真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇自由基和保護(hù)酶的影響

李順峰，李 靜，王安建，田廣瑞，王夢娟（河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州450002）

真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇自由基和保護(hù)酶的影響

李順峰，李 靜，王安建，田廣瑞，王夢娟
（河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南鄭州450002）

為延緩鮮切雙孢蘑菇的衰老進(jìn)程，延長保鮮期，研究了不同真空度（0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa）下充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇貯藏中的超氧陰離子產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性和抗壞血酸（AsA）含量的影響。結(jié)果表明，在較低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮熱處理可顯著（p＜0.05）提高SOD和CAT活性，降低了鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率，減少了H2O2的積累；高真空度（-98 kPa）充氮熱處理可顯著提高鮮切雙孢蘑菇AsA含量；真空充氮熱處理可抑制鮮切雙孢蘑菇貯藏中APX活性的升高。

鮮切雙孢蘑菇，真空充氮，熱處理，自由基，保護(hù)酶

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）肉質(zhì)肥厚，營養(yǎng)豐富，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等，脂肪含量低，其營養(yǎng)價值是水果和蔬菜的4～12倍。此外，雙孢蘑菇還有一定的藥用價值，中醫(yī)認(rèn)為其味甘性平，有提神、消食、平肝陽等作用，深受國內(nèi)外市場，尤其是國際市場的青睞［1］。雙孢蘑菇不僅是世界上商業(yè)化栽培規(guī)模最大、普及地區(qū)最廣、生產(chǎn)量最多的食用菌，也是我國食用菌栽培面積最大、出口創(chuàng)匯最多的種類。目前栽培的雙孢蘑菇主要為白色種，其新鮮子實(shí)體含水量高，在采后的貯藏運(yùn)輸及加工過程中極易發(fā)生變色、衰老劣變，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降，甚至喪失食用價值和商品價值［2］。鮮切雙孢蘑菇由于對蘑菇進(jìn)行了切割處理，破壞了組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，更容易發(fā)生褐變、衰老，貨架期也更短，因此，鮮切雙孢蘑菇研究的關(guān)鍵是找到切實(shí)有效、可行的延緩褐變、衰老的措施。

新鮮果蔬經(jīng)切割后，誘導(dǎo)組織產(chǎn)生超氧陰離子、過氧化氫（H2O2）等，均可破壞植物組織中正常的活性氧代謝平衡。但是，鮮切處理同時誘導(dǎo)果蔬啟動抗氧化系統(tǒng)而主動防御［3］。已有研究表明，熱處理可以通過提高果蔬活性氧清除酶活性而延緩果蔬的衰老，進(jìn)而延長果蔬的保鮮期［4-6］。真空處理也可通過延緩果蔬的成熟與衰老，達(dá)到延長保鮮期的目的［7-9］。真空充氮熱處理將二者有機(jī)結(jié)合，先通過抽真空形成低氧環(huán)境，降低組織中的含氧量，然后充入氮?dú)庖云瞥婵眨瑫r用熱水強(qiáng)行快速對雙孢蘑菇進(jìn)行熱處理，從而去除細(xì)胞間隙的氣體和抑制酶活，達(dá)到抑制褐變、延長保鮮期的目的［10-11］。鑒于此，本研究以鮮切雙孢蘑菇為研究對象，采用自行開發(fā)的真空充氮熱處理專利設(shè)備對鮮切雙孢蘑菇在不同真空度下進(jìn)行充氮熱處理，研究不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇自由基和保護(hù)酶活性的影響，探討真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇組織衰老與保護(hù)酶的影響，為其在延長鮮切雙孢蘑菇保鮮期的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雙孢蘑菇 采自洛陽奧達(dá)特食用菌技術(shù)開發(fā)有限公司，采收后分層放入貯運(yùn)保鮮箱預(yù)冷20 h后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷藏，選取大小、成熟度一致、顏色潔白、無開傘、無病蟲害和機(jī)械損傷的雙孢蘑菇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、抗壞血酸、三氯乙酸、核黃素、蛋氨酸、牛血清白蛋白等 均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水 均為蒸餾水。

FA2004C分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì) 島津儀器（蘇州）有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器 上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；控制型試管研磨機(jī) 德國IKA集團(tuán)；真空充氮熱處理設(shè)備 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自制專利設(shè)備（專利號：ZL201120445515.4）；Revco ExF24086V超低溫冰箱 美國Thermo公司；LHS-250HC-II恒溫恒濕箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 將新鮮雙孢蘑菇去除菇柄，然后將其縱切為厚度5 mm的菇片，取100 g菇片分別在0、-20、-40、-60、-80、-98 kPa下進(jìn)行脫氧處理，并在達(dá)到相應(yīng)真空度下保持2 min，之后充入氮?dú)馐蛊浠謴?fù)至常壓，然后再重復(fù)上述操作2次，最后在40℃水中處理5 min后取出，冷卻瀝干表面水分，放入托盤用聚乙烯（PE）保鮮膜（氧氣透過率18500%±40%cm3/m2· 24 h·atm，二氧化碳透過率134500%±40%cm3/m2·24 h· atm，透濕量33±40%g/m2·24 h）包裹后在4℃、RH85%的恒溫恒濕箱中進(jìn)行貯藏，每個處理重復(fù)3次，每2 d取樣1次，將樣品用液氮冷凍并粉碎后置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 超氧陰離子產(chǎn)生速率測定 超氧陰離子產(chǎn)生速率參照Li等［12］和Liu等［13］的方法測定。

1.2.3 過氧化氫含量測定 過氧化氫含量測定參照Zheng等［14］方法測定。

1.2.4 超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定 SOD和CAT活性測定參照Xu等［15］和Liu等［13］的方法測定，酶液蛋白質(zhì)含量參照Bradford［16］方法測定（以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，y= 8.4657x+0.0460，R2=0.9908）。SOD酶活為將NBT的光還原反應(yīng)抑制到對照的一半（50%）時所需的酶量為一個酶活力單位，SOD活性表示為U·mg-1蛋白·min-1。以1 min內(nèi)A240降低0.1為1個酶活力單位（U），CAT活性表示為U·mg-1蛋白質(zhì)。

1.2.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定 APX活性測定參照Khan等［17］和Jiang等［18］方法并略作修改。稱取1.00 g鮮切雙孢蘑菇粉，加入10 mL酶提取液（酶提取液用pH7.0的100 mmol/L磷酸緩沖液配制，內(nèi)含1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），2%交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），現(xiàn)用現(xiàn)配），冰浴中充分研磨，離心（10000 r/min，2℃）15 min，上清液即為酶液。取0.2 mL酶液與3 mL反應(yīng)液（反應(yīng)液為0.05 mol/L pH7.0磷酸緩沖液，內(nèi)含0.5 mmol/L的抗壞血酸和0.1 mmol/L的EDTA，現(xiàn)用現(xiàn)配）混合，再加入1 mL 0.3 mmol/L的H2O2啟動反應(yīng)，以蒸餾水為空白，測定290 nm處吸光度的變化，每30 s記錄1次，記錄5 min。以每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸的酶量為一個酶活力單位（U），APX活性表示為U·mg-1蛋白。酶液蛋白質(zhì)含量參照Bradford［16］方法測定。

1.2.6 抗壞血酸含量測定 抗壞血酸含量參照Kampfenkel等［19］的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)平行3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±SE表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA分析（顯著性水平p＜0.05），采用Origin 9.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

圖1 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響Fig.1 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on superoxide anion production rate in fresh-cut Agaricus bisporus

由圖1可知，鮮切雙孢蘑菇在12 d的貯藏期內(nèi)，各組超氧陰離子的產(chǎn)生速率均呈逐漸增加的趨勢。同樣，Liu等［20］研究結(jié)果也表明，在2℃條件下，對照組和處理組雙孢蘑菇超氧陰離子的產(chǎn)生速率在貯藏前3 d顯著增加，直到貯藏結(jié)束12 d時都保持較高超氧陰離子產(chǎn)生速率，并且對照組超氧陰離子產(chǎn)生速率顯著高于處理組。在本研究中，對照組（0 kPa）鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子的產(chǎn)生速率在前8 d增加了38.64%，之后超氧陰離子的產(chǎn)生速率快速增加，第12 d時達(dá)到最高（2.93 nmol·mg-1protein·min-1）；-40 kPa處理組在貯藏的前8 d，超氧陰離子的產(chǎn)生速率僅增加了約20.66%，顯著（p＜0.05）低于對照組。

同時，如圖1所示，較低的真空度（-20～-60 kPa）充氮熱處理可以抑制鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率，相反，較高真空度（-80 kPa和-98 kPa）處理則提高了超氧陰離子產(chǎn)生速率。這可能是由于較高真空度嚴(yán)重破壞了細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其超氧陰離子的生產(chǎn)速率增高。結(jié)果表明，采用-20～-60 kPa的真空度進(jìn)行充氮熱處理可以降低鮮切雙孢蘑菇貯藏中超氧陰離子的產(chǎn)生速率。

2.2 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇過氧化氫含量的影響

不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇貯藏期間的過氧化氫（H2O2）含量的影響如圖2所示。在貯藏期間，各組的H2O2含量均呈逐漸增加的趨勢。貯藏12 d時，對照組、-20、-40、-60、-80、-98 kPa處理組的H2O2含量分別增加了160.29%、93.22%、54.60%、104.59%、133.62%、171.27%。在-60～-98 kPa條件下，隨著真空度的升高，鮮切雙孢蘑菇產(chǎn)生了更多的H2O2，這可能與細(xì)胞膜的破壞、超氧陰離子的產(chǎn)生及自由基清除體系如過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等有關(guān)。而在較低真空度條件下，如-40 kPa處理后，鮮切雙孢蘑菇產(chǎn)生的H2O2含量最少且總體保持平穩(wěn)，這可能是由于在該真空度條件下可以增強(qiáng)自由基清除能力，從而抑制了H2O2的產(chǎn)生或清除了H2O2。

圖2 不同真空度充氮熱處理處理對鮮切雙孢蘑菇過氧化氫含量的影響Fig.2 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on hydrogen peroxide content in fresh-cut Agaricus bisporus

2.3 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD、CAT活性影響

SOD可以通過歧化反應(yīng)清除體內(nèi)過多的超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為毒性較低的H2O2和O2，H2O2再經(jīng)由CAT催化生成沒有毒性的H2O和O2，從而能減少自由基對細(xì)胞的傷害［20］，并進(jìn)一步延緩衰老進(jìn)程的發(fā)生。不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD和CAT活性的影響見圖3。圖3A顯示，較高真空度（-80 kPa 和-98 kPa）充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇SOD活性呈先升高后降低的趨勢，相反的，較低真空度（-20～-60 kPa）充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇的SOD活性呈升-降-升的趨勢。貯藏第2 d時，-20、-40和-60 kPa處理組的SOD活性分別為對照組的0.80、1.26、1.05倍；在貯藏12 d時，-40 kPa組的SOD活性最高（0.38 μmol·g-1FW），分別比-20 kPa和-60 kPa處理組高出35.71%和8.57%?？梢?，-40 kPa真空度充氮熱處理鮮切雙孢蘑菇可以較好地保持SOD的活性。

不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇CAT活性的影響如圖3B所示。與對照組（0 kPa）相比，真空充氮熱處理均可提高鮮切雙孢蘑菇的CAT活性，且-40 kPa處理組的CAT活性在整個貯藏期一直保持最高。結(jié)合圖2中H2O2的含量變化可知，-40 kPa處理組的H2O2的含量上升較慢，這與CAT活性呈逐漸上升之勢有關(guān)，而其余各組的CAT活性較低，導(dǎo)致H2O2含量快速上升。以上結(jié)果說明，適宜的真空充氮熱處理可以延緩鮮切雙孢蘑菇衰老的進(jìn)程。

圖3 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇SOD（A）和CAT（B）活性的影響Fig.3 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on SOD（A）and CAT（B）activity in fresh-cut Agaricus bisporus

2.4 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇抗壞血酸和APX活性的影響

由圖4A可知，在0～6 d的貯藏期間，真空充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇抗壞血酸（AsA）含量的影響不大，在6～12 d時，除了-20 kPa處理組的AsA含量有所降低之外，其余各處理組的AsA含量均有所增加。對照組（0 kPa）AsA含量在貯藏6～12 d增加了15.15%，-40、-60、-80和-98 kPa處理組分別增加了11.82%、33.48%、67.03%和58.47%。這可能是由于真空充氮熱處理誘導(dǎo)了組織細(xì)胞中AsA的合成，導(dǎo)致在貯藏過程中其含量的增加。Vi?a等［21］通過研究鮮切芹菜在不同的貯藏溫度下AsA的變化，發(fā)現(xiàn)鮮切處理使芹菜在后期貯藏中AsA含量有所增加。這主要是由于切割處理刺激了具有防御作用的AsA的產(chǎn)生或合成。而且，高真空度充氮熱處理能顯著增加鮮切雙孢蘑菇中AsA的含量。

各處理組鮮切雙孢蘑菇APX活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢（圖4B）。然而，與對照組（0 kPa）相比，采用真空充氮熱處理降低了鮮切雙孢蘑菇中APX的活性。對照組的APX在第10 d達(dá)到最高值（57.49 U·mg-1protein），顯著（p＜0.05）高于其他處理組。而經(jīng)-40 kPa處理組的APX活性在整個貯藏期無顯著變化，總體處于較低水平，表明-40 kPa真空充氮熱處理抑制了APX活性。綜合圖4A和圖4B可以看出，APX活性與AsA含量呈基本對應(yīng)趨勢。

圖4 不同真空度充氮熱處理對鮮切雙孢蘑菇AsA（A）和APX活性（B）的影響Fig.4 Effect of filling nitrogen in different vacuum pressure combined with heat treatment on AsA content（A）and APX activity（B）in fresh-cut Agaricus bisporus

3 結(jié)論

3.1 較低真空度（-20～-60 kPa），尤其是-40 kPa充氮熱處理可顯著提高SOD和CAT活性，降低鮮切雙孢蘑菇超氧陰離子產(chǎn)生速率，并減少過氧化氫的積累。

3.2 真空充氮熱處理可抑制鮮切雙孢蘑菇貯藏中APX活性的升高，高真空度（-98 kPa）充氮熱處理可顯著提高鮮切雙孢蘑菇AsA含量。

3.3 適宜的真空（-20～-60 kPa）充氮熱處理可有效抑制鮮切雙孢蘑菇自由基的產(chǎn)生，提高抗氧化酶的活性，延緩衰老進(jìn)程。

［1］王麗芳，王曉拓，王志東.貯藏溫度對雙孢蘑菇褐變和抗氧化活性的影響及動力學(xué)研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2015，31（2）：157-163.

［2］Qin Y，Liu D，Wu Y，et al.Effect of PLA/PCL/cinnamaldehyde antimicrobial packaging on physicochemical and microbial quality of button mushroom（Agaricus bisporus）［J］.Postharvest Biology and Technology，2015，99：73-79.

［3］馬杰，胡文忠，畢陽，等.鮮切果蔬活性氧產(chǎn)生和抗氧化體系代謝的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2013，24（7）：316-320.

［4］孔祥佳，鄭俊峰，林河通，等.熱處理對果蔬貯藏品質(zhì)和采后生理的影響及應(yīng)用［J］.包裝與食品機(jī)械，2011，29（3）：34-39.

［5］李健，徐艷聰，李麗萍，等.熱處理對鮮切胡蘿卜生理及品質(zhì)的影響［J］.食品科技，2014，39（10）：90-95.

［6］李素清，秦文，王佳梅，等.貯藏溫度對熱處理楠竹筍保鮮效果的影響［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，32（4）：413-417.

［7］李文香，張慜，余漢清.不同真空處理對水蜜桃貯藏效果的研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25（3）：58-62.

［8］張振宇，唐政淵，胡振海，等.楊梅真空保鮮冷藏技術(shù)實(shí)驗(yàn)［J］.農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2014（2）：27-28，31.

［9］闞苗，白連社，魏邦福，等.真空減壓技術(shù)對果蔬貯藏保鮮效果的影響［J］.電器，2013（s）：82-86.

［10］王安建，劉麗娜，魏書信，等.真空充氮對雙孢菇細(xì)胞膜及燙漂后顏色的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（3）：131-134.

［11］王安建，田廣瑞，魏書信，等.一種果蔬脫氧充氮燙漂設(shè)備：中國，201120445515.4［P］.2012-07-25.

［12］Li S，Zhang L，Liu X.Effects of mouldy core and core rot on physiological and biochemical responses of apple fruit［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91（14）：2674-2678.

［13］Liu J，Wu Y-c，Kan J，et al.Changes in reactive oxygen species production and antioxidant enzyme activity of Agaricus bisporus harvested at different stages of maturity［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2013，93（9）：2201-2206.

［14］Zheng X，Tian S，Meng X，et al.Physiological and biochemical responses in peach fruit to oxalic acid treatment during storage at room temperature［J］.Food Chemistry，2007，104（1）：156-162.

［15］Xu W-T，Peng X-l，Luo Y-B，et al.Physiological and biochemical responses of grapefruit seed extract dip on ‘Redglobe'grape［J］.LWT-Food Science and Technology，2009，42（2）：471-476.

［16］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72（1-2）：248-254.

［17］Khan Z U，Aisikaer G，Khan R U，et al.Effects of composite chemical pretreatment on maintaining quality in button mushrooms （Agaricus bisporus）during postharvest storage［J］.Postharvest Biology and Technology，2014，95：36-41.

［18］Jiang T，Zheng X，Li J，et al.Integrated application of nitric oxide and modified atmosphere packaging to improve quality retention of button mushroom（Agaricus bisporus）［J］.Food Chemistry，2011，126（4）：1693-1699.

［19］Kampfenkel K，Vanmontagu M，Inze D.Extraction and Determination of Ascorbate and Dehydroascorbate from PlantTissue［J］.Analytical Biochemistry，1995，225（1）：165-167.

［20］Liu Z，Wang X.Changes in color，antioxidant，and free radical scavenging enzyme activity of mushrooms under high oxygen modified atmospheres［J］.Postharvest Biology and Technology， 2012，69：1-6.

［21］Vi?a S Z，Chaves A R.Antioxidant responses in minimally processed celery during refrigerated storage［J］.Food Chemistry，2006，94（1）：68-74.

Effects of filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment on free radical and protective enzymes of fresh-cut Agaricus bisporus

LI Shun-feng，LI Jing，WANG An-jian，TIAN Guang-rui，WANG Meng-juan
（Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

In order to delay senescence and prolong the shelf-life of fresh-cut Agaricus bisporus，the effects of filling nitrogen in different vacuum（0，-20，-40，-60，-80，-98 kPa）combined with heat treatment on superoxide anion production，hydrogen peroxide（H2O2）content，enzyme activities of superoxide dismutase（SOD），catalase （CAT）and ascorbate peroxidase（APX），and ascorbic acid（AsA）content of fresh-cut Agaricus bisporus under cold storage were evaluated.Results showed that lower vacuum（-20～-60 kPa），especially-40 kPa filling nitrogen in vacuum with heat treatment significantly（p＜0.05）decreased superoxide anion production and H2O2accumulation，and increased activities of SOD and CAT of fresh-cut Agaricus bisporus.Higher vacuum （-98 kPa）treatment enhanced AsA content remarkably.Filling nitrogen in vacuum combined with heat treatment obviously inhibited APX activity of fresh-cut Agaricus bisporus.

fresh-cut Agaricus bisporus；filling nitrogen in vacuum；heat treatment；free radical；protective enzyme

TS255.3

A

1002-0306（2016）02-0326-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.057

2015-05-11

李順峰（1982-），男，博士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工、天然活性成分提取分離方面的研究，E-mail：lishunfeng2000@163.com。

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31301588）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2013ZZ43）。