黑靈芝水溶性膳食纖維的理化性質(zhì)及抗氧化活性

陳海紅，殷鵬飛，殷軍藝，謝明勇（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

黑靈芝水溶性膳食纖維的理化性質(zhì)及抗氧化活性

陳海紅，殷鵬飛，殷軍藝，謝明勇*
（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330047）

目的：以黑靈芝為原料，研究其水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）的理化性質(zhì)及抗氧化活性。方法：在中試水平上通過(guò)熱水浸提法制備黑靈芝SDF，并采用紅外光譜、氣相色譜等技術(shù)分析其理化性質(zhì)；通過(guò)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除能力、羥基自由基（OH·）清除能力、鐵還原/抗氧化能力（ferric reducing/ antioxidant power，F(xiàn)RAP）等評(píng)價(jià)體系表征SDF的抗氧化能力。結(jié)果：從黑靈芝中提取得到的SDF總糖含量47.3%，蛋白質(zhì)含量7.0%，糖醛酸含量5.7%；紅外光譜中有多糖和β-糖苷鍵吸收峰，GC分析結(jié)果表明SDF中的主要單糖以甘露糖、葡萄糖和半乳糖為主，三者摩爾比分別為1∶4.4∶3；抗氧化實(shí)驗(yàn)表明黑靈芝SDF具有一定的抗氧化能力，抗氧化能力與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。結(jié)論：從黑靈芝中提取得到的水溶性膳食纖維SDF，顯示其具有糖的結(jié)構(gòu)特征，主要單糖為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，SDF具有一定的抗氧化能力，具有良好的開發(fā)、利用價(jià)值。

黑靈芝，水溶性膳食纖維，理化性質(zhì)，抗氧化特性

近年來(lái)，隨著物質(zhì)生活水平的提高，我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)逐漸由低脂肪、低能量密度、高膳食纖維的植物性食物，轉(zhuǎn)變?yōu)楦咧尽⒏吣芰棵芏鹊膭?dòng)物性食物，導(dǎo)致目前一系列的“文明病”如肥胖、冠心病、糖尿病、腸癌等發(fā)病率呈遞增趨勢(shì)［1］。膳食纖維由Hipsley在1953年提出，2009年國(guó)際食品法典委員會(huì)定義膳食纖維為：不能被人體小腸內(nèi)生酶水解的具有十個(gè)或十個(gè)以上鏈節(jié)的碳水化合物，屬于天然存在于消費(fèi)食物中可食的碳水化合物；由食物原料經(jīng)物理、酶或化學(xué)法獲得的碳水化合物；對(duì)健康表現(xiàn)出有益的生

理作用的人造碳水化合物的聚合物［2］。大量的研究表明，攝入膳食纖維有利于一些慢性疾病控制，如肥胖［4］、2型糖尿病［5-6］、癌癥［7-8］、痢疾［9］、心血管疾?。?0］等。

靈芝（Ganoderma lucidum）是我國(guó)珍貴的藥用真菌之一，目前已有約200種靈芝屬真菌被發(fā)現(xiàn)，其中赤靈芝的研究最為廣泛。2003年日本學(xué)者服部幸治，以C57BL16小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)給它們腹腔注射赤靈芝與黑靈芝水提物（8 d），在第9 d靜脈注射B16小鼠黑素瘤細(xì)胞，通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)研究并比較兩者對(duì)癌轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果表明赤靈芝與黑靈芝均較對(duì)照組明顯抑制轉(zhuǎn)移灶形成，但黑靈芝作用更為顯著［11］，自此之后有關(guān)黑靈芝的研究越來(lái)越多。黑靈芝的有效成分較復(fù)雜，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)黑靈芝多糖是主要的活性物質(zhì)之一［12］。目前研究表明黑靈芝多糖在降血糖［13］、抗衰老［14］、抗腫瘤［15］、調(diào)節(jié)免疫力［16］等方面具有積極的作用。

在實(shí)際應(yīng)用中，黑靈芝常作為一種藥材，對(duì)其功效成分進(jìn)行高效的提取一直是影響黑靈芝產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵。黑靈芝膳食纖維是一種富含功能性多糖的功能性膳食纖維，極具開發(fā)潛力。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，已得到了其小試實(shí)驗(yàn)提取的最佳提取工藝［1］。本文以黑靈芝為原料，在之前的工作基礎(chǔ)上進(jìn)行了中試放大實(shí)驗(yàn)，并對(duì)此條件下提取得到的水溶性膳食纖維的理化性質(zhì)和抗氧化特性進(jìn)行研究，以期為黑靈芝膳食纖維功能性食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑靈芝 產(chǎn)自江西贛州安遠(yuǎn)縣；L-鼠李糖（LRha，生化試劑）、D-阿拉伯糖（D-Ara，生化試劑）Solarbio；D-甘露糖（D-Man，生化試劑） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-半乳糖（D-Gal，生化試劑）、D-核糖（D-Rib，生化試劑）、L-巖藻糖（L-Fuc，生化試劑）、D-葡萄糖（D-Glc，生化試劑）、半乳糖醛酸（GalA；生化試劑）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、維生素C（VC）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）Sigma；D-木糖（D-Xyl，生化試劑） 中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑；考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝） Fluka；維生素E（VE） Aladdin；雙氧水（H2O2）、氯化鐵（FeCl3）、2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三吖嗪（TPTZ）、水楊酸、冰醋酸、硫酸亞鐵、醋酸鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇等試劑 均為分析純。

6890 N氣相色譜儀 Agilent公司；Nicolet 5700 FT-IR傅立葉式變換紅外光譜儀 Thermo electron Corporation；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 Thermo Scientific；TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Martin Christ；Milli-Q超純水儀 Millipore公司；DZG-6050真空干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 可溶性膳食纖維的提取 參考文獻(xiàn)［1］小試單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析所得的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)考慮，確定黑靈芝SDF的中試放大提取工藝條件為：水提、提取溫度98℃、料液比1∶10、提取時(shí)間為120 min。在中試規(guī)模下的提取工藝流程為：

錘片粉碎機(jī)（粉碎）→多功能反應(yīng)釜（浸提）→三足離心機(jī)（離心）→單效降膜蒸發(fā)裝置（濃縮）→冷熱缸（醇沉）→抽濾機(jī)（抽濾）→冷凍干燥機(jī)（干燥）→水溶性膳食纖維。

1.2.2 SDF理化性質(zhì)分析

1.2.2.1 化學(xué)成分分析 采用苯酚-硫酸法［17］，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定中性糖含量。采用考馬斯亮藍(lán)法［18］，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定蛋白質(zhì)含量。采用硫酸-咔唑法［19］，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定糖醛酸含量。

1.2.2.2 SDF紅外光譜掃描 取干燥SDF樣品適量與KBr一定比例混合，研磨，制片，用Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀在4000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.2.3 SDF單糖組成分析 參考文獻(xiàn)［20］，稱取5 mg的SDF于安瓿管中，加入2 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸，真空封管，然后置于烘箱中，于100℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，得到水解后的單糖混合物，然后將水解得到的單糖混合物衍生為糖腈乙酸酯，反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)樣，用氣相色譜分析。

色譜條件：采用DB-1701石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），N2做載氣；檢測(cè)器為FID檢測(cè)器，溫度250℃；進(jìn)樣口溫度250℃，升溫程序：170℃保持2 min，以10℃/min升至250℃，維持20 min；色譜柱溫度：250℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。

1.2.3 SDF抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 SDF對(duì)DPPH自由基的清除能力 參考文獻(xiàn)［21］，精確配制10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的黑靈芝膳食纖維標(biāo)液。以VC（0.314、0.628、1.256、2.512、5.024 mg/mL）、VE、BHT（0.625、1.25、2.5、5、10 mg/mL）為陽(yáng)性對(duì)照組。分別在10 mL的具塞試管中加入2 mL濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液，再加2 mL樣品溶液，搖動(dòng)充分混勻，在室溫下靜置30 min后移取適量至96孔板，在517 nm下測(cè)定吸光度值。黑靈芝可溶性膳食纖維對(duì)DPPH自由基的清除能力按以下公式計(jì)算：

式中：A0：為空白對(duì)照液的吸光度；A1：為樣品溶液本底的吸光度；A2：為加入樣品溶液后的吸光度。

1.2.3.2 SDF對(duì)OH自由基的清除能力 參考文獻(xiàn)［22］，精確吸取2 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸溶液1 mL、待測(cè)液1 mL，置于比色管中，搖勻；混勻后加入1 mmol/L H2O2溶液1 mL，啟動(dòng)反應(yīng)，置于37℃恒溫水浴保溫，反應(yīng)60 min后取出移置96微孔板，用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，黑靈芝可溶性膳食纖維的OH自由基清除率可由以下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0：為不加待測(cè)樣品空白對(duì)照的吸光度值；A1：待測(cè)樣品吸光度；A2：為加超純水代替H2O2的待測(cè)樣品的自身吸光度值。

1.2.3.3 鐵還原/抗氧化能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)［23］測(cè)定SDF的鐵還原抗氧化能力，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精確配制1 mmol/L FeSO4母液溶液，加超純水分別稀釋

為：1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入1.8 mL的FRAP工作液（三氯化鐵溶液，TPTZ溶液，醋酸鈉緩沖溶液，按照各自體積比1∶1∶10混合），以FeSO4濃度為X軸，吸光值為Y軸，建立線性回歸方程：y=0.2841x+0.2465，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9969。

測(cè)定方法：分別移取不同濃度的SDF樣品溶液或VC溶液100 μL，加入預(yù)熱至37℃的FRAP工作液1.8 mL，搖勻置37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min，反應(yīng)后分別移取100 μL反應(yīng)液置96微孔板中，用多功能酶標(biāo)儀在593 nm處測(cè)定其吸光度值（A值）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)使用Origin 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)都平行測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF化學(xué)成分分析

SDF的中性糖、蛋白質(zhì)、糖醛酸含量如表1所示。黑靈芝膳食纖維的中性糖含量較高，達(dá)47.3%，同時(shí)含有一定量的蛋白質(zhì)和糖醛酸。

表1 SDF化學(xué)成分分析（±SD，n=3）Table1 Chemical composition of SDF（±SD，n=3）

表1 SDF化學(xué)成分分析（±SD，n=3）Table1 Chemical composition of SDF（±SD，n=3）

成分 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 R2含量（%）中性糖 Y=7.166x+0.0013 0.9998 47.3±0.2蛋白質(zhì) Y=11.81x+0.0725 0.9986 7.0±0.2糖醛酸 Y=24.904x-0.0006 0.9911 5.7±0.1

2.2 SDF紅外圖譜分析

SDF的紅外圖譜如圖1所示。SDF在3200～3600 cm-1之間出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)，且較寬的的吸收峰，此峰是糖類的O-H引起的。同時(shí)在2900 cm-1也有一段較弱的吸收峰，是糖類C-H的伸縮振動(dòng)，以上兩個(gè)特征峰是糖類的特征吸收峰。在1630 cm-1附近有或強(qiáng)或弱的吸收峰，是糖環(huán)的伸縮振動(dòng)中C=O的伸縮振動(dòng)，1390 cm-1附近的吸收峰為N-H的變角振動(dòng)，推斷可能有少量與糖結(jié)合的蛋白質(zhì)存在，906.3 cm-1附近有吸收峰，說(shuō)明含有少量β構(gòu)型糖苷鍵［24］。

圖1 SDF的紅外光譜圖Fig.1 The infrared spectrum of SDF

2.3 SDF單糖組成結(jié)果分析

采用氣相色譜分析SDF的單糖組成，8種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)中糖腈乙酸酯衍生物的GC結(jié)果見(jiàn)圖2，SDF單糖組成結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖2可知8種單糖在GC的設(shè)定條件下可以實(shí)現(xiàn)良好的分離，由圖3可知黑靈芝SDF單糖組成較為復(fù)雜，但主要單糖種類為甘露糖、葡萄糖和半乳糖。通過(guò)計(jì)算得到三者之間的摩爾比為：1∶4.4∶3。

圖2 混合單糖的糖腈乙酸酯衍生物GC圖Fig.2 Gas chromatograms of acetate derivatized of standard monosaccharides

圖3 SDF水解后單糖糖腈乙酸酯衍生物的GC圖Fig.3 Gas chromatograms of the monosaccharide compositions of SDF

2.4 SDF抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

圖4 SDF對(duì)DPPH·自由基的清除能力Fig.4 Scavenging abilities of SDF on DPPH free radicals

2.4.1 SDF對(duì)DPPH自由基清除能力 DPPH·在95%乙醇溶液中是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有吸收峰，呈紫色。當(dāng)自由基清除劑存在時(shí)，DPPH的孤電子被配對(duì)，顏色變淺，在最大吸收波長(zhǎng)處吸光度變小，且顏色變化與配對(duì)電子數(shù)成化學(xué)計(jì)量關(guān)系，因此，可用來(lái)評(píng)價(jià)自由基的清除情況［25］。黑靈芝SDF對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的變化見(jiàn)圖4。由圖4

可知，VC、VE、BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）、SDF 對(duì)DPPH自由基均表現(xiàn)出清除作用，且在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照組和樣品SDF組隨著自身濃度的增加，其DPPH自由基的清除效率也表現(xiàn)出遞增現(xiàn)象。同時(shí)，從圖4可知，低濃度時(shí)SDF對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯弱于VC、BHT、VE，但是隨著SDF濃度增加，其清除率逐漸接近VC、BHT、VE。

2.4.2 SDF對(duì)OH自由基的清除能力 生物體本身受到一些物理、化學(xué)等因子的損傷，會(huì)在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生毒性最強(qiáng)的活性氧自由基-羥基自由基（OH·），它可以和活細(xì)胞中的生物大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，且速度極快，這是造成機(jī)體過(guò)氧化損傷的主要因素之一［26］。而OH·自由基產(chǎn)生模型為：在一定條件下，雙氧水和鐵離子發(fā)生反應(yīng)：Fe2++H2O2→Fe3++OH·+OH-，產(chǎn)生OH自由基。研究表明如在反應(yīng)體系中加入水楊酸試劑，可有效的清除OH·，反應(yīng)生成的產(chǎn)物在510 nm處有強(qiáng)吸收峰，故可以通過(guò)吸收峰值的大小來(lái)了解抗氧化劑清除OH·的能力。黑靈芝SDF對(duì)OH·的清除率可見(jiàn)圖5，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：SDF體外具有明顯的清除OH·的能力，隨著SDF濃度的增加，清除率也在不斷增加，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。但其清除能力比VC略低。

圖5 SDF對(duì)OH自由基清除效果Fig.5 Scavenging abilities of SDF on OH free radicals

2.4.3 鐵還原/抗氧化能力結(jié)果與分析 鐵離子還原/抗氧化能力簡(jiǎn)稱FRAP，此法利用TPTZ-Fe3+在抗氧化劑存在下被還原為TPTZ-Fe2+生成藍(lán)色絡(luò)合物，且在593 nm處有最大吸收值。因此，可以通過(guò)吸光強(qiáng)度大小來(lái)判斷樣品中抗氧化能力的強(qiáng)弱，F(xiàn)RAP值通常是以相同抗氧化能力的FeSO4毫摩爾數(shù)表示樣品抗氧化性的大小，吸光度越大FRAP越大，待測(cè)樣品的抗氧化能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，由圖6可知SDF具有一定的抗氧化能力，且在待測(cè)濃度范圍內(nèi)隨著濃度增加抗氧化能力增強(qiáng)，但較陽(yáng)性對(duì)照VC還有一定的差距。

圖6 SDF的FRAP值Fig.6 FRAP value of SDF

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)在中試規(guī)模上制備得到的黑靈芝SDF的理化性質(zhì)及抗氧化活性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黑靈芝SDF的中性糖含量較高（47.3%），含有一定量的蛋白質(zhì)（7.0%）和糖醛酸（5.7%）；紅外分析結(jié)果顯示SDF中含有明顯的多糖特征官能團(tuán)結(jié)構(gòu)；單糖組成分析結(jié)果表明SDF主要含有甘露糖，葡萄糖，半乳糖，三者的摩爾比為：1∶4.4∶3；同時(shí)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黑靈芝SDF具有一定的抗氧化能力，且對(duì)不同自由基其清除能力是不同的；抗氧化能力與濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。此研究可為合理開發(fā)利用黑靈芝資源提供一定參考。

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Physicochemical properties and antioxidant activities of water soluble dietary fiber from Ganoderma atrum

CHEN Hai-hong，YIN Peng-fei，YIN Jun-yi，XIE Ming-yong*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

Objective：To analyse the physicochemical and antioxidant characteristics of SDF from Ganoderma atrum.Methods：Water soluble dietary fiber（SDF）from Ganoderma atrum was extracted by hot water using the pilot scale experiment.Physico-chemical properties were characterized by using the infrared spectrum（IR），gas chromatography（GC）and so on.The scavenging rates of SDF derived from Ganoderma atrum against DPPH and OH·radicals and its ferric reducing/antioxidant power were investigated to evaluated the in vitro antioxidant activities of SDF.Results：The total sugar，protein and uronic acid contents of SDF were 47.3%，7.0% and 5.7%，successively.As shown by infrared spectrum（IR），SDF possessed characteristic absorptions of polysaccharide and β-glucosidic linkage.Mannose，glucose and galactose were the main monosaccharide of SDF with molar ratio of 1∶4.4∶3，according to gas chromatography（GC）.The antioxidant activity analysis showed that the SDF possessed good antioxidant activities with dose-dependence via DPPH·radicals，OH·radicals and ferric reducing/antioxidant power models.Conclusion：The SDF extracted from Ganoderam atrum possessed characteristic absorptions of polysaccharide.Mannose，glucose and galactose were the mainly monosaccharides.SDF showed a certain extent antioxidant effect in vitro.It had the value of development and utilization.

Ganoderma atrum；soluble dietary fiber；physicochemical property；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2016）08-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.015

2015－09－14

陳海紅（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與分析技術(shù)，E-mail：chh0810ncu@163.com。

*通訊作者：謝明勇（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)，食品營(yíng)養(yǎng)與安全，E-mail：myxie@ncu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（31130041）；國(guó)家自然科學(xué)基金（21265011）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD33b06）。