毛葡萄穗軸潰瘍病病原鑒定及防治藥劑初步篩選

吳代東,　付　崗,　葉云峰,　胡鳳云,蘇祖祥,　覃柳燕,　牟海飛

(1. 廣西農業(yè)科學院生物技術研究所,南寧　530007; 2. 廣西農業(yè)科學院微生物研究所,南寧　530007;3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園,南寧　530023)

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毛葡萄穗軸潰瘍病病原鑒定及防治藥劑初步篩選

吳代東1,付崗2*,葉云峰3*,胡鳳云3,蘇祖祥1,覃柳燕1,牟海飛1

(1. 廣西農業(yè)科學院生物技術研究所,南寧530007; 2. 廣西農業(yè)科學院微生物研究所,南寧530007;3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園,南寧530023)

毛葡萄穗軸潰瘍病主要危害果穗穗軸,引起果穗枯死和果實大量脫落,造成果實產量降低。本研究對該病的病原菌進行分離、致病性測定,并通過形態(tài)學特征、ITS rDNA和EF-1α基因序列分析將該病的主要病原鑒定為小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)。通過抑制菌絲生長法在室內初步篩選防治該病的藥劑,試驗結果表明,在測試的26種藥劑中,30%氟硅唑微乳劑、64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑、70%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑、22.2%抑霉唑乳油、70%丙森鋅可濕性粉劑及60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑等7種藥劑對該病病原的抑制作用較強,抑菌率均達100%,可作為備選藥劑進行田間防治試驗。

毛葡萄;穗軸潰瘍病;小新殼梭孢菌;病原鑒定;藥劑篩選

毛葡萄(VitisheyneanaRoemeretSchult)為葡萄科葡萄屬東亞種群,多年生藤本植物。主要分布在長江以南各省,耐干旱、瘠薄,以野生狀態(tài)自然生長在丘陵、石山、灌木叢和森林邊緣地帶。由于富含營養(yǎng)、保健及抗衰老物質,被作為釀制特色風味果酒的原料[1]。廣西羅城仫佬族自治縣是中國野生毛葡萄之鄉(xiāng),有超過5 000 hm2的自然生長區(qū)域[2]。近年來,隨著毛葡萄釀酒產業(yè)在廣西的迅速發(fā)展,對毛葡萄鮮果的需求量不斷增加,從而提高了人工種植毛葡萄的積極性。目前,羅城縣11個鄉(xiāng)鎮(zhèn)全部建立有野生毛葡萄基地,種植總面積達4 467 hm2。隨著毛葡萄人工種植面積的增加,發(fā)生的病蟲害種類也日益增多。其中,穗軸潰瘍病是近年毛葡萄種植區(qū)發(fā)生的一種嚴重影響果實產量的病害,主要發(fā)生在結果期至成熟期,引起果穗褐變枯死,造成果實在收獲前大量脫落。作者前期初步調查發(fā)現(xiàn),嚴重地塊果穗發(fā)病率達 80%以上,常造成減產50%～80%。目前尚無關于該病害病原分類、發(fā)生規(guī)律及防治技術方面的研究報道,因此,該病害成為制約毛葡萄產業(yè)發(fā)展的重要因素。作者于2012—2014年對廣西羅城縣的毛葡萄穗軸潰瘍病病樣進行了采集、病原菌分離鑒定及室內防治藥劑篩選試驗,以便為該病害的有效防治提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試毛葡萄樣品

病原菌分離使用的毛葡萄果穗穗軸病樣5份和致病性測定使用的健康毛葡萄果穗樣品均采自廣西壯族自治區(qū)羅城仫佬族自治縣四把鎮(zhèn)水源毛葡萄基地。

1.1.2供試藥劑

26種供試藥劑分別為:1.8%辛菌胺乙酸鹽水溶劑(廣西安嘉科技農化有限公司);15%咪鮮胺微乳劑、250 g/L丙環(huán)唑乳油、30%氟硅唑微乳劑(海南博士威農用化學有限公司);10%苯嘧菌酯懸浮劑(浙江禾田化工有限公司);250 g/L吡唑嘧菌酯乳油、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑(德國巴斯夫公司);10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(安徽績溪農華生物科技有限公司);30%嘧菌酯可濕性粉劑(美豐農化有限公司); 70%代森錳鋅可濕性粉劑(四川國光農化股份有限公司)、70%丙森鋅可濕性粉劑、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑(拜耳作物科學公司);24%腈苯唑懸浮劑、36%硝苯菌酯乳油(美國陶氏益農公司)、70%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑(北京燕化永樂農藥有限公司);22.2%抑霉唑乳油(美國仙農有限公司);45%克菌·戊唑醇懸浮劑、53%苯甲·戊唑醇乳油、50%嘧菌酯·百菌清懸浮劑(南京金金利生物科技公司);30%苯甲·丙環(huán)唑乳油(先正達(中國)投資有限公司);25%氟嗎·唑菌酯懸浮劑(沈陽科創(chuàng)化學品有限公司);45%甲霜·噁霉靈可濕性粉劑(黑龍江省哈爾濱市農歡化工廠);64%噁霜靈·錳鋅可濕性粉劑(天津科潤北方種衣劑有限公司);65%多抗·陽光霉素可濕性粉劑(江蘇金益農生物科技有限公司);12%春雷霉素可濕性粉劑(河北上瑞化工有限公司);3%多抗霉素可濕性粉劑(山東省禹城市農藥廠)。

1.2病害癥狀觀察

2012年6月—2013年9月對羅城縣毛葡萄基地的毛葡萄穗軸潰瘍病癥狀及發(fā)生擴展情況進行了觀察、記錄和拍攝。

1.3病原菌分離和鑒定

1.3.1病原菌的分離純化

選取毛葡萄果穗穗軸上病健交界處組織,切成0.3 cm小段,用75%乙醇浸泡30 s,0.1%升汞消毒40 s,再用無菌水漂洗3次,置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板上,在28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),待長出菌絲后,挑取菌落邊緣進行純化,純化后的菌落通過單孢分離獲得單孢系純培養(yǎng)分離物。

1.3.2分離物的致病性測定

從田間剪取健康幼嫩的毛葡萄果穗,用無菌水沖洗干凈。將純培養(yǎng)的分離物菌絲塊通過針刺接種法接種到離體的毛葡萄果穗穗軸上,置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內保濕培養(yǎng),以針刺傷口處放PDA培養(yǎng)基塊的穗軸為對照,定期觀察各組織的發(fā)病情況,發(fā)病后再對病斑進行病原菌分離,通過柯赫氏法則驗證病原菌。

1.3.3病原菌形態(tài)學鑒定

將病原菌(經驗證具有致病性的分離物)接種到PDA平板上,置于28℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng),觀察菌落特征。另外,將病原菌接種到添加無菌松針(馬尾松)的水瓊脂培養(yǎng)基上[3],28℃黑暗培養(yǎng)25 d,顯微觀察分生孢子的形態(tài)特征,對病原菌進行形態(tài)學鑒定。

1.3.4分子生物學鑒定

病原菌基因組DNA提取采用CTAB法[6]。以真菌核糖體rDNA區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌的rDNA-ITS序列進行PCR擴增;同時,參照文獻[4]合成引物EF1-728F (5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)和EF1-986R (5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′) 對病原菌的翻譯延伸因子EF-1α基因序列進行PCR擴增。反應均在25 μL體系中進行,體系含有10×Ex buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,10 μmol/L正反向引物各0.5 μL,基因組 DNA 100 ng,5 U/μL ExTaq0.5 μL;ddH2O 補足至25 μL。反應程序為:95℃預變性5 min,進入循環(huán),95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃復性80 s,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳回收目標DNA片段,由上海鼎安生物科技有限公司進行測序,測序結果用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.4室內藥劑篩選

在PDA平板上培養(yǎng)7 d的菌落外緣,用打孔器打取直徑5 mm的菌餅轉接到含不同殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中,藥劑濃度按說明書推薦的使用濃度。以不含農藥的PDA平板為對照,菌絲面朝下置于平板中央,每平板接種一塊菌絲塊,每處理重復3次。培養(yǎng)7 d后(對照菌絲長滿皿)測量菌落直徑,計算平均抑菌率。

2　結果與分析

2.1病害癥狀

該病害主要危害毛葡萄果穗穗軸,在穗軸基部先出現(xiàn)褐色水漬狀斑,病斑環(huán)繞果穗發(fā)展,并向頂部穗軸擴展,嚴重時可擴展到整個穗軸,造成果穗褐變干枯死亡,隨后果實大量脫落,脫落的果實大多數(shù)健康,少數(shù)從果蒂腐爛,有時果實不脫落,逐漸干縮。空氣濕度大時,果穗褐變腐爛。該病害從毛葡萄結果初期到成熟期(6—9月)均可發(fā)生,高溫多雨時期發(fā)病較重,枝繁葉密、通風不良的地塊發(fā)病也較重,著色中期至成熟采收期蔓延速度快。

2.2病原菌分離和鑒定

2.2.1病原菌分離和致病性測定

對毛葡萄果穗穗軸5個病害標樣進行病原分離,分離純化得到形態(tài)特征一致的菌株12株。通過針刺接種法將這些菌株的菌絲塊(平均直徑3 mm)接種到健康的毛葡萄果穗上,接種后第3天,接種部位均出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀,接種后第5天,病癥擴展到整個果穗,致果穗全部褐變死亡(圖1b)。接種發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病癥狀(圖1a)相似。對照的果穗未發(fā)病(圖1c)。

圖1　毛葡萄穗軸潰瘍病自然發(fā)病及接種發(fā)病癥狀Fig.1　Natural symptoms and inoculation symptoms of panicle canker on Vitis heyneana

2.2.2病原菌形態(tài)學鑒定

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長迅速,氣生菌絲發(fā)達,菌落高度可以達到并緊貼培養(yǎng)皿上蓋。初期基質菌絲和氣生菌絲均為白色(圖2a), 4 d 后氣生菌絲變?yōu)榛液谏?基質菌絲變?yōu)楹谏Ｔ谔砑訜o菌松針(馬尾松)的水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d 后,在松針上形成黑色的分生孢子器,分生孢子器近球形,直徑為350.0～500.0 μm。分生孢子單胞,橢圓形至紡錘形,薄壁半透明,大小為(12.0～17.5)μm×(4.0～6.0)μm(圖2b)。這些病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與已報道[3,5]的葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)中的一種無性型菌物即小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)相似。

圖2　毛葡萄穗軸潰瘍病病原菌形態(tài)Fig.2　Morphology of the pathogen of panicle canker

2.2.3分子生物學鑒定

分別以ITS1、ITS4和EF1-728F、EF1-986R為引物對病原菌的rDNA-ITS基因和EF-1α基因序列進行PCR擴增,并對擴增產物進行測序。結果獲得571 bp的rDNA-ITS基因序列(GenBank登錄號:KJ599627)和293 bp的EF-1α基因序列(GenBank登錄號:KM921768),將兩種序列分別與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行BLAST比對,rDNA-ITS基因和EF-1α基因序列均與多個小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)的序列同源性最高,相似性分別為100%和99%。

結合病原菌的形態(tài)特征、rDNA-ITS及EF-1α基因序列分析結果,將病原菌鑒定為小新殼梭孢菌(N.parvum)。

2.3室內防治藥劑篩選

室內藥劑篩選試驗結果見表1,在測試的26種藥劑中,30%氟硅唑微乳劑7 000倍液、64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑600倍液、70%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑4 000倍液、70%代森錳鋅可濕性粉劑600倍液、22.2%抑霉唑乳油800倍液、70%丙森鋅可濕性粉劑600倍液及60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑1 000倍液對病原菌的抑制作用較強,抑菌率均達100%。另外,75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑4 000倍液、30%苯甲·丙環(huán)唑乳油2 000倍液、15%咪鮮胺微乳劑2 000倍液、65%多抗·陽光霉素可濕性粉劑1 000倍液、30%嘧菌酯可濕性粉劑3 000倍液及45%克菌·戊唑醇懸浮劑1000倍液對病原菌的抑制作用也較強,抑菌率在95.3%～98.2%之間。抑菌作用較差的藥劑是：36%硝苯菌酯乳油1 500倍液和50%嘧菌酯·百菌清懸浮劑2 000倍液,抑菌率分別為21.2%和12.9%。

表1　不同藥劑對病原菌菌絲生長的抑菌率1)Table 1　Inhibition rate of different fungicides on mycelia growth of Neofusicoccum parvum

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(SAS,P<0.05)。

Different small letters in the same column represent significant difference at 0.05 level by SAS.

3　結論與討論

本研究對引起廣西羅城縣毛葡萄果穗大量枯死的病原菌進行分離,并結合形態(tài)學特征及rDNA-ITS序列和EF-1α基因序列分析結果將病原菌鑒定為小新殼梭孢菌(N.parvum)。N.parvum是葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)中的一種無性型菌物,曾作為小葡萄座腔菌(Botryosphaeriaparva)的無性階段被報道[6]。該病原菌在鮮食葡萄上引起潰瘍病已有報道[7-8],但在用于釀酒業(yè)的毛葡萄這個較特殊的品種上引起潰瘍病尚無報道。燕繼曄等[9]報道國內鮮食葡萄潰瘍病主要由N.parvum、Botryosphaeriadothidea、Diplodiaseriata和Lasiodiplodiatheobromae等4種病原菌引起,造成葡萄穗軸干枯、爛果、落粒。4種病原菌在地理分布上有差異,其中,N.parvum和L.theobromae分布在亞熱帶季風氣候區(qū)域,B.dothidea分布于溫帶季風氣候區(qū)域和亞熱帶季風氣候區(qū)域,D.seriata主要分布于溫帶季風氣候區(qū)域的山東和河北兩省。而本研究報道的毛葡萄穗軸潰瘍病菌(N.parvum)也出現(xiàn)在亞熱帶季風氣候區(qū)域,病害癥狀與葡萄潰瘍病癥狀相似。此外,N.parvum也是林木和果樹上常見的病原真菌,常引起莖稈、枝條枯萎病或潰瘍病,也可引起葉枯病。國內外已報道的有柏木枯萎病[5],圓錐蒲桃梢枯病[10],鱷梨、亞洲梨的莖稈和枝條潰瘍病[11-12],油桐葉枯病[3]等。本研究分離到的N.parvum菌株在PDA培養(yǎng)基上不易產生無性分生孢子,參照袁志林等的方法[3],將菌株接種到含有無菌松針的水瓊脂培養(yǎng)基上,暗培養(yǎng)25 d后才能產生無性分生孢子。N.parvum與同屬的其他種類真菌在形態(tài)上極為相似,在分子鑒定方面僅靠ITS 序列分析不足以區(qū)分不同種類,結合EF-1α序列分析進行種類鑒定可使試驗結果更為可靠[13],因此,本研究結合ITS和EF-1α序列分析結果對病原菌進行分類鑒定。

在研究過程中,我們還發(fā)現(xiàn)了兩種能引起毛葡萄果穗枯死的致病力較弱的真菌,分別鑒定為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum),但這兩種菌的分離率較低。此外,史國英等[2]曾報道了主要發(fā)生在花期的毛葡萄穗軸褐腐病病原可可毛色二孢(Lasiodiplodiatheobromae)?？梢?毛葡萄穗部病害可由多種真菌引起,這些真菌存在復合侵染的可能性。因此,對毛葡萄穗部病害的病原種類和侵染規(guī)律等可進行更為深入系統(tǒng)的研究。

通過抑制菌絲生長法在室內對該病的防治藥劑進行初步篩選,獲得多種對病原菌抑制作用較強的低毒藥劑,包括30%氟硅唑微乳劑、64%噁霜靈·錳鋅可濕性粉劑、70%戊唑·丙森鋅可濕性粉劑、70%代森錳鋅可濕性粉劑、22.2%抑霉唑乳油、70%丙森鋅可濕性粉劑及60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑等,抑菌率均達100%。這些藥劑可作為備選藥劑進行田間防治試驗,以便篩選出田間防治效果較好的藥劑。

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(責任編輯：王音)

Identification of the panicle canker pathogen and screening of the fungicides

Wu Daidong1,Fu Gang2,Ye Yunfeng3,Hu Fengyun3,Su Zuxiang1,Qin Liuyan1,Mou Haifei1

(1. Biotechnology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning530007, China;2. Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning530007, China;3. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning530023, China)

Panicle canker pathogen damaged the panicle ofVitisheyneana, caused a large number of fruits drop and reduced the yield seriously. The pathogen was isolated and its pathogenicity was tested. Based on morphological characteristics, ITS rDNA and EF-1α gene sequences analysis, the pathogen was identified asNeofusicoccumparvum. Inhibitory activity analysis of 26 kinds of fungicides demonstrated that 7 kinds of fungicides including flusilazole 30% ME, oxadixyl·mancozeb 64% WP, tebuconazole· propineb 70% WP, mancozeb 70% WP, imazalil 22.2% EC, propineb 70% WP and pyraclostrobin·metiram 60% WG showed high inhibitory rates of 100% onN.parvum. Thus, these 7 kinds of fungicides can be recommended as alternative agents for field testing.

Vitisheyneana;panicle canker;Neofusicoccumparvum;identification of pathogen;screening of the fungicides

2014-11-16

2015-01-22

廣西科技成果轉化與推廣計劃項目(桂科轉14125003-1-15，桂科轉1346003-14)；國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系廣西特色水果創(chuàng)新團隊南寧葡萄綜合試驗站(nycytxgxcxtd-04-19-14)

E-mail:yeyunfeng111@126.com;fug110@gxaas.net

S 436.63

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.038