一株內生拮抗細菌的分離鑒定及其抗菌機理研究

劉　洋,　朱天輝*,　鄭　磊,　張　靜,　蘭浩洋,　郭志斌

(1. 四川農業(yè)大學林學院, 雅安　625014; 2. 四川省廣元市朝天區(qū)林業(yè)和園林局, 廣元　628000;3. 四川省廣元市林業(yè)和園林局, 廣元　628000)

?

一株內生拮抗細菌的分離鑒定及其抗菌機理研究

劉洋1,朱天輝1*,鄭磊1,張靜1,蘭浩洋2,郭志斌3

(1. 四川農業(yè)大學林學院, 雅安625014; 2. 四川省廣元市朝天區(qū)林業(yè)和園林局, 廣元628000;3. 四川省廣元市林業(yè)和園林局, 廣元628000)

本研究通過平板稀釋法、平板對峙法從核桃根部皮層篩選出一株對核桃根腐病有拮抗作用的內生菌株1A,通過形態(tài)特征測定、理化特性分析和16S rDNA 序列分析鑒定該菌為芽胞桿菌(Bacillussp.),GenBank序列登錄號為KJ865856;其抑菌特性研究結果表明:該拮抗菌對核桃根腐病菌有顯著的抑制效果,抑菌率達63.33%;此外,該菌對板栗疫病菌等幾種不同的林木病原菌均有較強的抑制作用?？股鷻C理研究結果表明,該菌株通過分泌蛋白酶和纖維素酶降解真菌細胞壁中蛋白質和纖維素,破壞病菌菌絲,病菌生長受到抑制。該拮抗菌能夠顯著抑制核桃根腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā),孢子萌發(fā)抑制率達74.89%,病菌菌絲表現(xiàn)為菌絲扭曲、斷裂,分支增多并纏繞,菌絲顏色加深等。盆栽生防效果研究顯示,該拮抗菌對各組核桃根腐病具有顯著的防治效果,采用該拮抗菌預處理具有相對較好的生防效果。

核桃根腐病;腐皮鐮刀菌;內生細菌;芽胞桿菌;抗菌機理

核桃(JuglansregiaL.) 是我國重要的“木本糧油”樹種,含有大量對人體健康有益的營養(yǎng)成分,被認為是“21世紀的超級食品”[1]。核桃根腐病是威脅核桃生產(chǎn)的重要病害之一,在核桃種植區(qū)發(fā)病率較高。相較于化學防治,生物防治對人、畜及植物安全,不污染環(huán)境,對病害有持久的控制作用,是未來病蟲害防治的發(fā)展方向[2-3]。目前,關于核桃根腐病生物防治有待進一步研究。一些植物內生菌與宿主植物發(fā)生關系時,可明顯增強植物的抗病性,促進植物的生長[4]。李桂霞等從感染灰霉病的番茄大棚土壤中分離到6株拮抗細菌,其中蠟樣芽胞桿菌B-02和枯草芽胞桿菌B-06對灰霉病菌有很強的抑制作用,將發(fā)酵液稀釋不同倍數(shù)之后仍然具有很好的抑菌作用[5]。芽胞桿菌(Bacillus)是土壤和植物微生態(tài)的優(yōu)勢菌群,可以產(chǎn)生抗逆性芽胞,可耐受各種不良環(huán)境,有效活菌數(shù)高,性能穩(wěn)定,成為理想生防菌的篩選對象而備受青睞[6-7]。本研究主要以核桃根腐病病菌(Fusariumsolani)為指示菌,篩選鑒定出對其有拮抗作用的內生細菌,探討防病作用機制及防治效果,為進一步研發(fā)對根部腐爛病害有良好防治作用的生物農藥奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試病原菌:核桃根腐病菌腐皮鐮刀菌(F.solani)、板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)、山茶灰斑病菌山茶擬盤多毛孢(Pestalotiopsisguepini)、油橄欖根腐病菌(Armillariamellea)、核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)由四川農業(yè)大學植物病理研究室分離并保存。2013年4-7月在廣元核桃根腐病發(fā)生地采集健康核桃根系,備用。3年生健康、無病害、長勢相同的鐵核桃幼苗購自四川省雅安園林花卉公司。

1.2試驗方法

1.2.1內生細菌的分離、純化與保存

取1.0 g干凈根組織,表面消毒后,無菌條件下剪碎,加無菌水和石英砂充分研磨,靜置30 min,稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5個梯度,吸取每個梯度研磨液100 μL各涂布3個NA(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基)平板,25℃培養(yǎng)48 h,選取生長最為均勻的平板計數(shù)。根據(jù)菌落的顏色、透明度、大小、凸起情況、邊緣特征、光滑度等特征,挑取單菌落,純化保存。

1.2.2內生細菌對核桃根腐病菌的拮抗作用

平板對峙法:將病菌菌餅(0.8 cm)放于PDA平板中央,取培養(yǎng)2 d的內生細菌,分別在兩側距平板中心3 cm處畫一細線,25℃培養(yǎng),以只接種根腐病病菌為對照,待對照菌落長滿時測量病菌的菌落生長直徑,每處理重復3次。計算菌落的生長抑制率:

菌落生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

1.2.3內生菌株1A抑菌譜測定

選取具有代表性的植物病原真菌,采用培養(yǎng)基中添加抗菌物質的方法[8],測定菌株1A的抗菌譜。具體方法:①制備菌株1A無菌濾液:將1A菌落接種在300 mL酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h,配制成濃度為107cfu/mL原液,用孔徑為0.22 μm無菌過濾器過濾后,即得無菌濾液。②按1/10倍的比例將無菌濾液分別加入40～50℃的PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基中,輕輕混勻后,倒入9 cm的培養(yǎng)皿中,以不加無菌濾液作空白對照。待培養(yǎng)基凝固后,各平板中央接種植物病原菌菌餅(0.8 cm),25℃培養(yǎng)5～7 d,每處理3個重復。用十字交叉法測量菌落直徑,并計算抑制率。

抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-病原菌菌餅直徑)×100。

1.2.4內生菌株1A的分類鑒定

1.2.4.1生理生化特征測定

測定指標包括革蘭氏染色、需氧性、VP試驗、接觸酶活性、溫度、吲哚試驗、耐鹽能力、pH、淀粉水解活性、檸檬酸鹽利用、甲基紅(MR)試驗、明膠液化試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗。測定方法參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]和《微生物學實驗》[10]中的方法進行。

1.2.4.2分子生物學鑒定

參照DP305離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒說明書(北京天根生化科技公司)提取待測細菌基因組DNA。PCR擴增采用16S rDNA通用引物:27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR擴增反應程序參照杜毓博等[11]的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢驗后,由上海生工公司純化后測序。測序結果通過EzBioCloud和BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行同源性比對,檢索同源性高且具代表性的菌株,用MEGA 5.0軟件,采用鄰接法(neighbor-joining)聚類分析并構建系統(tǒng)進化樹,自展值(bootstrap value)1 000次重復檢驗。

1.2.5內生菌株1A的抗菌機理研究

1.2.5.1菌株1A對根腐病菌的抑制作用

①對根腐病菌菌絲形態(tài)的影響

將根腐病菌菌餅接種于PDA平板中心,距中心3 cm處打孔,每孔加入100 μL菌株1A無菌濾液,以45°角在兩者間插入無菌蓋玻片,25℃黑暗培養(yǎng)3～5 d,在光學顯微鏡下觀察斜插片,以只接根腐病菌作為對照。菌株1A無菌濾液按1.2.3節(jié)方法配制。

②菌株1A對根腐病菌菌絲的抑制生長曲線測定

采用平板對峙生長法,將0.8 cm菌餅接種到PDA平板中央,等距離菌餅3 cm處接入菌株1A單菌落,分別于0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、14 d測定對照菌落直徑和受抑制菌落直徑,取平均值繪制對峙生長下根腐病菌的生長曲線,每處理3個重復。

③菌株1A對病菌孢子萌發(fā)的影響

將病菌菌餅接入PDA平板中培養(yǎng)3～5 d,用無菌水洗下病菌孢子,過濾,配制成106個/mL孢子懸浮液。將原始濃度為107cfu/mL的菌株1A無菌發(fā)酵濾液稀釋0、10、20倍后,與孢子懸浮液分別以1∶1的比例混合,25℃培養(yǎng),24 h后用規(guī)格為25格×16格血球計數(shù)板觀察并統(tǒng)計分生孢子數(shù)。計算分生孢子萌發(fā)抑制率:

孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100；

孢子萌發(fā)抑制率(%)=(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率×100。

1.2.5.2菌株1A產(chǎn)酶能力的測定

參照仇艷肖等[12]的方法,分別制備含幾丁質、茯苓粉、羧甲基纖維素鈉、酪蛋白的培養(yǎng)基,將菌株點接于各培養(yǎng)基上,25℃培養(yǎng)48 h,觀察有無透明圈產(chǎn)生,以檢測菌株是否具有幾丁質酶、β-1,3 葡聚糖酶、纖維素酶(β-1,4 葡聚糖酶)、蛋白酶活性。

1.3菌株1A對核桃根腐病的防治效果

盆栽防效測定試驗,生防菌株采用針刺接種法接種,接種濃度為107cfu/mL;病原菌采用傷根接種法接種,接種濃度為105cfu/mL。設6個處理:①只接生防菌;②先接生防菌,3 d后接病原菌;③先接病原菌,3 d后接生防菌;④同時接生防菌和病原菌;⑤只接病原菌;⑥清水對照。每組處理20株核桃盆栽苗,接種量均為60 mL/株。接種50 d后記錄發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。根腐病病情分級標準如下:0級,外觀無病癥,解剖根沒有變褐色;1級,葉片有25%以下黃化,解剖根1/4以下變褐色;2級,葉片有25%～50%(不含)黃化,解剖根1/4～1/2變褐色;3級,葉片有50%～90%黃化,解剖根1/2以上變褐色,植株萎蔫;4級,植株所有葉片黃化,解剖根腐爛或全部變褐色,植株枯死。計算公式如下:

病情指數(shù)=

防治效果(%)=

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計繪圖,用DPS 7.05進行方差分析并用LSD法比較各處理間的差異顯著性。

2　結果與分析

2.1內生菌株分離和對核桃根腐病菌的拮抗作用

根據(jù)菌落的顏色、透明度、大小、是否突起、是否具有黏性、邊緣特征、光滑度等特征,共分離、純化得到53株菌株。以核桃根腐病菌(F.solani)作為測試菌,對分離到的53株內生細菌進行拮抗作用測定,結果表明,僅有1株菌株1A對供試病原菌有拮抗作用,且抑菌效果顯著,其拮抗帶寬為1.3 cm,抑菌率為63.33%。

2.2菌株1A抑菌譜分析

抑菌譜測定結果顯示:無菌過濾發(fā)酵液對5種病原真菌的拮抗程度不同,對不同種類的病原菌抑菌效果也存在差異(圖1)。無菌過濾發(fā)酵液對5種病原真菌的抑制率依次為核盤菌85.36%、板栗疫病菌75.61%、山茶灰斑病菌56.52%、油橄欖根腐病菌54.88%、核桃根腐病菌45.57%。

2.3菌株1A的鑒定

2.3.1形態(tài)特征

1A菌株在LB液體培養(yǎng)基中生長良好。在NA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)48 h后,菌落乳白色,呈圓形,邊緣不整齊,表面干燥,有褶皺,無黏性,不透明。通過光學顯微鏡觀察菌體形態(tài),菌體桿狀,芽胞桿狀中生,革蘭氏染色呈陽性(圖2)。

2.3.2生理生化特征

菌株1A具有一定的耐鹽性,在3%NaCl條件下能生長,最適生長溫度25～30℃,兼性需氧生長,甲基紅(MR)試驗、吲哚試驗呈陰性,能利用葡萄糖、檸檬酸鹽,能還原硝酸鹽,水解明膠和淀粉,接觸酶反應、VP試驗和氧化酶反應呈陽性(表1),與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中對芽胞桿菌的描述相符合。

圖1　1A無菌發(fā)酵液對病原真菌的抑制作用Fig.1　The inhibitory action of strain 1A sterile broth against pathogenic fungi

圖2菌株1A的形態(tài)特征
Fig.2Morphological characteristics of strain 1A

表1　菌株1A的生理生化特征1)Table 1　Physiological and biochemical features of strain 1A

1) +表示陽性反應;-表示陰性反應;V 表示反應可變(菌株間不穩(wěn)定的反應)。

+: Positive reaction;-: Negative reaction; V: Variable reaction (unstable reaction among strains).

2.3.3分子生物學鑒定

菌株1A基因組通過PCR擴增得到一條約為1 500 bp的條帶,經(jīng)測序全長為1 458 bp,GenBank中的序列登錄號為KJ865856,經(jīng)EzBioCloud和BLAST同源性分析,以16株不同細菌菌屬的模式菌株16S rDNA序列為基礎,構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。其中菌株1A與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)聚于同一分支,相似度達98%～99%。結合菌株的表型特征、理化性質,鑒定菌株1A為芽胞桿菌(Bacillussp.)。

2.4菌株1A的抗菌機理研究

2.4.1菌株1A對根腐病菌的抑制作用

2.4.1.1菌株1A對根腐病菌菌絲形態(tài)的影響

分別取培養(yǎng)5 d后的對照組和處理組的核桃根腐病菌的斜插蓋片于載玻片上,滴水鏡檢,結果發(fā)現(xiàn),對照組正常菌絲體生長繁茂、平滑修長,光滑勻整,分生孢子梗發(fā)育良好,孢子生長旺盛,而處理組的核桃根腐病菌菌絲體絕大部分發(fā)生畸變,菌絲纏繞、扭曲,部分菌絲顏色加深,有的菌絲膨大、透明度增加,局部現(xiàn)串珠狀細胞,分生孢子?；?孢子數(shù)量明顯減少(圖4)。2.4.1.2菌株1A對根腐病菌菌絲的抑制生長曲線

由圖5得出,隨著時間的增加,對照組根腐病菌菌落直徑快速增加。處理組中接入菌株1A后,0～5 d菌落直徑遞增,并達到最高峰,5 d后菌落幾乎停止生長。結果顯示,菌株1A對核桃根腐病菌具有明顯的抑制生長作用。

圖3　菌株1A的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences

圖4　菌株1A對根腐病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.4　Influences of strain 1A on the mycelial morphology of Fusarium solani

2.4.1.3菌株1A對病菌孢子萌發(fā)和孢子產(chǎn)生的影響

由表2得出,菌株1A發(fā)酵濾液能強烈抑制孢子的萌發(fā)和產(chǎn)生。不同處理組的孢子萌發(fā)率有顯著差異,發(fā)酵濾液原液處理的萌發(fā)率最小為23.0%,對照組的孢子萌發(fā)率最高為91.8%。結果表明,發(fā)

酵濾液原液對核桃根腐病菌孢子萌發(fā)抑制作用最強,抑制率為74.9%。

圖5　菌株1A對核桃根腐病菌菌絲的抑制生長曲線Fig.5　Growth inhibition curve of strain 1A against Fusarium solani

發(fā)酵液濃度Concentrationoffermentationfiltrate分生孢子數(shù)/個·mL-1No.ofconidia孢子萌發(fā)數(shù)/個·mL-1No.ofsporegermination孢子萌發(fā)率/%Sporegerminationrate孢子萌發(fā)抑制率/%Inhibitionrateofsporegermination對照Control(8.50±0.18)×106A(7.8±0.15)×106A(91.8±0.61)A 0原液Fermentationfiltrate(2.30±0.06)×106D(5.3±0.11)×105B(23.0±0.39)D(74.9±0.31)A10倍稀釋液Fermentationfiltratediluted10times(4.17±0.09)×106C(1.9±0.05)×106D(45.6±0.43)C(50.3±0.27)B20倍稀釋液Fermentationfiltratediluted20times(6.70±0.10)×106B(4.7±0.07)×106C(70.1±0.57)B(23.5±0.14)C

1) 表中同列數(shù)據(jù)后不同的大寫字母表示差異極顯著,P<0.01。

Within a column, values followed by different letters are significantly different (P<0.01).

2.4.2菌株1A產(chǎn)酶能力的測定

在茯苓粉和幾丁質培養(yǎng)基上菌落周圍均未形成透明圈,表明1A沒有產(chǎn)生β-1,3葡聚糖酶、幾丁質酶。在酪蛋白和羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上菌落周圍均形成透明的水解圈(圖6),表明1A產(chǎn)生了蛋白酶、纖維素酶,能分解培養(yǎng)基的成分。

2.5菌株1A對核桃根腐病的防治效果

盆栽生防效果試驗結果說明(表3),接種生防菌1A(Bacillussp.)和病原菌核桃根腐病菌(F.solani)50 d后,先接生防菌后接病原菌、先接病原菌后接生防菌、同時接種病原菌和生防菌的病情指數(shù)分別為17.1、42.7和26.3,對核桃根腐病的防治效果分別為76.3%、40.7%和63.5%,先接生防菌后

接病原菌的防治效果顯著優(yōu)于其他處理,表明生防菌1A對核桃根腐病有較好的預防作用。

圖6　菌株1A的產(chǎn)酶能力Fig.6　The enzyme-producing ability of strain 1A

處理Treatment病情指數(shù)Diseaseindex防治效果/%Controleffect只接菌株1A Inoculatedwithstrain1A0-先接菌株1A后接核桃根腐病菌 F.solaniinoculatedafterthestrain1A(17.1±0.85)C(76.3±0.64)A先接核桃根腐病菌后接菌株1A Strain1AinoculatedafterF.solani(42.7±1.22)A(40.7±0.27)C同時接種核桃根腐病菌和菌株1A Strain1AandF.Solaniinoculatedsimultaneously(26.3±1.05)B(63.5±0.32)B只接核桃根腐病菌 InoculatedwithF.solani72.0-無菌清水 Sterilewater0-

1) 表中同列數(shù)據(jù)后不同的大寫字母表示差異極顯著,P<0.01。

Within a column, values followed by different letters are significantly different (P<0.01).

3　討論

植物內生細菌因具有穩(wěn)定的生存空間、不易受外界影響、能直接作用于病原菌等特點，在生物防治中占有重要位置[13]。本研究結合菌株的表型特征和理化性質,經(jīng)16S rDNA序列分析和構建系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)菌株1A與芽胞桿菌同源性最高,將菌株1A鑒定為芽胞桿菌(Bacillussp.),具體所屬菌種還需進行多因子進化分析得出。芽胞桿菌(Bacillussp.)是目前生防細菌中研究較多的一類,因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子,所以是理想的生防菌篩選對象[14-15]。芽胞桿菌的抑菌范圍也很廣,包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害[16]。通過平板對峙試驗和顯微觀察研究,發(fā)現(xiàn)菌株1A能抑制病原菌的菌絲生長和孢子萌發(fā),具有較強的拮抗作用。近年來人們通過對芽胞桿菌生防機制的研究,認為其作用方式是以拮抗作用為主的多重機制,其抗菌物質包括多肽類、脂肽類、蛋白類等[17-18]。抗菌物質的穩(wěn)定性直接影響其防病效果,在無公害農副產(chǎn)品的生產(chǎn)中,利用拮抗菌抗菌物質研制的生物農藥具有很好的應用前景[19]。因此,為更深入了解菌株1A與病原真菌的關系,還應從菌株1A 的最佳發(fā)酵配方、對植物是否具有促生作用、抑菌物質的具體成分等方面進行研究。

研究發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌能分泌對植物病原真菌具有極強抑制作用的抗菌蛋白[20-21],在植物真菌病害的防治方面具有一定的應用價值。劉進元等[22]從枯草芽胞桿菌中分離到分子量為22.5 kD的抗菌蛋白,該蛋白對水稻白葉枯病菌有強烈抑制作用。本試驗測定了菌株1A產(chǎn)酶能力,發(fā)現(xiàn)其能分泌蛋白酶和纖維素酶,能降解真菌細胞壁中蛋白質和纖維素,破壞病原真菌菌絲,并抑制病原真菌的生長。因此,推斷芽胞桿菌菌株1A的抗菌物質中含有抗菌蛋白。盆栽防效結果顯示,菌株1A對核桃根腐病具有顯著的防治效果,采用該拮抗菌預處理具有相對較好的生防效果。因此,有望將菌株1A產(chǎn)生的抗菌物質開發(fā)成生物農藥,在農業(yè)生產(chǎn)上具有良好的應用前景。

[1]李敏, 劉媛, 孫翠, 等. 核桃營養(yǎng)價值研究進展[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(6): 167-170.

[2]朱賢朝, 王彥亭, 王智發(fā). 中國煙草病害[M]. 北京: 中國農業(yè)出版社, 2002.

[3]張永春, 黃鎮(zhèn), 杜懷敏, 等. 煙草黑脛病拮抗放線菌的分離與篩選[J]. 中國煙草科學, 2007, 28(5): 5-8.

[4]劉淑芬, 韓寶坤. 植物內生菌研究綜述[J]. 邯鄲農業(yè)高等?？茖W校學報, 2000, 17(2): 15-20.

[5]李桂霞, 馬匯泉, 劉婧, 等.番茄灰霉病高效拮抗菌株鑒定及抗菌活性研究[J]. 山東農業(yè)科學,2007(2): 69-72.

[6]Emmert E A B, Handelsman J. Biocontrol of plant disease: a(Gram-)positive perspective [J]. FEMS Microbiology Letters, 1999,171(1): 1-9.

[7]Joseph O, Lise K.Integrated control of citrus green and blue molds usingBacillussubtilisin combination with sodium bicarbonate or hot water [J]. Postharvest Biology and Technology,2003, 28(1): 187-194.

[8]諶曉曦,陳衛(wèi)良,馬志超,等.抗水稻紋枯病菌拮抗蛋白質的理化性質研究[J].浙江大學學報(農業(yè)與生命科學版),1999,25(5):491-494.

[9]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,2001.

[10]東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2001: 62-65.

[11]杜毓博.梨黑星病拮抗菌FJ1的篩選及拮抗機理研究[D].西安:西北大學,2012.

[12]仇艷肖.黃瓜灰霉病高效拮抗菌的篩選鑒定及其作用研究[D].保定:河北師范大學,2010.

[13]孔慶科,丁愛云.內生細菌作為生防因子的研究進展[J].山東農業(yè)大學學報(自然科學版),2001,32(2):256-260.

[14]周翠,喬魯芹,王超,等.枯草芽胞桿菌sdau08-96發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].山東農業(yè)科學,2011(11):73-76.

[15]彭兵,張樹斌,賈宇,等.枯草芽胞桿菌菌株A抗菌蛋白的分離純化及抗真菌機理[J].中國農業(yè)科學,2011，44(1):67-74.

[16]劉芳,薛鵬琦,喬俊卿,等.西藏低溫適生芽胞桿菌的分離鑒定及其抗菌和促生作用[J].中國生物防治,2010,26(4):453-460.

[17]任爭光,張志勇,魏艷敏.芽胞桿菌防治園藝植物病害的研究進展[J].中國生物防治,2006,22(S1):194-198.

[18]張寶俊,張家榕,韓巨才,等.內生解淀粉芽胞桿菌LP-5抗菌蛋白的分離純化及特性[J].植物保護學報,2010,37(2):143-146.

[19]林多多,居正英,王明江,等.茄子黃萎病生防內生細菌Jaasedl產(chǎn)生的抑菌物質特性初步分析[J].江蘇農業(yè)科學,2009(6):153-156.

[20]Bhaskar N, Sudeepa E S, Rashmi H N, et al. Partial purification and characterization of protease ofBacillusproteolyticusCFR3001 isolated from fish processing waste and its antibacterial activities[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(14): 2758-2764.

[21]邢介帥,李然,趙蕾,等.生防芽胞桿菌T2胞外蛋白酶的純化及其抗真菌作用[J].植物病理學報,2008,38(4):377-381.

[22]劉進元, 潘乃穟, 陳章良. 抗菌蛋白LC IIB的純化及性質[J]. 微生物學報, 1993, 33(4): 268-273.

(責任編輯：田喆)

Isolation, identification and antimicrobial mechanism of an endophytic antagonistic bacterium

Liu Yang1,Zhu Tianhui1,Zheng Lei1,Zhang Jing1,Lan Haoyang2,Guo Zhibin3

(1. Forestry College of Sichuan Agricultural University, Ya’an625014, China; 2. Forestry and Landscape Bureau of Chaotian District of Guangyuan, Sichuan Province, Guangyuan628000, China;3. Forestry and Landscape Bureau of Guangyuan, Sichuan Province, Guangyuan628000, China)

The endogenic bacterium strain 1A from walnut root was found to have antagonistic effect onFusariumsolani. Strain 1A was identified asBacillussp. based on the observation of morphological features, the analysis of physiological and biochemical characteristics, and the 16S rDNA sequences. The GenBank accession number was KJ865856. The antimicrobial research results showed that strain 1A had a significant inhibitory effect onF.solaniand the inhibition rate reached to 63.33%. In addition, strain 1A had a significant inhibitory effect on several forest pathogenic bacteria such asCryphonectriaparasitica. The result of antibiosis mechanism indicated that strain 1A could produce protease and cellulase to degrade the protein and cellulose composition of fungal cytoderm, and damageF.solanimycelia to inhibit the growth ofF.solani. The strain 1A could strongly inhibit the hyphal growth and spore germination ofF.solani, and the inhibition rate of spore germination was 74.89%. The mycelia were distorted, fractured, with increased and winding branches and deepened color. The antagonistic bacterium strain 1A showed good control potential against walnut root rot in the semi-field experiment and the pretreatment of the antagonistic strain 1A had a better biocontrol effect.

walnut root rot;Fusariumsolani;endophytic bacterium;Bacillussp.;antimicrobial mechanism

2014-12-22

2015-04-23

E-mail:zhuth1227@126.com

S 476

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.006