溶藻弧菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立

李丹丹，徐義剛，李夢(mèng)圓，王 昱，邱索平，高會(huì)江，高慎陽(yáng)（.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南?？?0；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱000；.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州0900；.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶000；.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京009；.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州200）

溶藻弧菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立

李丹丹1，徐義剛2，*，李夢(mèng)圓3，王 昱4，邱索平3，高會(huì)江5，高慎陽(yáng)6
（1.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南海口570311；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；3.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510900；4.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，重慶404100；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京100193；6.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001）

為建立溶藻弧菌（VA）的快速檢測(cè)方法，本研究以VA Collagenase基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)合成引物及TaqMan探針，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)VA的方法。結(jié)果顯示，對(duì)15株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，只有VA菌株檢測(cè)為陽(yáng)性，表明該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)；該方法的靈敏度為18 cfu/mL；穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一樣品重復(fù)檢測(cè)4 次Ct值的變異系數(shù)均小于2%；利用該檢測(cè)方法對(duì)采集的165份樣品進(jìn)行檢測(cè)，共計(jì)檢出2份VA陽(yáng)性樣品，與SN/T 2564-2010行標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果一致，顯示了良好的實(shí)用性。該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有良好的實(shí)用性。

溶藻弧菌，Collagenase基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，VA）是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，在海水養(yǎng)殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動(dòng)物中分布廣泛，是流行程度、危害程度較高的食源性致病菌之一［1-3］，人類進(jìn)食被VA污染的食品能夠引起急性胃腸炎，嚴(yán)重者還可引起敗血癥［4-6］。因此，建立快速并且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)防止VA的感染和提高VA的檢測(cè)效率具有重要意義。

目前，包括我國(guó)在內(nèi)的絕大多數(shù)國(guó)家針對(duì)溶藻弧菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)細(xì)菌分離鑒定的方法。該方法存在檢測(cè)效率低、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細(xì)菌需要一周的時(shí)間，而針對(duì)一些生化特性復(fù)雜的細(xì)菌，如單增李斯特氏菌的檢測(cè)周期可長(zhǎng)達(dá)10 d之久［7］，嚴(yán)重影響了檢測(cè)效率，很難滿足現(xiàn)代化食品安全快速檢測(cè)的需要。LAMP法，是近年來剛剛興起的一種檢測(cè)方法，在某種程度上提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本；PCR技術(shù)在病原體核酸檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，靈敏度和特異性都比較高，但是LAMP和PCR這兩種檢測(cè)方法都存在著假陽(yáng)性率比較高的問題［8］。相對(duì)而言，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，與常規(guī)PCR方法相比，特異性、靈敏度都更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，無需對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行后處理，有效地解決了PCR產(chǎn)物易污染造成的假陽(yáng)性和不能準(zhǔn)確定量的問題。該項(xiàng)技術(shù)已發(fā)展成為一種較成熟的分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)的科研和檢測(cè)機(jī)構(gòu)都配備了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀，并為廣大用戶所接受，應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)工作中［9］。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，精準(zhǔn)度、靈敏度和特異性均高于常規(guī)PCR檢測(cè)方法，同時(shí)適用范圍廣泛，目前已經(jīng)成為一種常用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)［10-12］。本研究利用該技術(shù)，建立了VA實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，為快速準(zhǔn)確檢測(cè)VA提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌O157∶H7、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、粘質(zhì)沙雷菌、創(chuàng)傷弧菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸侵襲性大腸桿菌、霍亂弧菌和溶藻弧菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株 購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心；165份水產(chǎn)品 來自于水產(chǎn)品養(yǎng)殖場(chǎng)和水產(chǎn)品流通市場(chǎng)，包括20份蝦、15份蟹、15份海水、15份蟶子、15份鮑魚、10份海魚、15份蛤蜊、10份泥螺、10份花蛤、10份海虹、20份海瓜子、10份象拔蚌等水產(chǎn)品。

細(xì)菌培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基BPW 均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司；ABI 7500 Real-time PCR儀 美國(guó)ABI公司；PRO 200型精密勻漿器 美國(guó)PRO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物、探針設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的VA Collagenase基因序列（DQ097161.1）中的保守序列，利用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物和TaqMan探針各一對(duì)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

引物序列：F：GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGA CAC

R：ACCCACACGCTCCATTGC

探針序列：Fam-TCTCTGCAAACTCAGACGCAA GCGTAGG-TAMRA

1.2.2 DNA模板的制備 1.1節(jié)中的菌株分別接種到5 mL增菌培養(yǎng)基BPW中，增菌培養(yǎng)12 h后，取1 mL菌液按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。臨床樣品的檢測(cè)采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。

1.2.3 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系25 μL：rTaq酶（5 U/μL）用量范圍0.25～1.00 μL，以0.25 μL遞增；Mg2+（25 mmol/μL）用量范圍2.00～5.00 μL，以每0.50 μL遞增；dNTP（2.5 mmol/μL）用量范圍1.00～3.00 μL，以0.50 μL遞增；探針（20 μmol/μL）用量范圍0.10～0.50 μL，以每0.10 μL遞增；引物（10 pmol/μL）的用量范圍0.50～1.00 μL，以0.10 μL遞增。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60℃退火20 s（此步驟收集熒光信號(hào)），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號(hào)，每次實(shí)驗(yàn)均包括陰性對(duì)照。

1.2.4 熒光定量PCR特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 采用試劑盒法對(duì)1.1節(jié)中的菌株進(jìn)行基因組DNA的提取，利用建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法的特異性。

1.2.5 熒光定量PCR靈敏性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 提取VA基因組DNA并測(cè)定濃度，10倍倍比稀釋DNA，原液至10-1～10-7，每個(gè)濃度梯度設(shè)4個(gè)平行，根據(jù)試劑盒提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA，各取2.00 μL作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取3個(gè)不同濃度的樣品作為模板進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，重復(fù)4次。收集數(shù)據(jù)，計(jì)算組內(nèi)、組間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.2.7 熒光定量PCR檢測(cè)方法的初步應(yīng)用 將采集來的165份水產(chǎn)品經(jīng)過勻漿器處理勻漿后，均用營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，增菌液煮沸法提取DNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，所得檢測(cè)結(jié)果用行標(biāo)法（SN/T 2564-2010）進(jìn)行復(fù)檢，以驗(yàn)證所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立

通過對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中各項(xiàng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了VA最佳實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)模式。在25 μL反應(yīng)體系中含有：rTaq酶（5 U/μL）0.50 μL，Mg2+（25 mmol/μL）2.50 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）2.00 μL，探針（20 μmol/μL）0.30 μL，上、下游引物濃度（10 pm/μL）1.00 μL，DNA模板2.00 μL，去離子水補(bǔ)充至25 μL。利用建立的方法對(duì)VA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，獲得了最低的Ct值和較高的熒光強(qiáng)度增加值，表明所建立的檢測(cè)方法能夠應(yīng)用于對(duì)VA的檢測(cè)。

圖1 VA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立Fig.1 Development of a dual real-time PCR reaction system

2.2 特異性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

利用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)1.1節(jié)中的菌株進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：VA標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增后出現(xiàn)了典型的擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；而其他菌株和空白對(duì)照則出現(xiàn)平直的線或者是不規(guī)則曲線，判定為陰性（如圖2）。

圖2 VA實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性結(jié)果Fig.2 Specificity of a dual real-time PCR reaction system

2.3 靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA，按2.1優(yōu)化出的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明在25 μL反應(yīng)體系中，模板DNA加入2 μL，菌體濃度自1.80×107cfu/mL至1.80×101cfu/mL均可出現(xiàn)規(guī)則的、典型的擴(kuò)增曲線，菌體濃度為1.80×100未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖3），表明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)VA靈敏度為18 cfu/mL。

2.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

選取1.80×106、1.80×104、1.80×102cfu/mL 3個(gè)濃度的陽(yáng)性模板進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出組內(nèi)和組間Ct值的變異系數(shù)分別為0.32%～1.24%、0.29%～0.85%（表1），均小于2%，表明該方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table1 The stability and reproducibility test of real-time PCR

圖3 VA實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)靈敏度Fig.3 Sensitivity of a dual real-time PCR reaction system

2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)臨床樣品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用建立的VA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)165份樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出2份VA陽(yáng)性樣本，所得檢測(cè)結(jié)果經(jīng)行標(biāo)法［13］進(jìn)行復(fù)檢，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致率為100%，顯示該方法具有很好的應(yīng)用性。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)檢測(cè)靶基因的選擇，膠原蛋白酶（Collagenase）是一種胞外酶，可能對(duì)VA的毒力有影響，經(jīng)毒力評(píng)價(jià)后的VA利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)Collagenase基因的表達(dá)量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示其表達(dá)量與毒力大小具有相關(guān)性［14］。因此本研究選擇VA的Collagenase基因?yàn)榘谢颍⒘薞A實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法，確立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的最佳反應(yīng)條件。利用建立的檢測(cè)方法對(duì)15種不同菌株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果只有VA菌株出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性；而其他菌株未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，為陰性；說明本研究所建立的檢測(cè)方法具有很好的特異性。10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級(jí)稀釋度細(xì)菌DNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，原始菌液稀釋至10-6時(shí)仍能檢出，說明本方法具有很高的靈敏度。組內(nèi)和組間Ct值的變異系數(shù)分別為0.32%～1.24%、0.29%～0.85%，均小于2%，表明該方法具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；對(duì)165份臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，檢出2份VA陽(yáng)性樣本，所得檢測(cè)結(jié)果經(jīng)行標(biāo)法［13］進(jìn)行復(fù)檢，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致率為100%。

綜上所述，本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法為VA快速精準(zhǔn)的檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)手段，適合在檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)、食品安全監(jiān)管及食品加工等部門推廣應(yīng)用。

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Development of a dual real-time PCR for the rapid detection of Vibrio alginolyticus

LI Dan-dan1，XU Yi-gang2，*，LI Meng-yuan3，WANG Yu4，QIU Suo-ping3，GAO Hui-jiang5，GAO Shen-yang6
（1.Technical Center of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Haikou 570311，China；2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150001，China；3.Conghua Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guongzhou 510900，China；4.Technical Center of Chongqing Entry-exit Inspection and Quarantine Bure，Chongqing 404100，China；5.Laboratory of Bovine Genetics and Breeding，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；6.Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

To establish a rapid assay for Vibrio alginolyticus（VA）detection，a dual real-time PCR method was developed targeting Collagenase gene of VA.The results showed that the test for 15 bacteria strains of the dual real-time PCR method，only VA test was positive，indicating that the method had high specificity.In addition，the sensitivity of a dual real-time PCR was 18 cfu/mL.Stability and reproducibility of the test results showed that the coefficient of variation of the same sample repeat the test four times Ct values were less than 2%.Furthermore，a total 2 positive samples for VA were detected from 165 clinical samples by the real-time method，which was in accordance with the testing result by SN/T 2564-2010 standard detection protocol.Therefore，the real-time method provides a novel rapid and sensitive detection method for VA infection.

VA；Collagenase gene；real-time PCR

TS207.4

A

1002-0306（2016）08-0069-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.005

2015－09－14

李丹丹（1979-），女，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，研究方向：微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：108074182@qq.com。

*通訊作者：徐義剛（1978-），男，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：esta123@126.com。

海南省社會(huì)發(fā)展科技專項(xiàng)（2015SF29）；國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013IK031，2013IK051，2015IK089）；重慶市科技計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014yykfA80017）；海南省應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目（ZDXM20130025）；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011GDK44，2013GDK04）。