源在特定的濃度條件下可對金黃色葡萄球菌生物被膜的生長有微弱或較強的誘導作用［16］。為了了解混合生物被膜在不同碳源條件下的特性，研究了食品中四種常見碳源（麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖）在不同溫度下對混合生物被膜形成能力的影響，結果（見圖3）可知，不同溫度下混合生物被膜的形成量隨糖質量分數(shù)增加而呈現(xiàn)上升趨勢，說明這四種常見的簡單碳源均對混合菌種生物被膜的形成有促進作用。此外，在25℃條件下，麥芽糖和乳糖質量分數(shù)由0.2%增至1.4%時，混合生物被膜形成較快，但在此濃度范圍內，隨著葡萄糖質量分數(shù)的增加，混合生物被膜生長呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，而蔗糖對混合生物被膜的形成沒有顯著影響；在30℃條件下，麥芽糖、葡萄糖和乳糖質量分數(shù)由0.6%增至1.4%時，混合生物被膜形成較快，而在此濃度范圍內，蔗糖略微促進混合生物被膜形成，并在蔗糖質量分數(shù)為1.0%時，混合生物被膜形成能力最強（OD600nm為0.6）；在37℃條件下，麥芽糖和乳糖質量分數(shù)在0至1.4%范圍內，隨著糖含量增加，能促進混合生物被膜形成；而隨著葡萄糖和蔗糖濃度增加，混合生物被膜呈現(xiàn)波動上升的趨勢。由此揭示，從“防重于治”的觀點來看，在食品工業(yè)中，應盡量清除殘留在加工環(huán)境中的糖成分，以防止誘導病原微生物生物被膜的形成。

3　結論

培養(yǎng)基成分、溫度、鹽含量、糖含量等因素均能顯著影響金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合生物被膜的生長。在25℃或30℃條件下，TSB和BHI培養(yǎng)基質量分數(shù)為0.8%時混合生物被膜生長較好；在25℃、30℃或37℃條件下，NaCl質量分數(shù)為8%時能有效抑制生物被膜形成。而不同溫度下，簡單碳源均對混合菌種生物被膜的形成均有促進作用。因此在食品工業(yè)中如牛奶廠、甘蔗汁廠、麥芽糖生產廠等，要結合生產食品的差異性，選擇有效的手段控制混合生物被膜的生長，盡可能對加工設備及時清理，減少食品接觸表面各種糖分的殘留量，從而避免對微生物提供生長的溫床，降低損失。

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Effects of culture conditions on the growth of dual-species biofilm formed byStaphylococcus aureusandEscherichia coli

LIU Jingjing，CHEN Jingyu*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Effects of different factors on the growth of dual-species biofilm，which was formed by the most common foodborne pathogenic bacterial Staphylococcus aureusandEscherichia coli，were studied by microtiter-plate method.The results showed thatS.aureusandE.coliformed high quality biofilms at 25℃or 30℃in 0.8%TSB or BHI medium.The addition of glucose，lactose，maltose，and sucrose improved the growth of the dual-species biofilm，respectively.The formation ability of dual-species was significantly inhibited by adding sodium chloride more than 8%.

Staphylococcus aureus；Escherichia coli；dual-species biofilm；culture condition

TS201.3

0254-5071（2016）07-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.005

2016-01-19

國家自然科學基金面上項目（31371716）；北京高等學校青年英才計劃項目（YETP0310）

劉晶晶（1990-），女，博士研究生，研究方向為酶工程。

陳晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。