紅酵母紅素對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞PC12細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制

張 丹，桑衛(wèi)國(guó)（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

紅酵母紅素對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞PC12細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制

張 丹，桑衛(wèi)國(guó)*
（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

探究紅酵母紅素對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）分為對(duì)照組、模型組（200 μmol/L H2O2）、番茄紅素組（20 μmol/L番茄紅素+200 μmol/L H2O2，陽(yáng)性對(duì)照組）和紅酵母紅素組（1 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2、2 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2和3 μmol/L紅酵母紅素+200 μmol/L H2O2），分別觀察PC12細(xì)胞的形態(tài)變化，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3的活性及細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)含量。結(jié)果表明，與模型組相比，3 μmol/L的紅酵母紅素能維持細(xì)胞原有形態(tài)，降低了11.6%的細(xì)胞凋亡率（p＜0.05），抑制了62.92%的Caspase-3活性（p＜0.01），進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)紅酵母紅素能夠下調(diào)Bax的表達(dá)（p＜0.01），上調(diào)Bcl-2的表達(dá)（p＜0.01），從而阻止了凋亡鏈反應(yīng)。綜上所述，紅酵母紅素可能通過(guò)抑制Caspase-3活性，調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的表達(dá)來(lái)發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞的保護(hù)作用，且其作用存在劑量依賴性。

紅酵母紅素，氧化應(yīng)激，保護(hù)機(jī)制，PC12細(xì)胞，凋亡

當(dāng)受到氧化劑的刺激時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS），會(huì)與細(xì)胞膜上的各種不飽和脂肪酸和膽固醇反應(yīng)，導(dǎo)致自由基連鎖反應(yīng)，抗氧化體系失調(diào)，引起不同程度的細(xì)胞毒性，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［1］。生物體內(nèi)存在的各種自由基通過(guò)多種途徑可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，包括：氧自由基直接損傷細(xì)胞核；激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-3；調(diào)控腫瘤壞死因子等［2-4］。

紅酵母紅素（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）具有和番茄紅素（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2）相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。目前，紅酵母紅素的研究主要集中在其生物上游優(yōu)化發(fā)酵提高色素產(chǎn)量方面，對(duì)關(guān)于其功能活性研究較少。但從化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度來(lái)看，Babin A等［5］以及Lee等［6］報(bào)道了紅酵母紅素在體外具有轉(zhuǎn)化為維生素A的能力，這可能與其具有

滿足生成維生素A的結(jié)構(gòu)—無(wú)取代基的β-芷香環(huán)和側(cè)面具有11個(gè)碳原子的聚合鏈有關(guān)，所以其可能有β-胡蘿卜素所特有的維生素A前體功能。番茄紅素在一定條件下可發(fā)生順?lè)串悩?gòu)化和氧化降解并且番茄紅素對(duì)氧化反應(yīng)比較敏感，其溶液經(jīng)日光照射12 h后，其中的番茄紅素基本上損失殆盡。然而，紅酵母紅素具有14個(gè)共軛雙鍵，目前認(rèn)為共軛雙鍵的數(shù)目和抗氧化活性之間是有聯(lián)系的，所以紅酵母紅素可能具有清除自由基的作用。研究新型類胡蘿卜素對(duì)氧化應(yīng)激的抑制具有一定的科研和應(yīng)用價(jià)值，為類胡蘿卜素的廣泛開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。目前為止，發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素還未能進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，如果可進(jìn)行發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)的紅酵母紅素具有和番茄紅素相比擬的功能活性，那么其應(yīng)用前景是非常樂(lè)觀的。

圖1 紅酵母紅素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of torularhodin

圖2 番茄紅素結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formula of lycopene

PC12細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞）廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的體外研究，也是在機(jī)體內(nèi)最容易受到氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞之一，所以本實(shí)驗(yàn)以其為模型細(xì)胞。與此同時(shí)，H2O2常常作為模擬氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑。本實(shí)驗(yàn)中采用PC12細(xì)胞和H2O2來(lái)建立氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，通過(guò)研究細(xì)胞的凋亡水平，可以進(jìn)一步地了解紅酵母紅素對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PC12細(xì)胞（小鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株） 上海細(xì)胞所；紅酵母紅素（純度≥95%） 江南大學(xué)生物工程學(xué)院；番茄紅素（純度≥95%） 美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清 美國(guó)Gibco公司；碘化丙啶（PI，純度≥94%）、Hoechst33342（純度≥98%） 南京建成生物工程研究所；AnnexinVFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Caspase-3試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗鼠β-actin抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體 美國(guó)Cell sinaling公司；其他試劑 均為分析純?cè)噭?/p>

BX51型倒置相差顯微鏡、TH4-200熒光顯微鏡 日本Olympus公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BectonDickinson公司；SpectraMax M5/M5e酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng) 美國(guó)ProteinSimple公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅酵母紅素溶液的制備 將經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除雜除菌，高度純化的紅酵母紅素溶于細(xì)胞培養(yǎng)液中，分別配成1、2和3 μmol/L的紅酵母紅素溶液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃下培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化傳代［7］。待PC12細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，隨機(jī)分為六組：對(duì)照組、模型組、番茄紅素組和三組紅酵母紅素的實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組：加入細(xì)胞培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)26 h；模型組：先加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，再加200 μmol/L H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h；番茄紅素組：加20 μmol/L番茄紅素培養(yǎng)細(xì)胞24 h，加200 μmol/L H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，作為陽(yáng)性對(duì)照；三組紅酵母紅素的實(shí)驗(yàn)組：分別加1、2和3 μmol/L紅酵母紅素溶液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，加200 μmol/L H2O2溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 PC12細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)皿中按上述方法1.2.2培養(yǎng)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

收集各組細(xì)胞，先1000×g離心5 min，吸走上清，加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液吹打重懸細(xì)胞，在25℃避光孵育10 min，然后按上述同樣方法離心，吸走上清，再加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液吹打重懸細(xì)胞，最后加入10 μL PI染色液，小心混勻，冰浴避光保存。隨即進(jìn)入流式細(xì)胞儀以525 nm綠色熒光和620 nm紅色熒光檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Caspase-3活性的檢測(cè) 采用碧云天試劑盒檢測(cè)Caspase-3活性。Casepase-3的底物催化產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺（pNA）在405 nm附近有強(qiáng)吸收，從而可以通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)檢測(cè)Caspase-3的活性。

1.2.6 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平

將各組細(xì)胞提取蛋白，并用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定其濃度。按每孔10 μL點(diǎn)樣，用12.5%的SDS-聚丙烯酰胺（PAGE）進(jìn)行凝膠電泳，等蛋白完全分離后，采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。接著，放入含5%牛血清蛋白的洗膜緩沖液中，在室溫條件下封閉1 h。根據(jù)分子量大小剪下目的條帶分別加入一抗：β-actin抗體（1∶1000）、Bax抗體（1∶1000）和Bcl-2抗體（1∶1000），4℃孵育過(guò)夜。取出條帶，洗滌后放入二抗，室溫孵育1 h，最后洗膜并用3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，成像，使用電泳圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)為至少三次的平行數(shù)據(jù)結(jié)果，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢測(cè)，p值是接受兩均值存在差異這個(gè)假設(shè)可能犯錯(cuò)的概率。p＜0.05代表差異具有顯著性，p＜0.01代表差異具有高度顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3為倒置相差顯微鏡下觀察的PC12細(xì)胞形態(tài)。從圖3-A可以看出，正常的PC12細(xì)胞自由伸展、呈現(xiàn)纖維狀，細(xì)胞形態(tài)清晰分明；而圖3-B中模型組的PC12細(xì)胞不再自由伸展，皺縮成球形，不少細(xì)胞漂浮而死。在紅酵母紅素預(yù)孵育的情況下，細(xì)胞一定程度上受到了保護(hù)，即使后續(xù)加入H2O2，細(xì)胞形態(tài)也沒(méi)有

太大的異常，如圖3-D、圖3-E、圖3-F，細(xì)胞邊界清晰，大部分仍成自由伸展?fàn)顟B(tài)，其中3 μmol/L的紅酵母紅素保護(hù)的細(xì)胞形態(tài)最好，依舊大部分呈現(xiàn)角狀梭狀，正常生長(zhǎng)。

H2O2作用于細(xì)胞時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。一旦組成細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞膜的流動(dòng)性就會(huì)下降，穩(wěn)定性隨之崩潰，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化［8］。在本實(shí)驗(yàn)中，得到不同濃度的紅酵母紅素在一定程度上保持了細(xì)胞膜的完整性，維持了PC12細(xì)胞的正常形態(tài)，從而對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞有保護(hù)作用。

圖3 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Effect of torularhodin on the morphology of PC12 cell

2.2 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響

處于凋亡早期的細(xì)胞會(huì)把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞膜外側(cè)，磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)，而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以減弱磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。在Annexin V-FITC和PI染色后，使用流式細(xì)胞儀，正常的活細(xì)胞不被Annexin V-FITC和PI染色（流式圖的左下角區(qū)域）；凋亡早期的細(xì)胞僅被Annexin V-FITC染色（流式圖的右下角區(qū)域）；壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可以同時(shí)被Annexin V-FITC和PI染色（流式圖的右上角區(qū)域）。凋亡早期、壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞所占比例的總和為細(xì)胞凋亡率。

見(jiàn)圖4，對(duì)照組細(xì)胞大部分出現(xiàn)在左下角區(qū)域，說(shuō)明細(xì)胞處于正常狀態(tài)；當(dāng)經(jīng)過(guò)H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯增加，凋亡早期和壞死細(xì)胞、凋亡晚期的細(xì)胞比例均有所升高，其細(xì)胞凋亡率為12.7%，比對(duì)照組高了12%；在經(jīng)過(guò)紅酵母紅素的保護(hù)之后，細(xì)胞凋亡率顯著下降，分別從12.7%下降到5.7%、3.9%和1.1%，呈劑量依賴性，且與對(duì)照組相比3 μmol/L的紅酵母紅素組細(xì)胞凋亡率具有顯著性差異（p＜0.05）。

有研究通過(guò)Annexin V/PI雙染法測(cè)定細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)氧化受損細(xì)胞的凋亡早期、壞死和凋亡晚期細(xì)胞比例明顯增加［9］。Qiang等［10］發(fā)現(xiàn)，相比模型組，三七總皂苷保護(hù)組的凋亡早期、壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞比例均有所減小，即三七總皂苷具有抗凋亡活性；與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)紅酵母紅素

對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有一定程度的改善作用，尤其對(duì)于凋亡早期的細(xì)胞具有特別顯著的保護(hù)作用。

圖4 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞凋亡率的影響Fig.4 Effect of torularhodin on the apoptosis rate of PC12 cell

2.3 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞Caspase-3活性的影響

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，沒(méi)有活性，在凋亡的早期階段會(huì)被激活［11］，對(duì)染色體固縮等過(guò)程起到了重要的作用［12-13］，并可以直接特異性剪切DNA修復(fù)酶PARP，脫氧核糖核苷酸酶等。

從圖5中可以看出，模型組的Caspase-3活性提高到175.23%（p＜0.01），表明H2O2激發(fā)了細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化。同時(shí)，在不同濃度的紅酵母紅素對(duì)細(xì)胞保護(hù)培養(yǎng)后，Caspase-3活性都有一定程度的降低，其中3 μmol/L紅酵母紅素組的Caspase-3活性高度顯著降低到112.31%（p＜0.01），其保護(hù)效果最好。

Caspase-3在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡通路中起到了關(guān)鍵的作用［14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2激發(fā)了Caspase-3的活化，進(jìn)行PARP的剪切，促使細(xì)胞凋亡，而不同濃度的紅酵母紅素抑制了這種促發(fā)機(jī)制，且存在一定的劑量依賴性，這與多篇報(bào)道對(duì)于氧化應(yīng)激的作用機(jī)制研究結(jié)果是相類似的［15-16］。其中，3 μmol/L紅酵母紅素組具有高度顯著的調(diào)控作用。

圖5 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞Caspase-3活性的影響Fig.5 Effect of torularhodin on the Caspase-3 activity of PC12 cell

2.4 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

在凋亡研究中促進(jìn)和抑制細(xì)胞凋亡的蛋白有著關(guān)鍵作用，其中Bax蛋白為典型的促凋亡蛋白，而B(niǎo)cl-2蛋白為抗凋亡蛋白［17］。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時(shí)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)量增加，促發(fā)凋亡鏈反應(yīng)［18］。而抗凋亡蛋白Bcl-2可以通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，阻止細(xì)胞色素的釋放，從而阻止一系列凋亡鏈反應(yīng)［19］。

圖6是Bax和Bcl-2的表達(dá)情況，從圖7柱狀圖數(shù)據(jù)中可以看出，與對(duì)照組相比，模型組的Bax蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，增加幅度達(dá)到38.24%（p＜0.01），而B(niǎo)cl-2的表達(dá)量降低了22.08%（p＜0.01）。但是通過(guò)加入番茄紅素或是不同濃度的紅酵母紅素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)后，與模型組相比，Bax蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量也得到一定程度的恢復(fù)。其中3 μmol/L紅酵母紅素組的Bax蛋白表達(dá)量比模型組降低了37.46%（p＜0.05），其Bcl-2蛋白表達(dá)量上升18.89%（p＜0.01）。

從凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，H2O2導(dǎo)致氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)量發(fā)生變化，促使凋亡的發(fā)生，而不同濃度的紅酵母紅素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)后，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，從而阻止了凋亡鏈反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。

圖6 Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.6 Testing related protein expression in cells by Western-blot

圖7 紅酵母紅素對(duì)PC12細(xì)胞的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of torularhodin on the Bax，Bcl-2 protein expression of PC12 cell

3 結(jié)論

在PC12細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型中，H2O2對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行氧化損傷，而不同濃度的紅酵母紅素均對(duì)氧化受損的細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控和保護(hù)，且調(diào)控能力呈現(xiàn)劑量依賴性，其中3 μmol/L紅酵母紅素具有較好的調(diào)控能力。紅酵母紅素能通過(guò)保護(hù)細(xì)胞膜，抑制Caspase-3的活性，有效調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)量，從而發(fā)揮抗凋亡活性，對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

［1］盧靜，王麗，左麗麗，等.蕎麥蜂花粉的氧化應(yīng)激防護(hù)及其活性成分分析［J］.食品工業(yè)科技，2014，3（1）：130-135.

［2］Vaisanen EE，Annikal，Smeds Al，et al.Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings［J］.Planta，2015，242（3）：747-760.

［3］Fujiwara N，Nakano M，Kato S，et al.Oxidative modification to cysteine sulfonic acid of Cys111 in human copper-zinc superoxide dismutase［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（49）：35933-35944.

［4］Paulech J，Liddy KA，Enqholm，et al.Global analysis of myocardial peptides containing cysteines with irreversible sulfinic and sulfonic Acid post-translational modifications［J］.Mol Cell Proteomics，2015，14（3）：609-620.

［5］Babin A，Saciat C，Teixeira M，et al.Limiting immunopathology：Interaction between carotenoids and enzymatic antioxidant defences［J］.Dev Comp Immunol，2015，49（2）：278-281.

［6］Lee da H，Nam YJ，Lee CS.Quercetin-3-O-（2″-galloyl）-α-L-rhamnopyranoside attenuates cholesterol oxidation productinduced apoptosis by suppressing NF-κB-mediated cell death process in differentiated PC12 cells［J］.Naunyn Schmiedeberqs Arch Pharmacol，2015，388（8）：869-881.

［7］Benedí J，Arroyo R，Romero C，et al.Antioxidant properties and protective effects of a standardized extract of Hypericum perforatum on hydrogen peroxide-induced oxidative damage in PC12 cells［J］.Life Sciences，2004，75（10）：1263-1276.

［8］Li S P，Zhao K J，Ji Z N，et al.A polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis，a traditional Chinese medicine，protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury［J］.Life Sciences，2003，73（19）：2503-2513.

［9］Raza H，John A，Benedict S，et al.Acetylsalicylic acidinduced oxidative stress，cell cycle arrest，apoptosis and mitochondrial dysfunction in human hepatoma HepG2 cells［J］.European Journal of Pharmacology，2011，558（2）：15-24.

［10］Qiang H，Gao P G，Zhang C，et al.Effects of Panax notoginseng saponins on apoptosis induced by hydrogen peroxide in cultured rabbit bone marrow stromal cells via altering the oxidative stress level and down-regulating Caspase-3［J］.Journal of Nanjing Medical University，2009，23（6）：373-379.

［11］Rahman MA，Amin AR，Wang D，et al.RRM2 regulatis Bxl-2 in head and neck and lung cancers：a potential target for cancer therapy［J］.Clin Cancer Res，2013，19（13）：3416-3428.

［12］Zhou F，Xin S，Liang HW，et al.Carbon nanofibers decorated with molybdenum disulfide nanosheets：synergistic lithium storage and enhanced electrochemical performance［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2014，53（43）：11552-11556.

［13］Braun F，De Carne，Trecesson S，et al.Protect and serve：Bcl-2 proteins as quardians and rulers of cancer cell survival［J］.Cell Cycle，2013，18（12）：2937-2947.

［14］Jiang L，Wang H，Shi C，et al.ZNF667/Mipu1 is a novel anti-apoptotic factor that directly regulates the expression of the rat Bax gene in H9C2 cells［J］.Plos One，2014，11（9）：38-49.

［15］Zhao YR，Qu W，Liu WY，et al.YGS40，an active fraction of Yi-Gan San，reduces hydrogen peroxide-induxed apoptosis in PC12 cells［J］.Chin J Nat Med，2015，13（6）：438-444.

［16］Kim H J，Lee K W，Kim M S，et al.Piceatannol attenuates hydrogen-peroxide-and peroxynitrite-induced apoptosis of PC12 cells by blocking down-regulation of Bcl-2 and activation of JNK［J］.Journal of Nutrtion Biochemistry，2008，19（6）：459-466.

［17］Sherhod R，Gillet VJ，Judson PN，et al.Automating knowledge discovery for toxicity prediction using jumping emerging pattern mining［J］.J Chem Inf Model，2012，52（11）：3074-3087.

［18］Cho E S，Lee K W，Lee H J.Cocoa procyanidins protect PC12 cells from hydrogen-peroxide-induced apoptosis by inhibiting activation of p38 MAPK and JNK［J］.Mutation Research，2008，640（28）：123-130.

［19］Barber S C，Higginbottom A，Mead R J，et al.An in vitro screening cascade to identify neuroprotective antioxidants in ALS ［J］.Free Radical Biology and Medicine，2009，46（8）：1127-1138.

Cytoprotective mechanism of torularhodin against oxidative stress

ZHANG Dan，SANG Wei-guo*
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

This study aims to investigate the cytoprotective mechanism of torularhodin against oxidative stress.PC12 cells were randomly divided into control group and model group（200 μmol/L H2O2），lycopene group （20 μmol/L lycopene+200 μmol/L H2O2，positive control group）and torularhodin groups（1 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2，2 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2and 3 μmol/L torularhodin+200 μmol/L H2O2）.The changes of PC12 cell morphology were observed，while the apoptosis rate of cell，the activity of Caspase-3 and expressions of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 were also detected.Results showed that 3 μmol/L torularhodin could maintain the original shape of cell，reduce 11.6% apoptosis rate（p＜0.05）and inhibit 62.92% Caspase-3 activity（p＜0.01），comparing with the model group.Further study demonstrated that torularhodin could down-regulate the expression of Bax（p＜0.01）and up-regulate the expression of Bcl-2 （p＜0.01），which thereby prevented chain reaction of apoptosis and protected cells from oxidative stress.In a word，torularhodin could effectively protect cells against oxidative stress，by mechanisms which probably involves the inhibition of Caspase-3 activity and adjustment of Bax，Bcl-2 expression in dose-dependent manner.

torularhodin；oxidative stress；protect mechanism；PC12 cells；apoptosis

TS264.4

A

1002-0306（2016）08-0120-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.016

2015-09-08

張丹（1987-），女，碩士，研究方向：生物技術(shù)及功能性食品，E-mail：1030453360@qq.com。

*通訊作者：桑衛(wèi)國(guó)（1954-），男，副教授，研究方向：生物技術(shù)、食品研發(fā)和海洋生物分子育種，E-mail：282324079@qq.com。