桔梗糖蛋白超臨界輔助提取工藝及對α葡萄糖苷酶抑制作用的研究

趙勝男,鄭曉鳳,崔　琳,廉亞楠,林雪燕,果婷婷,谷　娜,高金波

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

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趙勝男,鄭曉鳳,崔琳,廉亞楠,林雪燕,果婷婷,谷娜,高金波*

(佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院,黑龍江佳木斯 154007)

確定超臨界CO2萃取輔助超聲波提取桔梗糖蛋白的最佳工藝與其對α-葡萄糖苷酶抑制作用。以乙醇為夾帶劑,采用超臨界CO2萃取技術(shù)輔助超聲提取桔梗中的糖蛋白,以得率及其多糖含量為檢測指標(biāo),對提取工藝進(jìn)行評價(jià);以PNPG為底物測定對α-葡萄糖苷酶抑制作用。結(jié)果表明:超臨界CO2萃取的最佳工藝為:溫度45 ℃,壓力25 MPa,乙醇濃度為70%,萃取時(shí)間為1.5 h;其平均得率和糖含量分別為27.83%和62.68%,糖蛋白和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.276 mg/mL和0.321 mg/mL。結(jié)果表明:超臨界CO2萃取技術(shù)結(jié)合超聲提取桔梗糖蛋白的方法可行,步驟簡單,無污染,桔梗糖蛋白對α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用。

超臨界,桔梗,糖蛋白,提取工藝,α-葡萄糖苷酶抑制

桔梗為桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC)植物干燥根,別名為白藥、利如、梗草、鈴鐺花、大藥等[1],性平,味苦、辛,有祛痰與鎮(zhèn)咳、降血糖、抗?jié)?、抗炎等作用[2-3]。桔梗中的化學(xué)成分包括桔梗皂苷、桔梗多糖、桔梗酸、遠(yuǎn)志酸等[4]。糖蛋白是一種復(fù)合糖,是由比較短、往往帶分支的寡糖與多肽鏈共價(jià)連接而成的一類結(jié)合蛋白質(zhì),其廣泛分布于植物、動(dòng)物體內(nèi)[5]。并且具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、防衰老、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、降血脂等功效[6-7]。超臨界CO2萃取技術(shù)是一種高效、無污染的提取方法,它能脫去植物中的脂溶性成分,使細(xì)胞壁脆化[8-9],并且CO2是一種典型的環(huán)保型的溶劑,有較強(qiáng)的溶解性和擴(kuò)散性[10-12]。本文采用超臨界CO2萃取技術(shù)輔助超聲法提取桔梗植物中的糖蛋白,并對α-葡萄糖苷酶的抑制作用進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桔梗購于佳木斯藥店,安國市振宇中藥材飲片有限公司 生產(chǎn)批號(hào):2013814;CO2氣食品級(jí)哈爾濱黎明氣體有限公司;DEAE-52上海源葉生物科技有限公司;Sephadex G -75上海金穗生物科技有限公司。

無水乙醇、碳酸氫鈉、苯酚天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;濃硫酸北京化工廠;葡萄糖天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司,均為分析純。

HA221-50-06型超臨界CO2萃取儀華安超臨界萃取有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī)北京京立離心機(jī)有限公司;DZF-6050型真空干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV757CRT紫外分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1提取工藝流程桔?！?0 ℃烘干→粉碎→過篩→超臨界CO2萃取→取粉末適量→蒸餾水超聲→濃縮→離心→醇沉→離心→烘干→稱量。

1.2.2桔梗脫脂采用超臨界CO2萃取法進(jìn)行脫脂[13]。稱取粉碎過篩的桔梗125 g,加入不同濃度的乙醇溶液80 mL,浸泡12 h,將其裝入1 L萃取釜中。在設(shè)定萃取溫度、壓力下萃取一定時(shí)間,取出晾干,備用。

1.2.3桔梗糖蛋白的提取采用超聲波法提取桔梗糖蛋白。準(zhǔn)確稱量桔梗粉末25 g,按料液比1∶46(w/m)加入蒸餾水,攪拌靜置40 min,在75 ℃、400 W的功率下超聲40 min,過濾,7000 r/min離心10 min,上清液濃縮約100 mL,醇沉過夜(終濃度為80%以上),離心,沉淀物用水復(fù)溶,離心,去除沉淀,再醇沉過夜,離心,即得桔梗糖蛋白,烘干后稱量,計(jì)算得率,公式如下。

式中:w為提取糖蛋白的質(zhì)量，W為稱取桔梗粉末的質(zhì)量。

1.2.4多糖的含量測定采用苯酚硫酸法測定桔梗糖蛋白中多糖的含量[14]。精密稱取桔梗糖蛋白10 mg,用蒸餾水溶解至25 mL。取100 μL于10 mL具塞試管中,加蒸餾水至2 mL,再分別向各試管中加入5%的苯酚溶液1.00 mL,搖勻,加入濃硫酸5.00 mL,室溫靜置5 min,置于80 ℃下水浴20 min,冷卻,于490 nm處測其吸光度,重復(fù)測定3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算糖蛋白中糖含量(以葡萄糖計(jì))。

糖含量(%)=計(jì)算所得葡萄糖的濃度×稀釋倍數(shù)/樣品的質(zhì)量×100

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)超臨界萃取溫度考察:恒定壓力為30 MPa,乙醇濃度為70%,時(shí)間為1.5 h,在溫度分別為35、40、45、50、55 ℃時(shí),先進(jìn)行超臨界CO2輔助提取,再按超聲波操作條件進(jìn)行提取,稱取糖蛋白的質(zhì)量,測定糖含量。

超臨界萃取壓力考察:恒定溫度為50 ℃,乙醇濃度為70%,時(shí)間為1.5 h,在壓力分別為15、20、25、30、35 MPa時(shí),進(jìn)行糖蛋白提取,方法同上。

夾帶劑乙醇濃度考察:恒定超臨界萃取溫度為50 ℃,萃取時(shí)間為1.5 h,萃取壓力為25 MPa,在乙醇濃度分別為0%、30%、50%、70%、90%時(shí),進(jìn)行糖蛋白提取,方法同上。

萃取時(shí)間考察:恒定溫度為50 ℃,壓力為25 MPa,乙醇濃度為70%,在萃取時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h時(shí),進(jìn)行糖蛋白提取,方法同上。

1.2.6超臨界CO2輔助提取正交設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以萃取壓力、萃取溫度、乙醇濃度和萃取時(shí)間,設(shè)計(jì)L9(34)因素水平見表1。

表1　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　L9(34)Factors and levels in orthogonal array design

1.2.7超臨界CO2萃取工藝的優(yōu)化采用權(quán)重系數(shù)法優(yōu)化超臨界CO2萃取工藝。將試樣1～9號(hào)實(shí)驗(yàn)中測得的得率和多糖含量列入正交設(shè)計(jì)表中,采用綜合評分法,分別將得率和多糖含量最高的積分設(shè)定為10分,與之對比依次對9個(gè)樣品進(jìn)行評分。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶⒌寐实臋?quán)重系數(shù)設(shè)定為0.6,而將多糖的含量設(shè)定為0.4進(jìn)行加權(quán)評分;綜合評分的計(jì)算公式為:Y=0.6Y1+0.4Y2。

1.2.8α-葡萄糖苷酶的抑制作用α-葡萄糖苷酶的活力測定:以PNPG為底物,反應(yīng)系統(tǒng)為:67 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)2.0 mL,1 mg/mL谷胱甘肽溶液50 μL,10 mg/mLα-葡萄糖苷酶溶液50 μL,37 ℃保溫20 min后,加入0.116 mol/L PNPG溶液50 μL,反應(yīng)10 min,用0.1 mol/L Na2CO3溶液10 mL終止反應(yīng),于波長400 nm處測定在酶作用下釋放出的對硝基酚(PNP)的吸收值[15]。其中酶活力單位定義[16]:在37 ℃,pH6.8,1 min內(nèi)水解PNPG釋放1 μmol PNP所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

α-葡萄糖苷酶抑制率的測定:分別取濃度為10 mg/mL的桔梗糖蛋白溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0 mL于10 mL量瓶中,定容,搖勻[17]。分別吸取各溶液1.00 mL加入到67 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.8)2.0 mL和10 mg/mL的α-葡萄糖苷酶溶液50 μL的溶液中,在放入37 ℃恒溫水浴鍋中20 min后取出,加入0.116 mol/L PNPG溶液50 μL,反應(yīng)10 min,用0.1 mol/L Na2CO3溶液10 mL終止反應(yīng)。在波長400 nm處測量吸光度值。同時(shí)設(shè)不加酶的樣品空白組,不加樣品的無樣品組,不加樣品和酶的無樣空白組和陽性對照組(阿卡波糖),按下式計(jì)算抑制率。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取100 mg恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品,定容至100 mL量瓶中。精密吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL定容至10 mL,按樣品測定方法取100 μL進(jìn)行操作測其吸光度,以葡萄糖的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其方程為y=3.485x+0.3586;相關(guān)系數(shù)r=0.9993。

2.2單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1萃取溫度的影響從圖1可知,得率隨著萃取溫度的增加而不斷增大,這是因?yàn)闇囟仍黾?脂溶性成分在超臨界流體CO2中的溶解度增加,桔梗細(xì)胞壁的脆性增加,有利于細(xì)胞中糖蛋白物質(zhì)的釋放。糖含量一開始出現(xiàn)降低,而后也隨溫度的增加而增大,50 ℃時(shí)得率和糖含量均達(dá)到最大值。

圖1　溫度對得率的影響Fig.1　Effect of temperature on the yield

2.2.2萃取壓力的影響由圖2可得,得率隨著萃取壓力的增加開始增大,25 MPa時(shí)達(dá)最大,隨后出現(xiàn)下降趨勢。這是因?yàn)閴毫Φ脑黾与m有利于桔梗中脂溶性成分進(jìn)入流體之中,細(xì)胞變脆[18];隨后由于細(xì)胞破壁性增大,糖蛋白流失隨之增大,糖含量隨著萃取壓力的增加一直呈下降趨勢。

圖2　壓力對得率的影響Fig.2　Effect of pressure on the yield

2.2.3乙醇濃度的影響乙醇為夾帶劑,以增強(qiáng)對桔梗中脂溶性物質(zhì)和有色物質(zhì)的去除作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。隨著乙醇濃度的增加,得率不斷的增大但不顯著,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)得率達(dá)到最大;糖含量隨乙醇濃度的增加開始下降,50%時(shí)最低,70%時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)樵诔R界狀態(tài)下,乙醇溶解脂類物質(zhì)的能力隨乙醇的濃度增加而增大,當(dāng)乙醇的濃度達(dá)到一定程度后,細(xì)胞破裂糖蛋白流失增加。

圖3　乙醇濃度對得率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on the yield

2.2.4萃取時(shí)間的影響不同萃取時(shí)間對得率及糖含量的影響如圖4所示。得率隨著萃取時(shí)間的增加不斷的增大,當(dāng)1.5 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后開始降低,糖含量1 h時(shí)最低,1.5～2.0 h時(shí)較高。這可能是因?yàn)檩腿r(shí)間與植物細(xì)胞壁的厚度及脆性有關(guān)所致。

圖4　時(shí)間對得率的影響Fig.4　Effect of time on the yield

2.3正交實(shí)驗(yàn)與方差分析

正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。方差分析見表3。

表3　方差分析表Table 3　Table of variance analysis

注:F0.05(2,2)=19.000。

表2　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of L9(34)orthogonal experiment

根據(jù)表2中極差R值可知:影響因素的大小順序?yàn)镈>A>B>C,即影響桔梗糖蛋白得率的諸因素的主次關(guān)系依次是萃取時(shí)間(h)>萃取溫度(℃)>萃取壓力(MPa)>乙醇濃度(%)。根據(jù)方差分析中F值可知:因素D具有顯著性差異,為提取工藝的主要影響因素。最終確定超臨界CO2的最佳萃取工藝條件為A1B2C2D2,即萃取時(shí)間1.5 h,萃取溫度45 ℃,萃取壓力25 MPa,乙醇濃度為70%。

2.4工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在正交實(shí)驗(yàn)所得到的最佳工藝條件下,平行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果為糖蛋白的得率平均值為27.83%,糖含量的平均值為62.68%。RSD為5.11%。單純用超聲波提取法進(jìn)行提取,結(jié)果為糖蛋白的得率平均值為12.43%,糖含量的平均值為61.28%。RSD為4.50%。結(jié)果表明,本法比單純超聲波法的得率高1.24倍,糖含量兩者基本相當(dāng)。

2.5不同濃度抑制劑對α-葡萄糖苷酶活性的影響

桔梗糖蛋白對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖5。從圖可以看出,隨著濃度的增加,抑制率增大,且與阿卡波糖的抑制能力與抑制趨勢相近,說明桔梗糖蛋白的抑制作用較強(qiáng),糖蛋白和阿卡波糖半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.276 mg/mL和0.321 mg/mL。

圖5　桔梗糖蛋白對α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.5　Effect of Glycoprotein from Platycodon grandiflorum on α-glucosidase

3　結(jié)論

通過單因素考察和正交實(shí)驗(yàn),結(jié)合權(quán)重系數(shù)法,最終確定出超臨界CO2萃取工藝的最佳條件為:溫度為45 ℃,萃取壓力為25 MPa,乙醇濃度為70%,時(shí)間為1.5 h。根據(jù)對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,超臨界CO2萃取技術(shù)輔助超聲波法能提高桔梗糖蛋白的得率,且多糖的含量相對保持不變。由α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,桔梗糖蛋白對其有較強(qiáng)的抑制作用。總之，采用超臨界CO2萃取技術(shù)輔助超聲波提取桔梗糖蛋白的工藝不但得率高,而且省去了有機(jī)溶劑的脫脂、脫色過程,安全、無污染,能提高桔梗的經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用價(jià)值,為今后的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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Study on the optimum conditions of the extraction and inhibition ofα-glucosidase of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic

ZHAO Sheng-nan,ZHENG Xiao-feng,CUI Lin,LIAN Ya-nan,LIN Xue-yan,GUO Ting-ting,GU Na,GAO Jin-bo*

(Pharmacy college of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

To determine the optimum conditions of the extraction and explore the inhibition ofα-glucosidase of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic. Ethyl alcohol was used as entrainer to extract the glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwith supercritical CO2and ultrasonic-assisted extraction. Extraction yield and the content of polysaccharide were as detection index to get the optimum conditions. When the extraction temperature was 45 ℃,extraction pressure was 25 MPa,entrainer was 70% ethyl ethanol and extraction time was 1.5 h,the average values of yield and content of the polysaccharide were 27.83% and 62.68%. The median inhibitory concentration onα-glycosidase activity of glycoprotein and Acarbose IC50were 0.276 mg/mL and 0.321 mg/mL. The results showed that supercritical CO2combined with ultrasonic extraction of glycoprotein fromPlatycodongrandiflorumwas feasible,simple and pollution-free.Platycodonglycoproteinhad stronger inhibitory effect onα-glycosidase。

supercritical;Platycodongrandiflorum;glycoprotein;extraction process;inhibition ofα-glucosidase

2015-07-09

趙勝男(1993-)，女，本科，研究方向：天然產(chǎn)物藥物分析，E-mail:1634217800@qq.com。

高金波(1960-)，女，本科，教授，研究方向：天然產(chǎn)物藥物分析，E-mail:gaojinbo2001@163.com。

佳木斯大學(xué)大學(xué)生“校長創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)基金項(xiàng)目”研發(fā)項(xiàng)目課題(xzyf2013-07);佳木斯大學(xué)大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(LM2015-095);佳木斯大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(xsym2014-013)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)03-0187-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.031