亞損傷狀態(tài)下枯草芽孢桿菌芽胞萌芽影響因素的研究

?！〕?，潘　麗，伍金娥，張　喆（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

亞損傷狀態(tài)下枯草芽孢桿菌芽胞萌芽影響因素的研究

常超，潘麗，伍金娥，張喆
（武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

為了研究食品中營養(yǎng)要素對處于亞損傷狀態(tài)枯草芽孢桿菌芽胞的影響，采用分批培養(yǎng)法，利用食品中存在的碳源、氮源、無機(jī)鹽離子等分別誘導(dǎo)芽胞萌芽，采用正交實(shí)驗(yàn)研究了溫度、pH、接種量、溶氧量對芽胞萌芽率的影響，分別在OD580下測定其光密度值，得到芽胞萌芽率。結(jié)果顯示，麥芽糖、乳清蛋白是芽胞萌芽的最佳碳源、氮源；無機(jī)鹽MgSO4對芽胞萌芽產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)作用。以麥芽糖（5 mg/mL），MgSO4（5 mg/mL），乳清蛋白（5 mg/mL）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，芽胞的最佳生長條件為：接種量4%、pH7.0、溶氧量70 mL，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)60 min，得芽胞萌芽率最大為15.27%。

枯草芽孢桿菌，亞損傷狀態(tài)，萌芽，影響因素

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）具有代謝旺盛，能分泌脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等，廣泛分布于空氣、水體、土壤、生物體的體表等，同時也是污染食品的最常見的芽胞菌之一［1］。在寡營養(yǎng)、缺氧、輻照等條件下能產(chǎn)生抗逆性很強(qiáng)的內(nèi)源芽胞，賦予其具有耐高溫、抗干燥、抗輻射以及某些有機(jī)溶劑等多種類型的抗逆性特征［2］。亞致死損傷發(fā)生在細(xì)菌或芽胞暴露在不利的物理化學(xué)環(huán)境（超出生長范圍，但不在致死的范圍）后，導(dǎo)致了細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)組織發(fā)生了可逆的變化。食品加工中重要手段如低熱殺菌、低水分活度、輻射、電脈沖殺菌技術(shù)、低pH、加入防腐劑等均可能導(dǎo)致亞致死損傷發(fā)生［3］。然而，受損的菌體或芽胞能夠在適宜的環(huán)境中修復(fù)損傷，從而導(dǎo)致食品的污染。一旦枯草芽孢桿菌污染食品會使食品的品質(zhì)發(fā)生變化，如面粉中存在枯草芽孢桿菌，不僅可使發(fā)酵的面團(tuán)液化并伴有黏絲狀物質(zhì)，還會使烤制的面包或餅干的表面出現(xiàn)斑狀形態(tài)，且產(chǎn)生不良?xì)馕?；污染肉類，可在其表面可產(chǎn)生黏液并有異味等［2，4］。因此，本研究選擇影響枯草芽孢桿菌受損芽胞（80℃下處理30 min）的萌芽因素，深入探討食品中誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌芽胞萌芽的主要因素以及芽胞萌芽的條件，為有效控制和預(yù)防枯草芽孢桿菌芽胞對食品品質(zhì)的影響提供理論依據(jù)。由于影響微生物生長的外界因素主要有兩大方面，其一為營養(yǎng)物質(zhì)，其二是許多物理、化學(xué)因素，因此本文從這兩方面探討對受損芽孢萌芽影響的作用規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

菌株枯草芽孢桿菌為武漢輕工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；牛肉膏，蛋白胨，葡萄糖，氯化鈉，酵母粉，蔗糖，乳糖，麥芽糖，可溶性淀粉，卵清蛋白，乳清蛋白，牛血清蛋白，硫酸鎂（MgSO4·7H2O分析純），硫酸錳（MnSO4分析純），氯化鉀（KCl分析純），氯化鈣（CaCl2分析純）；10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液稱取0.605 g Tris-base，加490 mL蒸餾水溶解后，用5 mol/L HCl和5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8，然后再定容至500 mL，于121℃高壓滅菌20 min，備用。

AL204梅特勒電子分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；YM-50全自動滅菌鍋上海三申公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司；GHP-9050隔水式恒溫箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)上海雷磁儀器廠；UPK-I-10T優(yōu)普系列超純水器西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；A011754紫外可見分光光度計(jì)上海現(xiàn)科分光儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種的處理

1.2.1.1菌種活化培養(yǎng)基牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖5 g，氯化鈉5 g，水1000 mL，pH7.2；菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，水1000 mL，pH7.0。

1.2.1.2菌種活化配制菌種活化培養(yǎng)基后分裝，取250 mL錐形瓶裝50 mL的培養(yǎng)液，進(jìn)行121℃高壓滅菌15 min后冷卻，將枯草芽孢桿菌接種，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，進(jìn)行復(fù)蘇活化處理。

1.2.1.3菌種擴(kuò)大培養(yǎng)將菌種活化液以2%的接種量接種至菌種擴(kuò)大培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.2.1.4制備芽胞液將擴(kuò)大培養(yǎng)物以6000 r/min，離心10 min。所得菌懸液用無菌蒸餾水洗滌并離心3～4次，再將新的懸浮液加入5 mL的無菌蒸餾水，并在100℃下處理30 min殺死其中的營養(yǎng)細(xì)胞，得到的芽胞懸液如上述離心并洗滌4次。最后于4℃下儲存芽胞懸液，濃度約為109cfu/mL。

1.2.2芽胞萌芽率的測定萌芽率的測定參考Chedia等［5］的方法進(jìn)行測定，具體如下：將制備的芽胞懸液稀釋成工作液1×106cfu/mL，再次放入80℃的水浴鍋中30 min，使芽胞處于亞損傷狀態(tài)，以2%的接種量將芽胞液接種至含有10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液的250 mL錐形瓶中，每瓶裝液量為50 mL，分別添加不同碳源、氮源、無機(jī)鹽離子。接種后先使用可見分光光計(jì)測定0 min的光密度值，然后再將其移至37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min，再次測定光密度值。萌芽率表示為萌芽60 min后樣液的OD580值與初始值的比值，計(jì)算公式如下：式中：ODi：芽胞萌芽0 min時的OD值，即樣品的初始OD580值；ODf：芽胞萌芽60 min時的OD值，即試樣孵育60 min后的OD580值。

1.2.3營養(yǎng)元素對枯草芽孢桿菌芽胞萌芽的影響

1.2.3.1不同碳源誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌芽胞的萌芽將

1.2.2所述受損芽胞添加至50 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中，其中氮源為0.1%蛋白胨、無機(jī)鹽為2 mmol/L NaCl，分別添加麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉，終濃度為5 mg/mL。于37℃培養(yǎng)60 min，測定光密度值的變化，按1.2.2計(jì)算萌芽率。

1.2.3.2不同氮源誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌芽胞的萌芽將

1.2.2所述受損芽胞添加至50 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中，其中碳源為0.1%葡萄糖、無機(jī)鹽為2 mmol/L NaCl，分別添加牛血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、蛋白胨和牛肉膏，終濃度為5 mg/mL。37℃培養(yǎng)60 min，測定光密度值的變化，按1.2.2計(jì)算萌芽率。

1.2.3.3不同無機(jī)鹽離子誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌芽胞的萌芽將1.2.2所述受損芽胞添加至50 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中，其中碳源為0.1%葡萄糖，氮源為0.1%蛋白胨，分別添加MnSO4、NaCl、CaCl2、MgSO4和KCl，終濃度為5 mg/mL。37℃培養(yǎng)60 min，測定光密度值的變化，按1.2.2計(jì)算萌芽率。

1.2.4培養(yǎng)環(huán)境條件因素的影響由于溫度、pH、接種量、溶氧量對微生物生長的具有直接的影響［2-3］，將

1.2.2所述受損芽胞添加至50 mL 10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液中，37℃放置15 min，按表1列出的接種量接種至麥芽糖（5 mg/mL），MgSO4（5 mg/mL），乳清蛋白（5 mg/mL）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度、pH、接種量、溶氧量各三個水平［6］，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，以進(jìn)一步確定芽胞萌芽的最適條件。按式（1）計(jì)算萌芽率。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experimental design

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與分析

2.1營養(yǎng)元素對芽孢萌芽的影響

2.1.1不同碳源因子對芽胞萌芽率的影響從圖1可知，枯草芽孢桿菌處于亞損傷狀態(tài)下的芽胞在不同碳源誘導(dǎo)下其萌芽率表現(xiàn)不同。利用SPSS軟件進(jìn)行多重方差分析可以看出葡萄糖、麥芽糖和乳糖對芽孢萌芽的影響呈顯著性差異，而蔗糖與可溶性淀粉之間則無顯著性差異。麥芽糖和葡萄糖對芽孢的萌芽率影響高于乳糖，蔗糖和可溶性淀粉對芽胞萌芽率的影響基本一致。

圖1　不同碳源對芽胞萌芽率的影響Fig.1　Effects of different carbon sources on spore germination rates

對于芽胞的萌芽，盡管研究表明，芽胞處于80～85℃、5 min可促進(jìn)芽胞的萌芽，而本實(shí)驗(yàn)中采用的條件為80℃、30 min，為一種亞致死應(yīng)力［3］。當(dāng)芽胞處于損傷狀態(tài)時以一種超休眠態(tài)，即要經(jīng)過很長時間才能進(jìn)入萌芽狀態(tài)。但將之置于適宜的環(huán)境下時，芽胞的激活、萌發(fā)、發(fā)芽和生長過程中的一系列生化反應(yīng)會終止芽胞的休眠狀態(tài)。目前在此方面的研究報(bào)道大部分較為深入地探討了正常狀態(tài)下芽胞萌芽的營養(yǎng)的因素［7-10］。Paidhungat等［10］研究了營養(yǎng)元素對枯草芽孢桿菌芽胞萌芽的影響，研究表明DPA-Ca （2，6-吡啶二羧酸鈣鹽）和營養(yǎng)成分導(dǎo)致枯草芽孢桿菌芽胞萌芽顯著增加。Pandey等［11］通過對枯草芽孢桿菌單個孢子萌芽的活細(xì)胞成像圖的分析，總結(jié)出枯草芽孢桿菌經(jīng)熱處理后，隨著萌芽時間的延長，平均萌芽率也隨之增加。Atluri等［12］也發(fā)現(xiàn)葡萄糖能誘導(dǎo)枯草芽孢桿菌的萌芽。本實(shí)驗(yàn)主要研究的是在食品中存在的常見營養(yǎng)素對受損芽胞的萌芽的影響，結(jié)果顯示，碳源對枯草芽孢桿菌芽胞的萌芽存在一定的誘導(dǎo)作用，其中以麥芽糖萌芽率最高，該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致。

2.1.2不同氮源因子對芽胞萌芽率的影響不同氮源對芽胞萌芽率存在明顯誘導(dǎo)作用，在Tris-HCl緩沖溶液里分別添加了牛血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、蛋白胨和牛肉膏5種氮源。利用SPSS多重方差分析結(jié)果表明卵清蛋白、乳清蛋白分別與同實(shí)驗(yàn)的其他四個因素均有顯著性差異，而牛血清蛋白、牛肉膏、蛋白胨之間無顯著性差異，與卵清蛋白、乳清蛋白兩者之間有顯著性差異。從圖2結(jié)果可知，這五種氮源對芽胞萌芽的影響以乳清蛋白萌芽率最高，其次為牛血清蛋白、牛肉膏和蛋白胨，卵清蛋白的效果最差。

圖2　不同氮源對芽胞萌芽率的影響Fig.2　Effects of different nitrogen sources on spore germination rates

2.1.3不同無機(jī)鹽離子對芽胞萌芽率的影響無機(jī)鹽不僅僅是細(xì)菌細(xì)胞繁殖過程中不可或缺的營養(yǎng)因子，也是影響芽胞萌芽率的主要因素。為了研究無機(jī)鹽對芽胞萌芽率的影響，共選擇了5種無機(jī)鹽對萌芽率進(jìn)行單一因素研究。圖3結(jié)果表明，MgSO4對芽胞萌芽率的影響最為顯著，MnSO4、NaCl、CaCl2誘導(dǎo)芽胞的萌芽率則較低。SPSS分析結(jié)果顯示MgSO4和KCl分別與同實(shí)驗(yàn)的其他三個因素均有顯著性差異，MnSO4、NaCl、CaCl2三者之間無顯著性差異，MgSO4與KCl有顯著性差異。

圖3　不同無機(jī)鹽對芽胞萌芽率的影響Fig.3　Effects of different inorganic salts on spore germination rates

本研究結(jié)果表明，乳清蛋白是芽胞萌芽的最佳氮源；無機(jī)鹽MgSO4對芽胞萌芽產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)作用（14.43%）。究其原因，這些營養(yǎng)成分誘導(dǎo)萌芽可視為一種萌芽的自然途徑，萌芽可能始于存在于芽胞衣膜上特定的受體，這些受體可能被某些營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合而被激活［10］。隨后，釋放出DPA，芽胞的通透性也隨之增加，核心部分再次激活CwlJ和SleB水解酶。該水解酶能水解皮質(zhì)層，此點(diǎn)對擴(kuò)大其核心的空間顯得尤為重要。待皮質(zhì)消失后，充分水化的核心部分會恢復(fù)各種合成酶的活性和合成ATP合成的前體物質(zhì)3-PGA（3-磷酸甘油酸）。隨著SASP（酸溶性芽胞蛋白，該蛋白可防止DNA的損傷）的降解，逐步釋放出的DNA，啟動RNA，合成菌體生長所需要DNA、RNA物質(zhì)和蛋白質(zhì)等物質(zhì)［13］。

2.2溫度、pH、接種量、溶氧量對芽胞萌芽的影響

由正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，不同條件下枯草芽孢桿菌芽胞萌芽率表現(xiàn)不同，以A3B2C1D3實(shí)驗(yàn)組的萌芽率最高，為14.29%。從極差R結(jié)果可知，對枯草芽孢桿菌芽胞萌芽率變化最大的是pH，其次是溶氧量、溫度，而對芽胞萌芽率的變化最小的為接種量。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌芽胞萌芽的最佳組合是A3B2C3D3，因此對最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明理論優(yōu)化的萌芽率為15.27%，枯草芽孢桿菌芽胞萌芽率的最佳方案為A3B2C3D3，即為37℃、pH7.0、最佳接種量為4%、最佳溶氧量是70 mL時得到的萌芽率最高。

從理論上推導(dǎo)孢子萌芽的最適溫度范圍應(yīng)該在30～40℃內(nèi)。Chedia等［5］研究結(jié)果表明，在溫度高于40℃或低于30℃時孢子萌芽率顯著下降，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果報(bào)道一致。Ciarciaglini（2000）報(bào)道枯草芽孢桿菌pSB357的萌芽率在L-丙氨酸誘導(dǎo)下pH為4.0時萌芽率將會完全受到抑制［14］。其機(jī)制可能在于，較低pH改變了氨基酸側(cè)鏈，從而改變其電荷分布、氫鍵的狀態(tài)和蛋白質(zhì)的構(gòu)象［15-16］。從溶氧量和接種量的結(jié)果可觀察到，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，溶氧量和接種量越大，萌芽率越高。溶氧量可能與菌體本身的生理生化性質(zhì)有關(guān)。芽胞萌芽的速度通常很快，僅需要數(shù)分鐘，當(dāng)芽胞發(fā)芽后便恢復(fù)成營養(yǎng)體細(xì)胞的形態(tài)?？莶菅挎邨U菌為一類好氧型細(xì)菌，其在有氧的情況下，呼吸作用增強(qiáng)，新陳代謝作用加快，更有利于它營養(yǎng)細(xì)胞的生長。

表2　枯草芽孢桿菌芽胞萌芽率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of Bacillus subtilis spore germination rate by orthogonal experiment

3　結(jié)論

營養(yǎng)成分、適宜的溫度、pH、接種量和溶氧量能刺激芽胞的萌芽，不適宜營養(yǎng)成分濃度、溫度、pH、接種量和溶氧量則會改變菌體的形態(tài)、代謝能力，甚至導(dǎo)致死亡。綜合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，食品中存在麥芽糖、乳清蛋白是有利于處于亞損傷狀態(tài)下芽胞萌芽的條件；無機(jī)鹽MgSO4對芽胞萌芽能產(chǎn)生顯著的誘導(dǎo)作用；最佳萌芽溫度為37℃、pH7.0、接種量4%、溶氧量則越大越有利于萌芽。該結(jié)果對于指導(dǎo)食品工業(yè)生產(chǎn)中合理控制芽胞菌的萌芽、生長與繁殖提供了數(shù)據(jù)支撐。

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Effects of germination factors on Bacillus subtilis spores in the sub（lethal）stage

CHANG Chao，PAN Li，WU Jin-e，ZHANG Zhe （College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

The effect of food nutritional ingredient on Bacillus subtilis spores in the sub（lethal）stage germination was evaluated，which the impact of carbon，nitrogen，inorganic salts in food on spore germinate was conducted by batch culture method，and temperature，pH，inoculum size，oxygen content was studied by orthogonal experimental design.To quantitatively analyse the effect of these factors，the optical density of OD580was determined to calculate germination rate.The results showed that maltose，whey protein were the best C source and N source of spore germination，respectively.MgSO4had a significant induction effect on spore germination. Based on the best nutrients of maltose（5 mg/mL），MgSO4（5 mg/mL），whey protein（5 mg/mL），optimal growth conditions for spore was that an inoculum of 4%of Bacillus subtilis spores in media with pH7.0 were cultured under 37℃，and the dissolved oxygen was 70 mL，constant shaking for 60 min，resulted in the maximum spore germination rate was 15.27%.

Bacillus subtilis spore；sublethal state；germinate rate；influence factor

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0242-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.040

2015－06－12

常超（1976-），男，碩士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：changchao2000@163.com。

湖北省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（D20131701）。