大豆皂苷Ⅱ與人血清白蛋白相互作用機(jī)制研究

桑尚源，光翠娥，江 波（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

大豆皂苷Ⅱ與人血清白蛋白相互作用機(jī)制研究

桑尚源，光翠娥*，江 波
（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無錫214122）

為研究吸收進(jìn)入人體血循環(huán)的大豆皂苷Ⅱ與人血清白蛋白（HSA）相互作用機(jī)理。采用圓二色光譜、內(nèi)源熒光光譜和分子模擬方法檢測表征皂苷Ⅱ與HSA之間的相互作用。圓二色光譜結(jié)果顯示，大豆皂苷Ⅱ與HSA的濃度比例為1∶2或1∶4時(shí)，HSA的二級結(jié)構(gòu)α螺旋含量上升，β折疊含量下降。熒光光譜顯示，大豆皂苷Ⅱ?qū)SA的立體構(gòu)象有影響。分子模擬顯示它們之間的結(jié)合作用力以氫鍵和疏水相互作用為主，HSA與皂苷糖基鏈中葡萄糖醛酸基（GlcA）和鼠李糖基（Rha）部分形成氫鍵作用的氨基酸殘基包括Glu153、Ser192、Gln196、Glu450、Asp451和Ser454等，與皂苷配基三萜烯部分形成疏水相互作用的氨基酸殘基主要有Ala、Leu、Val和Trp等。

大豆皂苷Ⅱ，人血清白蛋白，相互作用，圓二色光譜，分子模擬

大豆皂苷一般被認(rèn)為是豆制品中的一種功能成分，其生物活性有很多。有益的作用包括：降低心血管疾病發(fā)生率、預(yù)防癌癥、保護(hù)肝臟和消炎等［1］。大豆皂苷Ⅱ是豆制品中皂苷的主要存在形式之一［2］，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。其具有多種生物活性，如抑制人體腎素活性［3］、抗皰疹病毒（HSV-1）［4］和作為免疫佐劑［5-6］。對其進(jìn)行吸收、代謝與分布等生物利用度方面的研究，為今后研發(fā)出相關(guān)保健食品提供重要參考價(jià)值。

血清白蛋白（serum albumin，SA）是動(dòng)物血漿中極易純化且含量又最豐富的蛋白質(zhì)（0.6 mmol/L），因而為研究蛋白質(zhì)在體內(nèi)的生物學(xué)功能、理化性質(zhì)、臨床應(yīng)用和體內(nèi)代謝等方面提供了較好的模式蛋白質(zhì)。人血清白蛋白（HSA）由585個(gè)氨基酸殘基組成，分子量在67000 u左右。HSA的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，在HSA的氨基酸全序列中含有35個(gè)半胱氨酸（Cys），其中只有一個(gè)自由的Cys未形成二硫鍵，其他17對Cys形成二硫鍵。HSA晶體的三維結(jié)構(gòu)模型為“心型”，可分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，每個(gè)結(jié)構(gòu)域又分為亞結(jié)構(gòu)域A和B，且每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域是由數(shù)個(gè)α螺旋鏈以圓筒狀組成，圓筒狀的亞結(jié)構(gòu)域A和B又以槽口相對方向組合在一起。其中第1～195位氨基酸殘基組成結(jié)構(gòu)域Ⅰ，第196～383位氨基酸組成結(jié)構(gòu)域Ⅱ，余下的氨基酸組成結(jié)構(gòu)域Ⅲ［7-8］。HSA具有結(jié)合和運(yùn)輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的功能，深度影響一些吸收進(jìn)入人體的外源活性物質(zhì)在體內(nèi)的運(yùn)送、分布、代謝及消除等過程。為此本文模擬生理?xiàng)l件，采用圓二色光譜、內(nèi)源熒光光譜和分子模擬方法表征皂苷Ⅱ與HSA之間的相互作用機(jī)制，為將來開發(fā)含有高生物利用度大豆皂苷的保健食品提供理論依據(jù)。

圖1 大豆皂苷Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of soyasaponinⅡ

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆皂苷Ⅱ（純度91.7%） 美國ChromaDex公司；人血清白蛋白（HSA） Sigma公司；三羥甲基氨甲烷（Tris）、氯化鈉 國藥集團(tuán)試劑公司，分析純；Tris-HCl緩沖液 500 mL體積的0.1 mol/L Tris溶液中加入約420 mL體積的0.1 mol/L的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入5.844 g氯化鈉，定容至1000 mL，4℃低溫保存待用。

MOS-450 AF-CD圓二色光譜儀 法國Bio-Logic公司；FLUORMAX-4熒光光譜儀 美國HORIBA公司；軟件Discover Studio 2.5（DS）、LigPlot+分析軟件美國Accelrys軟件公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人血清白蛋白的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜檢測 用Tris緩沖液配制HSA與大豆皂苷Ⅱ不同比例的混合液。HSA的最終濃度為1 μmol/L，大豆皂苷Ⅱ的終濃度依次為0、0.5、1、2、4 μmol/L，混合靜置30 min。分別吸取200 μL Tris-HCl緩沖溶液（pH7.4）和樣品注入2 mm比色皿中測定圓二色光譜，每次測量扣除對應(yīng)皂苷濃度的Tris-HCl緩沖溶液的背景干擾。室溫下（293 K）光譜測定條件是200～250 nm波長范圍掃描，掃描速度為20 nm/min，響應(yīng)時(shí)間為2 s。所得數(shù)據(jù)使用Selcon3方法計(jì)算得出血清白蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量。

1.2.2 人血清白蛋白的內(nèi)源熒光光譜檢測 以295 nm為激發(fā)波長，狹縫為5 nm，室溫下（293 K），在300～450 nm波長范圍內(nèi)掃描HSA樣品（與方法1.2.1相同的樣品）的發(fā)射光得到內(nèi)源熒光光譜圖，重復(fù)掃描3次取平均值?？瞻诪閷?yīng)皂苷濃度的Tris-HCl緩沖溶液，熒光強(qiáng)度值為扣除空白后的相對值。

1.2.3 分子模擬 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取HSA晶體的三維結(jié)構(gòu)模型數(shù)據(jù)文件，登錄號(hào)為1h9z。使用DS2.5軟件刪除其中的配體小分子和水分子，并補(bǔ)入缺失的氫原子，得到HSA晶體的完整三維結(jié)構(gòu)。大豆皂苷Ⅱ（soyasaponinⅡ）的立體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)文件從網(wǎng)站www.chemical-book.com中搜索下載，采用PRODRG網(wǎng)站（http：//davapc1.bioch.dundee.ac.uk/cgibin/prodrg）對大豆皂苷Ⅱ的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行加電荷和構(gòu)象優(yōu)化等預(yù)處理［9］。使用DS軟件中的Libdock模塊進(jìn)行剛性分子對接。以HSA的Trp214殘基為中心，半徑為13 ?的球體范圍定義為對接區(qū)域，對接程序參數(shù)設(shè)置如下：Docking Tolerance=0.25、Numbers of Hotspots= 100、Docking Preference=High Quality、Conformation Method=FAST、Parallel Processing=False。從對接結(jié)果大豆皂苷Ⅱ構(gòu)象集中選取打分函數(shù)LibDockscore得分最高者，并將其對接復(fù)合物的文件導(dǎo)入Ligplot+軟件［10］中，得到蛋白與皂苷分子間相互作用網(wǎng)，并進(jìn)一步分析得到氫鍵和疏水相互作用位點(diǎn)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)都是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并且用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大豆皂苷Ⅱ濃度對HSA二級結(jié)構(gòu)的影響

包含生色團(tuán)的蛋白質(zhì)大分子由于其構(gòu)象的不對稱性，可引起左右圓偏振光具有不同光吸收的現(xiàn)象，即為圓二色性（circular dichroism，CD），這種光被吸收的程度與波長之間關(guān)系稱為圓二色光譜。遠(yuǎn)紫外區(qū)190～250 nm波長范圍的圓二色光譜可反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象，α螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192 nm有一正的譜帶，在遠(yuǎn)紫外208 nm和222 nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶；β折疊的CD光譜在216 nm有一負(fù)譜帶［11］。

室溫下（293 K），HSA在不同大豆皂苷Ⅱ濃度下，進(jìn)行遠(yuǎn)紫外200～250 nm波長范圍掃描得到圓二色光譜，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，HSA的CD光譜圖在200～220 nm波長范圍有一段負(fù)譜帶，說明其二級結(jié)構(gòu)形式以α螺旋和β折疊為主。不同濃度的大豆皂苷Ⅱ未改變HSA的CD光譜峰型和峰位，但改變峰強(qiáng)度，表明大豆皂苷Ⅱ的存在引起HSA的二

級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖2 HSA-大豆皂苷Ⅱ混合溶液的遠(yuǎn)紫外CD光譜圖（pH=7.4，T=293 K）Fig.2 Far-UV CD spectra of the HSA-soyasaponinⅡsystem （pH=7.4，T=293 K）

圓二色光譜數(shù)據(jù)通過Selcon3模型計(jì)算方法，計(jì)算得到HSA二級結(jié)構(gòu)含量，如圖3所示。從圖3中可知，HSA與大豆皂苷Ⅱ的濃度比例為1∶1時(shí)，α螺旋和β折疊的含量未變化（p＞0.05）。而在1∶0.5、1∶2和1∶4時(shí)，HSA的α螺旋含量由35.3%增加至46.4%、67.7%和56.5%，而β折疊含量由11.5%下降至8.8%、6.2%和6.7%（p＜0.05）。大豆皂苷Ⅱ與HSA的結(jié)合可能改變了HSA的氫鍵骨架結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致HSA的二級結(jié)構(gòu)從β折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣谅菪?/p>

圖3 不同蛋白-大豆皂苷Ⅱ比例下人血清白蛋白二級結(jié)構(gòu)含量變化圖（pH=7.4，T=293 K）Fig.3 Effect of the HSA-soyasaponinⅡconcentration ratio on secondary structure constituents of HSA（pH=7.4，T=293 K）

2.2 不同大豆皂苷Ⅱ濃度對HSA立體構(gòu)象的影響

當(dāng)以295 nm為激發(fā)波長時(shí)，蛋白的內(nèi)源熒光基團(tuán)主要是由色氨酸（Trp）產(chǎn)生熒光發(fā)射光譜。加入一定量的小分子后，HSA與配體小分子相互作用后，受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)改變，或者蛋白中的色氨酸殘基附近微環(huán)境極性發(fā)生改變，進(jìn)而表現(xiàn)出熒光光譜發(fā)生變化。HSA有唯一的Trp214，在蛋白中心疏水腔內(nèi)部［7］，即在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA與ⅢA之間，見圖5。

實(shí)驗(yàn)得到不同蛋白-大豆皂苷Ⅱ濃度比例下的HSA內(nèi)源熒光光譜，結(jié)果見表1。HSA蛋白在334 nm出現(xiàn)最大吸收峰，并隨大豆皂苷Ⅱ濃度增加，熒光光譜峰位發(fā)生藍(lán)移（從334～332 nm）?？赡茉蚴荋SA的三維結(jié)構(gòu)改變，從而色氨酸殘基附近微環(huán)境極性減弱。從大豆皂苷Ⅱ?qū)SA內(nèi)源熒光強(qiáng)度猝滅作用分析，大豆皂苷Ⅱ降低了HSA熒光特征峰的強(qiáng)度（比例為1∶4時(shí)，相對峰強(qiáng)度為98%），這是因?yàn)榇蠖乖碥闸蚪Y(jié)合在Trp214（位于HSA疏水腔）附近，影響了其微環(huán)境極性。

表1 不同蛋白-大豆皂苷Ⅱ比例下對熒光譜峰位及峰強(qiáng)度的影響Table1 Effect of different concentrations of soyasaponinⅡon fluorescence spectra profiles of HSA

2.3 大豆皂苷Ⅱ與HSA相互作用類型研究

為確定皂苷與HSA其他氨基酸殘基主要作用類型和相互作用位點(diǎn)，隨后進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分子對接實(shí)驗(yàn)。DS工作站中Libdock模塊進(jìn)行分子對接后的結(jié)果主要是從Conf Number、Absolute Energy、Relative Energy、LibDockscore、Poses、相對RMSD值等幾個(gè)方面對其進(jìn)行評價(jià)。其中，對接吻合度打分函數(shù)LibDockscore是對幾何形狀、化學(xué)環(huán)境、能量的綜合評價(jià)參數(shù)，同時(shí)LibDockscore也是根據(jù)配體與受體對接時(shí)的對接模式（Conf Number）、親和力（Absolute Energy）和相對能量值（Relative Energy）等方面進(jìn)行綜合打分。因此采用打分函數(shù)LibDockscore來評價(jià)對接結(jié)果較為合理，一般認(rèn)為LibDockscore＞100表示配體與受體能較好的結(jié)合，其值越大代表對接產(chǎn)生的復(fù)合物構(gòu)象越穩(wěn)定。Poses是與受體蛋白對接時(shí)所得配體的構(gòu)象數(shù)。

大豆皂苷Ⅱ與HSA分子對接后，所得大豆皂苷Ⅱ立體構(gòu)象總數(shù)（Poses）為8，其中LibDockscore所得最高分為187.092，表明兩者可穩(wěn)定結(jié)合。選取打分函數(shù)（LibDockscore）評分最高的大豆皂苷Ⅱ構(gòu)象，制作對接三維示意圖，見圖4。從圖4中可看出，函數(shù)LibDockscore評分值最高的大豆皂苷Ⅱ在HSA疏水腔內(nèi)Trp214殘基附近，大豆皂苷Ⅱ與Trp214之間也許存在有利于結(jié)合的相互作用力。

圖4 大豆皂苷Ⅱ與HSA的對接結(jié)果三維示意圖Fig.4 The molecular docking schematic 3D-diagram of soyasaponinⅡand HSA

對圖4中復(fù)合物最佳構(gòu)象結(jié)構(gòu)運(yùn)用Ligplot+軟件，得到分子間相互作用網(wǎng)二維圖，結(jié)果見圖5。Ligplot+軟件是一個(gè)用來分析配體和受體間相互作用的計(jì)算程序［10］，它通過HBPLUS程序計(jì)算疏水和氫鍵作用，以二維圖形式表示出來，有效避免化學(xué)鍵交叉和重疊，比三維圖利于觀察和分析統(tǒng)計(jì)［12］。在圖5中，統(tǒng)計(jì)受體HSA中與配體皂苷小分子相互作用力類型主要為氫鍵和疏水相互作用，還可利用圖5對分子間作用位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)分析。

圖5 大豆皂苷Ⅱ與HSA分子間相互作用網(wǎng)二維圖分析Fig.5 Molecular interaction 2D-analysis between HSA and soyasaponinⅡ

使用Ligplot+軟件得到分子間相互作用網(wǎng)二維圖（圖5），現(xiàn)將體系中較為穩(wěn)定的氫鍵作用統(tǒng)計(jì)在表2中。從表2中可看出，在HSA蛋白氨基酸殘基中，Glu153、Ser192、Gln196、Glu450、Asp451、Ser454等六個(gè)殘基與大豆皂苷Ⅱ有氫鍵相互作用。根據(jù)以上氫鍵作用分析的結(jié)果，使用DS工作站分析顯示出氫鍵作用的三維效果圖，得到圖6。在圖6中，大豆皂苷Ⅱ的第一個(gè)糖基（葡萄糖醛酸基，GlcA）、第三個(gè)糖基（鼠李糖基，Rha）與HSA存在氫鍵作用。

表2 大豆皂苷Ⅱ與人血清白蛋白分子間氫鍵分析Table2 Hydrogen bond analysis between HSA and soyasaponinⅡ

同樣地，統(tǒng)計(jì)分析二維圖（圖5）可以得到HSA與大豆皂苷Ⅱ的疏水相互作用詳細(xì)信息，參與疏水作用的氨基酸殘基主要有Lys195、Lys199、Ser202、Phe206、Ala210、Phe211、Trp214、His242、Leu347、Ser480、Leu481、Val482等。顯然HSA中具有內(nèi)源熒光性的Trp214殘基參與了疏水相互作用。而且熒光檢測結(jié)果表2顯示，大豆皂苷Ⅱ可以減弱HSA中的Trp內(nèi)源熒光強(qiáng)度。這也許是因?yàn)榇蠖乖碥闸蚺cHSA中的Trp214殘基距離較近，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移。劉璐莎等［13］研究了土貝母皂苷Ⅱ與HSA的相互作用，發(fā)現(xiàn)土貝母皂苷Ⅱ與HSA中的Trp214殘基有疏水相互作用，且根據(jù)能量轉(zhuǎn)移原理計(jì)算出兩者的距離為4.95 nm，作者推斷受波長295 nm入射光激發(fā)的HSA能量向土貝母皂苷Ⅱ轉(zhuǎn)移，這也是造成土貝母皂苷Ⅱ?qū)SA熒光猝滅結(jié)果的原因之一。

圖6 HSA和大豆皂苷Ⅱ分子間氫鍵作用三維圖Fig.6 The schematic 3D-diagram of H-bonds between HSA and soyasaponinⅡ

在統(tǒng)計(jì)分析參與疏水相互作用的氨基酸殘基后，將這些氨基酸殘基通過DS 2.5軟件以三維圖形式顯示出來，見圖7。從圖7中可看出，參與疏水作用的氨基酸在HSA內(nèi)部組成了一個(gè)疏水性腔體（即圖7中代表靜電中性的白色部分），大豆皂苷Ⅱ的強(qiáng)疏水性配基齊墩果烷伸進(jìn)HSA的此疏水腔內(nèi)，兩者產(chǎn)生了疏水相互作用。

圖7 人血清白蛋白和大豆皂苷Ⅱ分子間疏水作用三維圖Fig.7 The 3D-schematic diagrams of hydrophobic interaction between HSA and soyasaponinⅡ

3 結(jié)論

通過圓二色光譜、內(nèi)源熒光光譜和分子建模方法研究了大豆皂苷Ⅱ與HSA之間的相互作用。圓二色光譜顯示大豆皂苷Ⅱ?qū)SA的二級結(jié)構(gòu)含量產(chǎn)生重要影響，在HSA與大豆皂苷Ⅱ比例為1∶0.5、1∶2和1∶4時(shí)，HSA的α螺旋結(jié)構(gòu)含量增加，而β折疊含量下降。HSA的內(nèi)源熒光光譜表明蛋白與大豆皂苷Ⅱ結(jié)合后使其立體構(gòu)象發(fā)生變化。計(jì)算機(jī)模擬分子對接表明

大豆皂苷Ⅱ與HSA的結(jié)合穩(wěn)定性相對較好，主要作用力以氫鍵和疏水相互作用為主。HSA與皂苷糖基鏈GlcA和Rha部分形成氫鍵作用的氨基酸殘基包括Glu153、Ser192、Gln196、Glu450、Asp451和Ser454等，HSA與皂苷配基三萜烯部分形成疏水相互作用的氨基酸殘基主要有Ala、Leu、Val和Trp等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為將來開發(fā)大豆皂苷保健食品提供了重要參考價(jià)值。

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Interaction between soyasaponinⅡ and human serum albumin

SANG Shang-yuan，GUANG Cui-e*，JIANG Bo
（The State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Study on the interaction of the absorbed soyasaponinⅡ with human serum albumin（HSA）in the circulatory system was performed.The binding of soyasaponinⅡ to the protein was characterized by circular dichroism spectrometry，intrinsic fluorescence spectrometry and molecular.CD spectra displayed that with the concentration ratios of 1∶2 and 1∶4，alpha helical contents of HSA increased and the beta sheet contents decreased.Fluorescence spectra showed that the 3D structure of albumin after the binding of soyasaponinⅡ was changed.The molecular modeling revealed that the binding forces of soyasaponinⅡ to HSA were mainly hydrogen bond and hydrophobic interactions.GlcA and Rha parts of soyasaponin sugar chains and amino acid residues，including Glu153，Ser192，Gln196，Glu450，Asp451 and Ser454，formed hydrogen bonds.The aglycone of soyasaponinⅡ had the hydrophobic interaction with HSA，amino acid residues of which were mainly Leu，Val，Ala and Trp.

soyasaponinⅡ；HSA；interaction；circular dichroism；molecular modeling

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0130-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.018

2015－07－27

桑尚源（1990-），男，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與功能因子，E-mail：shangyuan.sang@qq.com。

*通訊作者：光翠娥（1976-），女，博士，副教授，研究方向：食品營養(yǎng)與功能因子，E-mail：guang1226@hotmail.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31201289）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)新探索課題（SKLF-ZZA-201503）。