弱酸脅迫提升富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能及其作用機(jī)理

王冬華，王大慧，衛(wèi)功元（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123）

弱酸脅迫提升富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能及其作用機(jī)理

王冬華，王大慧，衛(wèi)功元
（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇蘇州215123）

以一株耐亞硒酸鈉的產(chǎn)朊假絲酵母為研究對(duì)象，考察了該菌株在不同pH環(huán)境下的富硒和谷胱甘肽（GSH）合成能力及抗氧化性能。結(jié)果表明，在弱酸脅迫（pH3.5）條件下，富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)有機(jī)硒和GSH含量均達(dá)到最高水平，分別為1.08 mg/g和18.48 mg/g。通過(guò)對(duì)酵母胞內(nèi)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性以及丙二醛含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫不僅有利于增強(qiáng)GSH的合成能力，也有助于提高酵母細(xì)胞的抗氧化能力。該研究結(jié)果為發(fā)酵法制備高性能富硒產(chǎn)朊假絲酵母提供了可行的技術(shù)參考。

富硒酵母，酸脅迫，有機(jī)硒含量，谷胱甘肽，產(chǎn)朊假絲酵母

硒是人體必需的微量元素之一，缺硒將導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生，而通過(guò)飲食合理補(bǔ)硒則可以起到預(yù)防作用［1］。硒的補(bǔ)充途徑有多種，其中富硒酵母因富含B族維生素、食用安全以及生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)而成為補(bǔ)硒食品的首選［2-4］。以往，釀酒酵母一直作為富硒的主要微生物而得到廣泛關(guān)注［5］，然而，近年來(lái)利用產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）進(jìn)行有機(jī)硒的富集為富硒酵母的制備和應(yīng)用提供了新的方法和手段［6］。作為一種GRAS微生物，產(chǎn)朊假絲酵母比釀酒酵母具有更寬廣的營(yíng)養(yǎng)譜及更高的谷胱甘肽（GSH）合成能力，因而在富硒制品中將具有更大的應(yīng)用潛力［7-8］。

在利用發(fā)酵法制備富硒產(chǎn)朊假絲酵母的過(guò)程中，生物量、胞內(nèi)有機(jī)硒含量是體現(xiàn)其發(fā)酵水平的重要技術(shù)指標(biāo)，一般可以通過(guò)菌株選育和發(fā)酵條件優(yōu)化等方法來(lái)提高其性能［6，9-10］。然而，若能提高增加胞內(nèi)GSH含量，則對(duì)于提升富硒產(chǎn)朊假絲酵母的性能將是大有裨益的［11］。為此，作者所在的團(tuán)隊(duì)采用了包括添加氨基酸［12-13］和酸脅迫［14］在內(nèi)的各種手段實(shí)現(xiàn)了高性能富硒產(chǎn)朊假絲酵母的制備。在酸脅迫過(guò)程中，產(chǎn)朊假絲酵母將以過(guò)量合成GSH的形式來(lái)抵抗和適應(yīng)外界的惡劣環(huán)境［15］，而這一特點(diǎn)正好可以用來(lái)提高富硒酵母的性能。

酸脅迫常見(jiàn)于食品發(fā)酵工業(yè)中，不少微生物對(duì)外界的酸脅迫環(huán)境具有一定的抵抗和適應(yīng)能力［16］。在前期工作中，作者在研究酸脅迫在富硒酵母制備中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，高濃度無(wú)機(jī)硒對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母的

生長(zhǎng)具有抑制作用，所以采用分批補(bǔ)加無(wú)機(jī)硒［11］或在細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)添加無(wú)機(jī)硒的方式［14］。但是，有研究結(jié)果表明，酵母高效富硒是伴隨著細(xì)胞的快速生長(zhǎng)而進(jìn)行的［17］，因此有必要對(duì)酸脅迫條件下酵母細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)的富硒過(guò)程進(jìn)行研究。為此，本文在實(shí)驗(yàn)室選育獲得的一株耐高濃度無(wú)機(jī)硒的產(chǎn)朊假絲酵母的基礎(chǔ)上，以富硒酵母的高性能（高有機(jī)硒含量和高GSH含量）為目標(biāo)，考察酸脅迫的作用及其機(jī)理，研究結(jié)果將為高性能富硒產(chǎn)朊假絲酵母的高效制備提供可行的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)朊假絲酵母（C.utilis Se-1301） 為一株耐高濃度亞硒酸鈉菌株，是在實(shí)驗(yàn)室原有C.utilis SZU 07-01的基礎(chǔ)上，通過(guò)在含有20 mg/L亞硒酸鈉的平板上馴化選育獲得的突變株；GSH、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和谷胱甘肽還原酶等生工生物工程（上海）股份有限公司；各類(lèi)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；0.22 μm水系微孔濾膜 生工生物工程（上海）股份有限公司。

BIOTECH-5BG全自動(dòng)發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LD5-2A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；SW-CJ-2A超凈工作臺(tái) 吳江市龍宏凈化設(shè)備有限公司；HZ-2010K搖床 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；LDZX-50KB滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 斜面種子活化4 h后接入種子培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，pH6.0），搖床中培養(yǎng)20 h，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min。

1.2.2 不同pH條件下產(chǎn)朊假絲酵母分批培養(yǎng) 發(fā)酵罐中裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖30 g/L，硫酸銨8 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，L-蛋氨酸10 mmol/L，pH5.5），按照10%（v/v）的接種量向其中接入種子，在400 r/min和27℃條件下培養(yǎng)30 h。培養(yǎng)液pH將分別恒定控制在2.5、3.5、4.5、5.5和6.5，pH采用梅特勒電極在位監(jiān)測(cè)，通過(guò)自動(dòng)流加3 mol/L H2SO4或3 mol/L NaOH進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持pH變化在±0.02范圍內(nèi)。在不同培養(yǎng)時(shí)間定時(shí)取樣，樣品經(jīng)處理后檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成情況。

1.2.3 不同pH條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母分批培養(yǎng)

種子接種和發(fā)酵條件同分批培養(yǎng)操作。在接種前將1 g/L亞硒酸鈉溶液（經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌）加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，至總濃度15 mg/L。培養(yǎng)液pH將分別恒定控制在2.5、3.5、4.5、5.5和6.5，在不同培養(yǎng)時(shí)間定時(shí)取樣，樣品經(jīng)處理后檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成情況，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（30 h）測(cè)定胞內(nèi)總有機(jī)硒含量。

1.2.4 不同pH條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能比較在富硒產(chǎn)朊假絲酵母分批培養(yǎng)過(guò)程中，定時(shí)取樣，檢測(cè)9、15、21 h時(shí)的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，測(cè)定15、21 h時(shí)的過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性以及胞內(nèi)丙二醛含量，比較不同pH條件下各酶活大小，總結(jié)弱酸脅迫提升富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能的內(nèi)在機(jī)理。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 酵母生物量的測(cè)定 以細(xì)胞干重（DCW）表示酵母生物量，取20 mL發(fā)酵液，在3500 r/min下離心10 min，蒸餾水洗滌3次，濕菌體在70℃下烘干至恒重。

1.3.2 胞內(nèi)GSH的提取、測(cè)定及胞內(nèi)GSH含量（IGC）的計(jì)算 參見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。

1.3.3 無(wú)機(jī)硒和胞內(nèi)總硒的測(cè)定、胞內(nèi)有機(jī)硒含量（ISeC）的計(jì)算 參見(jiàn)文獻(xiàn)［11］。

1.3.4 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量的測(cè)定 采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定，操作方法和步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求，分別在產(chǎn)朊假絲酵母快速生長(zhǎng)期（9 h）、GSH快速合成期（15 h）以及酵母細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定期（21 h）對(duì)γ-GCS、CAT 和SOD酶活以及胞內(nèi)MDA含量的變化進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有搖瓶實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)樣品的平均值，所有分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為兩次檢測(cè)結(jié)果的平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可信度采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行分析，當(dāng)p≤0.05時(shí)認(rèn)為有顯著影響。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為Statistical Analysis System（SAS 9.0）。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同pH條件下產(chǎn)朊假絲酵母分批培養(yǎng)結(jié)果

圖1 不同pH條件下產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生長(zhǎng)與GSH合成量變化Fig.1 Cell growth of C.utilis Se-1301 and GSH biosynthesis under different pHs

考察了突變株C.utilis Se-1301在不同pH（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5）條件下的分批培養(yǎng)情況，并以此作為以下實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。圖1顯示了突變株在不富集硒時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成情況，結(jié)果表明，該酵母細(xì)胞

能在較寬的pH范圍內(nèi)正常生長(zhǎng)并合成GSH。除了pH2.5以外，其他pH條件下酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)情況基本一致，最大細(xì)胞干重沒(méi)有明顯差異。然而，不同pH條件下的GSH合成結(jié)果顯示，GSH產(chǎn)量在pH3.5～5.5范圍內(nèi)均維持在較高的水平。值得一提的是，只有當(dāng)pH5.5時(shí)細(xì)胞才能快速地合成最大量的GSH，18 h時(shí)胞內(nèi)GSH含量達(dá)到最大值18.27 mg/g。與文獻(xiàn)［10］中的C.utilis SZU 07-01分批培養(yǎng)結(jié)果相比，圖1所示的突變株具有更高的GSH合成能力。

2.2 不同pH條件下酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和富硒情況

2.2.1 分批發(fā)酵過(guò)程參數(shù) 在分批培養(yǎng)的0 h向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加15 mg/L亞硒酸鈉，考察C.utilis Se-1301在不同pH（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5）條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。可以看出，酵母細(xì)胞在亞硒酸鈉存在的情況下也可以在較寬的pH范圍（3.5～6.5）內(nèi)正常生長(zhǎng)，只有在pH2.5時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度受到了抑制，最終細(xì)胞干重也明顯低于其他pH環(huán)境下的結(jié)果。相應(yīng)地，GSH合成受pH的影響與細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律較為類(lèi)似。

產(chǎn)朊假絲酵母在富硒環(huán)境條件下，不同pH條件下的細(xì)胞干重（圖2）與對(duì)照條件（圖1）相比雖略有下降，但差異不大，顯示出突變株具有良好的適應(yīng)高濃度無(wú)機(jī)硒并正常生長(zhǎng)的能力。針對(duì)GSH合成，雖然最終GSH最大合成量與對(duì)照（圖1）相比較為接近，但GSH合成速度在富硒過(guò)程中則稍微滯后于對(duì)照，說(shuō)明酵母胞內(nèi)與GSH合成有關(guān)的代謝速率受到了無(wú)機(jī)硒富集的影響。

圖2 不同pH條件下的富硒產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生長(zhǎng)和GSH合成量變化Fig.2 Cell growth and GSH biosynthesis during selenium enrichment under different pHs

值得關(guān)注的是，pH3.5時(shí)的酵母細(xì)胞干重和GSH合成量均高于其他pH條件下的結(jié)果。由此可以發(fā)現(xiàn)，弱酸脅迫環(huán)境（如pH3.5）有利于產(chǎn)朊假絲酵母在富硒過(guò)程中過(guò)量合成GSH，從而有效提高富硒酵母的性能。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究中的C.utilis SZU 07-01在細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)富硒所得出的結(jié)論［14］是一致的。

2.2.2 富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能 比較了發(fā)酵結(jié)束時(shí)不同pH（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5）條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)有機(jī)硒（ISeC）和GSH含量（IGC），結(jié)果見(jiàn)圖3。除了pH2.5以外，在其他pH條件下的IGC都處于較高的水平，其中pH3.5和pH5.5時(shí)IGC最大值在21 h分別為18.48 mg/g和18.25 mg/g，與對(duì)照的胞內(nèi)GSH含量基本相當(dāng)，說(shuō)明產(chǎn)朊假絲酵母的富硒過(guò)程沒(méi)有對(duì)GSH合成能力產(chǎn)生不良影響。然而，不同pH條件對(duì)酵母的富硒能力有不同的影響，其中弱酸脅迫（pH3.5）下的酵母細(xì)胞具有最強(qiáng)的富硒能力，胞內(nèi)有機(jī)硒含量達(dá)到為1.08 mg/g。

綜合圖3中的富硒酵母的兩項(xiàng)關(guān)鍵性能指標(biāo)IGC 和ISeC可以發(fā)現(xiàn)，與其他pH條件相比，pH3.5最有利于富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能的提高。以下將從酵母胞內(nèi)相關(guān)酶活和物質(zhì)水平變化規(guī)律等角度對(duì)弱酸脅迫提升富硒酵母性能的作用機(jī)理進(jìn)行探討。

圖3 pH對(duì)富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)GSH和有機(jī)硒含量的影響Fig.3 Effect of pH on intracellular contents of both GSH and organic selenium

2.3 弱酸脅迫提升富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能的機(jī)理

圖4 酸脅迫條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)γ-GCS酶活Fig.4 γ-GCS activities of selenium-enriched C.utilis under acid stress

2.3.1 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是酵母胞內(nèi)GSH合成的關(guān)鍵限速酶，其活性的大小與GSH合成速率密切關(guān)聯(lián)［18］。為此，測(cè)定了不同酸脅迫條件和不同培養(yǎng)時(shí)間下的富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)γ-GCS酶活，結(jié)果見(jiàn)圖4。由

圖4可見(jiàn)，pH2.5時(shí)的γ-GCS酶活顯著（p＜0.05）低于其他pH條件下的酶活水平，最終導(dǎo)致細(xì)胞合成的GSH量也較低（圖2）。在pH3.5～6.5范圍內(nèi)，細(xì)胞快速生長(zhǎng)期（9 h）和穩(wěn)定期（21 h）時(shí)的γ-GCS酶活沒(méi)有明顯差異，但在GSH快速合成期（15 h），γ-GCS酶活只有在pH3.5時(shí)最高，表明在該pH條件下酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的GSH合成能力，因而更有利于促進(jìn)富硒產(chǎn)朊假絲酵母性能的提升。

2.3.2 過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性 GSH是還原性物質(zhì)，對(duì)于維持酵母胞內(nèi)適宜的氧化還原環(huán)境起著重要的作用［18］。然而，酸脅迫環(huán)境以及富硒過(guò)程都容易引起胞內(nèi)氧化性物質(zhì)水平的提高，進(jìn)而降低GSH的含量［12］。如果胞內(nèi)參與自由基消除反應(yīng)的過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性較高，則更加有利于GSH水平的維持和提高。為此，分別測(cè)定了不同pH條件和不同培養(yǎng)時(shí)間下的CAT和SOD酶活，結(jié)果見(jiàn)圖5?？梢钥闯觯贕SH快速合成期（15 h），CAT酶活在pH3.5和4.5下均處于較高水平；在穩(wěn)定期（21 h）時(shí)，不同pH條件下CAT酶活沒(méi)有明顯差異（pH2.5除外）。結(jié)合圖2的結(jié)果可以看出，CAT酶活的高低與GSH合成速率和產(chǎn)量都有一定的關(guān)聯(lián)，當(dāng)CAT活力下降時(shí)，GSH可能參與氧化還原反應(yīng)而被消耗。對(duì)于SOD來(lái)說(shuō)，其活性大小在不同pH和不同培養(yǎng)時(shí)間條件下沒(méi)有顯著差異，體現(xiàn)出富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)的SOD可能對(duì)弱酸脅迫不敏感，或者SOD對(duì)胞內(nèi)GSH含量的變化沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響。

圖5 酸脅迫條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)CAT和SOD酶活Fig.5 The activities of CAT and SOD in selenium-enriched C.utilis under acid stress

2.3.3 丙二醛含量 丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)脂質(zhì)與自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量多少通常體現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化性環(huán)境的強(qiáng)弱，也可以反映出細(xì)胞膜損傷程度和通透性的大?。?9］。由于細(xì)胞膜通透性的增加將導(dǎo)致GSH的泄漏，不利于胞內(nèi)GSH含量的維持和提高［20］。為此，測(cè)定了不同pH和不同培養(yǎng)時(shí)間下的富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)MDA含量，結(jié)果見(jiàn)圖6?？梢园l(fā)現(xiàn)，pH3.5時(shí)的MDA含量較低，說(shuō)明該條件下酵母胞內(nèi)氧化性物質(zhì)的水平要低于其他pH環(huán)境，同時(shí)細(xì)胞膜在富硒過(guò)程中受到的損傷也較小。此外，不同pH下的MDA含量在15 h和21 h時(shí)沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明不同培養(yǎng)時(shí)間下細(xì)胞膜的被氧化程度變化不大。

在酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉為有機(jī)硒的過(guò)程中，亞硒酸鈉的存在容易導(dǎo)致MDA的形成，增加了細(xì)胞膜的通透性，而從胞內(nèi)滲漏出來(lái)的GSH又極易與培養(yǎng)基中的亞硒酸鈉反應(yīng)形成紅色的單質(zhì)硒［21］，降低了有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率和胞內(nèi)GSH含量，這對(duì)提高富硒酵母的性能是十分不利的。因此，通過(guò)弱酸脅迫提高胞內(nèi)GSH含量并改善胞內(nèi)氧化性環(huán)境是解決以上問(wèn)題的有效方法之一。

圖6 酸脅迫條件下富硒產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)丙二醛含量Fig.6 The intracellular MDA content of selenium-enriched C.utilis under acid stress

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)不同酸脅迫條件下的富硒產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生長(zhǎng)以及GSH合成過(guò)程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)弱酸脅迫（pH3.5）條件有利于富硒酵母胞內(nèi)有機(jī)硒和GSH含量等性能的提高。富硒酵母分批培養(yǎng)過(guò)程中胞內(nèi)相關(guān)酶活和物質(zhì)水平表明，在弱酸脅迫條件下酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的GSH合成能力，更高的過(guò)氧化氫酶活性，以及更低的胞內(nèi)丙二醛含量。弱酸脅迫條件下制備得到的富硒產(chǎn)朊假絲酵母不僅具有較高的性能，而且還具有較強(qiáng)的抗氧化能力，因此將具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

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Moderate acid stress improves the performance of selenium-enriched Candida utilis and its related mechanism

WANG Dong-hua，WANG Da-hui，WEI Gong-yuan*
（School of Biology and Basic Medical Sciences，Soochow University，Suzhou 215123，China）

The capacities of selenium enrichment and glutathione biosynthesis as well as antioxidant properties of a sodium selenite-resisting Candida utilis Se-1301 were investigated in this study.The results illustrated that the highest intracellular organic selenium and glutathione contents of 1.08 mg/g and 18.48 mg/g，respectively，were obtained under a moderate acid stress environment（pH3.5）.After assaying the activities of intracellular γ-glutamylcysteine synthetase，catalase and superoxide dismutase，together with determining the intracellular malondialdehyde content，the moderate acid stress was found to be not only favored to improve the ability of glutathione biosynthesis，but also helped to increase the antioxidant capacity of the yeast.The results provided a feasible route for efficient preparation of selenium-enriched Candida utilis with high performance.

selenium-enriched yeast；acid stress；organic selenium content；glutathione；Candida utilis

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.031

2015－09－10

王冬華（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品添加劑的微生物制造，E-mail：1013813289@qq.com。

*通訊作者：衛(wèi)功元（1975-），男，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程，E-mail：weigy@suda.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金（21506136）；蘇州市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（SYN201314）。