酸脅迫條件下嗜酸乳桿菌菌體細(xì)胞酶調(diào)節(jié)應(yīng)答反應(yīng)研究

趙瑞香,王　瑩,袁　崢,梁新紅,牛生洋

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

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酸脅迫條件下嗜酸乳桿菌菌體細(xì)胞酶調(diào)節(jié)應(yīng)答反應(yīng)研究

趙瑞香,王瑩,袁崢,梁新紅,牛生洋

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

研究了在極端酸性環(huán)境下嗜酸乳桿菌菌體細(xì)胞通過(guò)自身相關(guān)酶活性調(diào)節(jié)對(duì)酸脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)菌株LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)在酸脅迫條件下,菌體細(xì)胞內(nèi)精氨酸脫亞氨酸酶的酶活升高,pH1.5時(shí)La-XH1和La-XH2其酶活分別為4.55、4.13 μg/min·mL;胞內(nèi)脲酶的活性也有所升高,在酸脅迫條件下(pH1.5)分別是1.33 U和1.26 U。通過(guò)對(duì)質(zhì)子泵相關(guān)酶酶活的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在酸脅迫條件下,La-XH1菌體細(xì)胞H+-ATPase的酶活隨著pH的降低而升高,pH1.5時(shí)酶活為5.49 μmol/min·L,La-XH2無(wú)明顯變化,說(shuō)明存在菌株的差異性;谷氨酸脫酸酶的酶活隨著pH的降低其活性呈上升趨勢(shì),pH1.5時(shí)La-XH1和La-XH2的酶活分別為0.336和0.229 mmol/h·L。通過(guò)研究表明,嗜酸乳桿菌在酸脅迫條件下可以通過(guò)激活相關(guān)酶的活性來(lái)提高其耐酸性,以維持細(xì)胞在極端環(huán)境下生理活動(dòng)的正常進(jìn)行。

嗜酸乳桿菌,酸脅迫,酶調(diào)節(jié),應(yīng)答反應(yīng)

嗜酸乳桿菌是棲息在人體腸道內(nèi)的有益菌之一,當(dāng)存在一定數(shù)量時(shí),它能有效地調(diào)節(jié)腸道內(nèi)有益和有害微生物菌群間的平衡,從而促進(jìn)宿主的健康[1-2]。嗜酸乳桿菌多以發(fā)酵乳制品作為載體,在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙酸和乳酸使得乳制品本身具有較低的pH,另外,在食用這些發(fā)酵乳制品的時(shí)候還要經(jīng)過(guò)胃液的低酸性環(huán)境。胃液的pH因飲食結(jié)構(gòu)不同波動(dòng)很大,通常約為3.0,一般空腹時(shí)胃液的pH為1.5,在進(jìn)食后逐漸上升到3.0～5.0[3]。因此對(duì)這些微生物來(lái)說(shuō),食品和胃中的酸性環(huán)境對(duì)它們的生存是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。大量研究表明,嗜酸乳桿菌的最適pH為6.2,但其具有耐受低pH環(huán)境的能力,能夠通過(guò)人體胃酸環(huán)境而進(jìn)入腸道定殖下來(lái),從而發(fā)揮其健康促進(jìn)特性[4-5],但其耐酸機(jī)理至今尚無(wú)定論。

研究發(fā)現(xiàn),L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等[6-8]許多乳酸菌中都有產(chǎn)堿酶的存在,產(chǎn)堿酶主要包括精氨酸脫亞氨酸酶和脲酶。精氨酸脫亞氨酸酶能夠催化L-精氨酸最終生成瓜氨酸、氨和二氧化碳;脲酶能夠催化一分子的尿素水解成一分子的二氧化碳和一分子的氨;這些產(chǎn)堿酶催化底物最終產(chǎn)生的氨會(huì)中和細(xì)胞內(nèi)的H+,升高胞內(nèi)的pH,從而維持胞內(nèi)pH的平衡以利于生化反應(yīng)的正常進(jìn)行[9-10]。研究表明,像L.lactis、L.fermentum、S.thermophilus等這些乳酸菌細(xì)胞膜質(zhì)子泵具有主動(dòng)排出質(zhì)子,調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH的能力,乳酸菌細(xì)胞膜質(zhì)子泵主要包括兩個(gè)酶:H+-ATPase和谷氨酸脫羧酶。H+-ATPase為胞膜結(jié)合蛋白酶,能夠通過(guò)消耗胞體內(nèi)的ATP,將胞內(nèi)質(zhì)子(H+)逆濃度梯度泵出胞外;谷氨酸脫羧酶催化L-谷氨酸與一個(gè)質(zhì)子結(jié)合生成γ-氨基丁酸,消耗細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子從而引起細(xì)胞內(nèi)pH的增加[9,11]。因此,本研究對(duì)嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2經(jīng)過(guò)不同pH培養(yǎng)進(jìn)行酸脅迫,探討胞內(nèi)產(chǎn)堿酶、細(xì)胞膜質(zhì)子動(dòng)力酶對(duì)酸脅迫的應(yīng)答方應(yīng),以期找到產(chǎn)堿酶調(diào)節(jié)和質(zhì)子泵調(diào)節(jié)與嗜酸乳桿菌耐酸能力的關(guān)系。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

嗜酸乳桿菌LactobacillusacidophilusInd-1(簡(jiǎn)稱La-XH1)和LactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2)河南科技學(xué)院食品研究所保藏提供,培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基[5]。

溶菌酶(20000 U/mg)上海源聚生物科技有限公司;牛血清蛋白上海源葉生物科技有限公司;鉬酸銨 鄭州博奧化工產(chǎn)品有限公司;γ-氨基丁酸 浙江益萬(wàn)生物技術(shù)有限公司;磷酸吡哆醛 上海譜振生物科技有限公司;L-谷氨酸鈉鄭州鴻祥化工有限公司;考馬斯亮蘭G250 上?；瘜W(xué)試劑公司分裝廠等及其他試劑均為分析純。

PHS-3C型pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠;SHP-250型生化培養(yǎng)箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型恒溫水浴鍋金壇市杰瑞爾電器有限公司;SW-CJ型超凈工作臺(tái)蘇凈集團(tuán)安泰公司;RC5C型高速冷凍離心機(jī)美國(guó)杜邦公司;7200型可見(jiàn)分光度計(jì)尤尼克(上海)儀器有限公司,等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支干凈試管,按表1添加溶液,并混合均勻,避光沸水浴反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后避光冷卻至室溫,在490 nm下測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),L-瓜氨酸濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2精氨酸脫亞氨酸酶的活力測(cè)定將活化的嗜酸乳桿La-XH1和La-XH2接種于pH為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.2的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)6 h后,6000 r/min 4 ℃離心收集濕菌體,無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次,收集菌體備用(以下菌體獲得方法相同)。將所收集的菌體全部轉(zhuǎn)入5 mL pH為6.5的磷酸緩沖液中,低溫超聲破碎30 min,10000 r/min 4 ℃離心去除菌體碎片,取上清液1 mL,加入1 mL的L-精氨酸溶液,振蕩10 min,二乙酰一肟測(cè)定轉(zhuǎn)化液中新生成的L-瓜氨酸的量[12-13]。

表1　L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制Table 1　Preparation of L-citrulline standard curve

精氨酸脫亞氨酸酶酶活的定義:在1 min內(nèi)催化L-精氨酸產(chǎn)生1 μg的L-瓜氨酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位,即μg/min·mL。

1.2.3脲酶的活力測(cè)定按照1.3.2方法收集的菌體轉(zhuǎn)入5 mL pH為7.0的磷酸緩沖液中,低溫超聲破碎30 min,10000 r/min離心去除菌體碎片,取上清液1 mL于試管中,加入10 mL的尿素緩沖液,迅速蓋上塞子,劇烈搖動(dòng)。將試管置于30 ℃的恒溫水浴鍋中,保持30 min。

另取1 mL上清液放入另一支試管中,加入10 mL pH7.0的磷酸緩沖液,迅速蓋上塞子,將試樣與緩沖液混合均勻,置于水浴鍋中保持30 min,作為空白。每隔5 min將試樣搖勻一次。每個(gè)試管保持30 min后,從水浴鍋中取出,將上清液倒入小燒杯中。并在從水浴鍋中取出恰好5 min時(shí),測(cè)pH[14-15]。

脲酶活性計(jì)算公式:UA=pH″-pH0

式中:UA-脲酶活性,單位計(jì)作U;pH″-尿素分解后樣液的pH;pH0-空白樣液的pH。

1.2.4H+-ATPase活性測(cè)定

1.2.4.1H+-ATPase粗酶液的制備將經(jīng)過(guò)6 h 37 ℃恒溫培養(yǎng)的La-XH1和La-XH2以8000 r/min,4 ℃低溫離心收集濕菌體,并用預(yù)冷的MgCl2溶液洗滌得濕菌體,加入pH7.2的甘氨酰-甘氨酸-KOH-MgCl2的混合緩沖液至菌體懸濁,然后加入溶菌酶50 mg,40 ℃水浴中恒溫1 h。離心后,在沉淀中加入40 ℃的MgCl2溶液,40 ℃水浴30 min,離心除去未破碎的細(xì)胞,收集細(xì)胞膜。然后加入MgCl2緩沖液懸濁,并用Protein Assay試劑測(cè)定蛋白質(zhì)含量,直到MgCl2緩沖液稀釋的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為100 μg/mL為止,制成粗酶液[16]。

1.2.4.2游離磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作在500 μL反應(yīng)液中添加0、20、40、60、80、100 μmol/L的KH2PO4溶液200 μL,37 ℃下反應(yīng)10 min,然后加入300 μL預(yù)冷的0.1 mol/L HCl終止反應(yīng)。反應(yīng)液在冰浴中放置10 mim后加入2 mL的發(fā)色液,18 ℃條件下發(fā)色10 min,立即在660 nm測(cè)定其吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3H+-ATPase活力測(cè)定500 μL反應(yīng)液中添加100 μL 的粗酶液,用上面同樣的方法測(cè)定吸光度,并用沸水浴30 min滅酶活的粗酶液作為空白。參考標(biāo)準(zhǔn)曲線,以1 min內(nèi)1 μmol的游離磷酸量表示1個(gè)酶活單位,即μmol/min·L[17-18]。

1.2.5谷氨酸脫酸酶的活力測(cè)定

1.2.5.1谷氨酸脫酸酶粗酶液的制備將經(jīng)過(guò)6 h 37 ℃恒溫培養(yǎng)的菌體于4 ℃下8000 r/min離心收集濕菌體,生理鹽水洗滌2次離心收集菌體,加入20 mL pH4.8含1 mmol/L的巰基乙醇和0.1 mmol/L磷酸吡哆醛的混合緩沖液,冰浴中超聲破碎,收集上清液,并于混合緩沖液中充分透析,離心收集上清液,作為谷氨酸脫羧酶的粗酶液。

1.2.5.2γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作分別取400 μL濃度分別為0、2、4、6、8、10 mmol/L的γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入pH10.0 0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液500 μL、1 mol/L Na2CO3溶液100 μL、6%苯酚1 mL,混勻,加入NaClO溶液(活性氯為5.2%)1 mL,混勻后放置10 min,然后沸水浴10 min,立即冰浴20 min,待溶液出現(xiàn)藍(lán)色后,加入2.0 mL 60%乙醇溶液,混勻后于20 ℃水浴中放置20 min,在630 nm測(cè)定吸光值,繪制γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.3谷氨酸脫酸酶酶活的測(cè)定取1 mL粗酶液、1 mLL-谷氨酸溶液(60 mmol/L,pH4.8)和1 mL混合緩沖液,混勻后于40 ℃反應(yīng)10 h,取出置冰浴終止反應(yīng),用上述方法測(cè)定630 nm處吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算γ-氨基丁酸濃度。用沸水浴30 min滅酶活的谷氨酸脫酸酶粗酶液作為空白。以1 h內(nèi)1 mmol的γ-氨基丁酸作為一個(gè)酶活單位,即mmol/h·L[19-20]。

2　結(jié)果與分析

2.1L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可以看出,L-瓜氨酸在0～50 μg/mL范圍內(nèi),L-瓜氨酸濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系,線性方程:y=0.0112x+0.0069,R2=0.998,線性關(guān)系較好,可以作為L(zhǎng)-瓜氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1　L-瓜氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of L-citrulline

2.2酸脅迫下精氨酸脫亞氨酸酶活性調(diào)節(jié)應(yīng)答反應(yīng)

將不同pH下培養(yǎng)的La-XH1和La-XH2菌體用二乙酰一肟測(cè)定轉(zhuǎn)化液中新生成的L-瓜氨酸的量,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出精氨酸脫亞氨酸酶的活力,結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2　不同pH下La-XH1的精氨酸脫亞氨酸酶的活力Fig.2　The arginine deiminase activity of La-XH1 at different pH

圖3　不同pH下La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的活力Fig.3　The arginine deiminase activity of La-XH2 at different pH

由圖2、圖3可以看出,pH為1.5時(shí),La-XH1、La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活較高,分別為4.55 μg/min·mL和4.13 μg/min·mL;pH為6.2時(shí),La-XH1、La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活較低,分別為0.32 μg/min·mL和0.62 μg/min·mL;與pH6.2相比,pH1.5時(shí),La-XH1的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活上升了13倍,La-XH2的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活上升了近6倍。說(shuō)明酸脅迫激活了精氨酸脫亞氨酸酶的活性,胞內(nèi)精氨酸脫亞氨酸酶活性的提高,催化L-精氨酸產(chǎn)氨,中和細(xì)胞內(nèi)的H+,從而維持胞內(nèi)pH平衡和正常生化反應(yīng),以提高自身在低pH環(huán)境下的生存能力。

2.3酸脅迫下脲酶活性調(diào)節(jié)應(yīng)答反應(yīng)

脲酶又稱酰胺水解酶或尿素酶,能夠催化尿素水解,產(chǎn)生氨和二氧化碳,是一種高效的分解尿素催化劑,自然界中,細(xì)菌、真菌和植物都能合成脲酶,脲酶有助于微生物利用內(nèi)源性和外源性尿素作為氮源,并將其分解產(chǎn)生氨,而氨可以中和H+,升高胞內(nèi)的pH,維持細(xì)胞在低pH條件下的相對(duì)穩(wěn)定[10,21]。實(shí)驗(yàn)在將不同pH下培養(yǎng)La-XH1和La-XH2,通過(guò)pH增值法測(cè)得脲酶的活力如圖4、圖5。

圖4　不同pH下La-XH1的脲酶的活力Fig.4　The cellular urease activity of La-XH1 at different pH

圖5　不同pH下La-XH2的脲酶的活力Fig.5　The cellular urease activity of La-XH2 at different pH

由圖4、圖5可以看出,嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2在不同pH條件下培養(yǎng)時(shí),胞內(nèi)的脲酶活性變化不大,pH1.5時(shí)酶活與最適pH6.2相比有一定的升高,分別是1.33 U和1.26 U,在最適pH6.2條件下培養(yǎng)時(shí),胞內(nèi)的脲酶活性較低,分別為0.82 U和0.79 U,說(shuō)明脲酶在嗜酸乳桿菌的酸適應(yīng)過(guò)程中作用不太明顯。脲酶能夠催化尿素水解,產(chǎn)生氨和二氧化碳,而氨可以中和H+,升高胞內(nèi)的pH,維持細(xì)胞在低pH條件下的相對(duì)穩(wěn)定[22]。

2.4游離磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6可以看出,在0～100 μmol/L范圍時(shí),游離磷酸濃度與吸光度呈線性關(guān)系:y=0.0072x-0.011,R2=0.9938,線性關(guān)系良好,可作為游離磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6　游離磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve of free phosphoric acid

2.5酸脅迫下H+-ATPase酶活性調(diào)節(jié)

質(zhì)子泵在乳酸菌維持胞內(nèi)外pH的相對(duì)穩(wěn)定時(shí)發(fā)揮了重要作用,其原理是依賴于ATP水解釋放的能量逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)氫離子。H+-ATPase和谷氨酸脫羧酶是質(zhì)子泵機(jī)制的兩個(gè)主要酶。H+-ATPase每逆向轉(zhuǎn)移一分子的質(zhì)子,就要消耗一分子ATP產(chǎn)生一分子游離磷酸,通過(guò)測(cè)定生成游離磷酸的量可知H+-ATPase的活性[23]。因此,實(shí)驗(yàn)首先在不同pH下培養(yǎng)La-XH1和La-XH2,測(cè)定其H+-ATPase逆向轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子消耗ATP生成的游離磷酸的量,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出H+-ATPase的酶活,如圖7、圖8。

圖7　不同pH下La-XH1的H+-ATPase的酶活Fig.7　The H+-ATPase activity of La-XH1 at different pH

圖8　不同pH下La-XH2的H+-ATPase的酶活Fig.8　The H+-ATPase activity of La-XH2 at different pH

由圖7、圖8可以看出,La-XH1的H+-ATPase酶活最適pH6.2時(shí)為2.81 μmol/min·L,pH1.5時(shí)為5.49 μmol/min·L,酶活增加了近1倍,說(shuō)明耐酸菌株La-XH1酸脅迫下H+-ATPase活性調(diào)節(jié)在酸適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮了作用,原因是H+-ATPase可以通過(guò)消耗胞內(nèi)ATP水解釋放的能量,將胞內(nèi)質(zhì)子(H+)逆濃度梯度泵出胞外,以維持胞內(nèi)pH的近中性。La-XH2的H+-ATPase的酶活在pH1.5與pH6.2時(shí)則無(wú)明顯變化,說(shuō)明La-XH1和La-XH2存在菌株差異性[24-25]。

2.6γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖9可知,在γ-氨基丁酸濃度為0～10 mmol/L范圍時(shí),吸光度與濃度呈線性關(guān)系:y=0.0794x+0.022,R2=0.9983,線性關(guān)系較好,可作為γ-氨基丁酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9　γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9　Standard curve of γ-Amino butyric acid

2.7酸脅迫下谷氨酸脫酸酶酶活性調(diào)節(jié)應(yīng)答

谷氨酸脫羧酶可以催化L-谷氨酸與一個(gè)質(zhì)子結(jié)合生成γ-氨基丁酸,消耗細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子從而使細(xì)胞內(nèi)得pH的升高,它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。實(shí)驗(yàn)在不同pH下培養(yǎng)La-XH1和La-XH2,測(cè)定其在酸脅迫條件下γ-氨基丁酸的生成量,然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算谷氨酸脫酸酶的酶活,結(jié)果如圖10、圖11。

圖10　不同pH下La-XH1的谷氨酸脫酸酶的酶活Fig.10　The glutamate decarboxylase activity of La-XH1 at different pH

圖11　不同pH下La-XH2的谷氨酸脫酸酶的酶活Fig.11　The glutamate decarboxylase activity of La-XH2 at different pH

由圖10、圖11可以看出,嗜酸乳桿菌La-XH1和La-XH2的谷氨酸脫酸酶的酶活在最適pH6.2時(shí),其活性較小,酶活單位分別為0.053 mmol/h·L和0.016 mmol/h·L,隨著pH降低,酶活增大,pH1.5時(shí)La-XH1和La-XH2活性分別達(dá)到0.336 mmol/h·L和0.229 mmol/h·L,較最適pH6.2下酶活分別升高了約5倍和13倍。另外,相同pH下,La-XH1的酶活較La-XH2的大,說(shuō)明存在菌株的差異性。嗜酸乳桿菌通過(guò)激活谷氨酸脫酸酶的活性來(lái)提高其耐酸能力,主要是經(jīng)過(guò)谷氨酸脫羧酶消耗胞內(nèi)質(zhì)子,L-谷氨酸消耗一分子H+分解為γ-氨基丁酸和CO2,升高胞內(nèi)的pH,從而維持細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡[26-27]。

3　結(jié)論

嗜酸乳桿菌是人體腸道內(nèi)重要益生菌,具有較強(qiáng)耐酸性。當(dāng)環(huán)境中的pH低于細(xì)胞生長(zhǎng)的最適pH時(shí),嗜酸乳桿菌維持胞內(nèi)pH相對(duì)穩(wěn)定的能力是其在極端環(huán)境下能夠存活的重要生理功能之一。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究表明,嗜酸乳桿菌的這種能力與菌體細(xì)胞自身酶活性的調(diào)節(jié)密不可分,通過(guò)酶調(diào)節(jié)維持菌體細(xì)胞一種寬范圍的△pH,使胞內(nèi)pH高于環(huán)境的pH,以維持細(xì)胞正常生理活動(dòng)的進(jìn)行。產(chǎn)堿酶的存在能催化精氨酸和尿素分解產(chǎn)生中和細(xì)胞內(nèi)的H+的氨,從而維持胞內(nèi)pH的相對(duì)穩(wěn)定。在酸脅迫條件下(pH1.5),嗜酸乳桿菌細(xì)胞內(nèi)的精氨酸脫亞氨酸酶的酶活升高,與最適pH6.2相比,La-XH1和La-XH2精氨酸脫亞氨酸酶的酶活分別上升了13倍和近6倍,胞內(nèi)的脲酶活性變化沒(méi)有精氨酸脫亞氨酸酶的活性變化大,但與最適pH6.2相比,也有所升高;通過(guò)對(duì)質(zhì)子泵相關(guān)酶酶活的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在酸脅迫下La-XH1的H+-ATPase的酶活隨著pH的降低而升高,耐酸菌株與最適pH下的菌株H+-ATPase的酶活相差近1倍,La-XH2無(wú)明顯變化,說(shuō)明存在菌株的差異性;谷氨酸脫酸酶的酶活隨著pH的降低其活性呈上升趨勢(shì),pH1.5時(shí)的酶活比最適pH6.2時(shí)的酶活La-XH1和La-XH2分別升高了約5倍和13倍。總之,在酸脅迫時(shí),嗜酸乳桿菌可以通過(guò)激活精氨酸脫亞氨酸酶、脲酶、H+-ATPase酶、谷氨酸脫酸酶等酶的活性來(lái)提高其耐酸性,以維持細(xì)胞在極端環(huán)境下生理活動(dòng)的正常進(jìn)行。

[1]Alm L,Robinson R K. The therapeutic effects of various cultures-an overview. Therapeutic properties of fermented milks[J]. Elsevier Applied Science,1991,21:45-64.

[2]Fuller R. Probiotics in human medicine[J]. Gut,1991,32(4):439-442.

[3]趙瑞香,李剛,牛生洋,等. 微生態(tài)菌株Lactobacillusacidophilus在模擬人體胃與小腸蛋白酶環(huán)境中抗性的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2006,6(4):19-23.

[4]Zhao R,Sun J,Mo H,et al. Analysis of functional properties ofLactobacillusacidophilus[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2007,23(2):195-200.

[5]趙瑞香. 嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究[M]. 北京:科學(xué)出版社,2007:38-40.

[6]吳重德. 干酪乳桿菌抵御酸脅迫的生理機(jī)制解析[D]. 江南大學(xué),2012

[7]Vrancken G,Rimaux T,Weckx S,et al. Environmental pH determines citrulline and ornithine release through the arginine deiminase pathway in Lactobacillus fermentum IMDO 130101[J].International journal of food microbiology,2009,135(3):216-222.

[8]李曉敏. 嗜熱鏈球菌耐酸機(jī)制的初步研究[D]. 天津：天津科技大學(xué).2014.

[9]胡愛(ài)華,敖曉琳,陳岑,等. 乳酸菌耐酸耐膽鹽機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(8):380-383.

[10]Chen Y Y M,Burne R A. Identification and characterization of the nickel uptake system for urease biogenesis in Streptococcus salivarius 57. I[J]. Journal of bacteriology,2003,185(23):6773-6779.

[11]Even S,Lindley N D,Loubière P,et al. Dynamic response of catabolic pathways to autoacidification in Lactococcus lactis:transcript profiling and stability in relation to metabolic and energetic constraints[J]. Molecular microbiology,2002,45(4):1143-1152.

[12]李加友,曹瑜,焦慶才. 酶法轉(zhuǎn)化液中L-瓜氨酸的分光光度法測(cè)定[J]. 分析實(shí)驗(yàn)室,2006,24(12):8-10.

[13]錢嘉南,孫志浩,劉宇鵬,等. 二乙酰一肟-氨基硫脲比色法測(cè)定酶轉(zhuǎn)化液中的L-瓜氨酸[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2007,38(7):519-522.

[14]林麗云,董曉潔,陳阿微. 黃豆脲酶的提取及其活性測(cè)定[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2013,34(9):85-88.

[15]豐驍,段建平,蒲小鵬,等. 土壤脲酶活性兩種測(cè)定方法的比較[J]. 草原與草坪,2008,127(2):70-72.

[16]Kobayashi H,Suzuki T,Unemoto T. Streptococcal cytoplasmic pH is regulated by changes in amount and activity of a proton-translocating ATPase[J]. Journal of Biological Chemistry,1986,261(2):627-630.

[17]楊郁,張麗靖. 乳酸菌耐酸機(jī)理的研究[J]. 食品工程,2008,12(4):42-45.

[18]Miwa T,Esaki H,Umemori J,et al. Activity of H(+)-ATPase in ruminal bacteria with special reference to acid tolerance[J]. Applied and environmental microbiology,1997,63(6):2155-2158.

[19]楊勝遠(yuǎn),陸兆新,呂鳳霞,等. 谷氨酸脫羧酶活力測(cè)定中 GABA 比色定量方法研究[J]. 食品科學(xué),2006,27(7):205-209.

[20]許建軍,江波,許時(shí)嬰. 比色法快速測(cè)定乳酸菌谷氨酸脫羧酶活力及其應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2004,31(2):66-71.

[21]De Angelis M,Gobbetti M. Environmental stress responses in Lactobacillus:a review[J]. Proteomics,2004,4(1):106-122.

[22]Quivey R G,Kuhnert W L,Hahn K. Adaptation of oral streptococci to low pH[J]. Advances in microbial physiology,2000,42:239-274.

[23]Kobayashi H. A proton-translocating ATPase regulates pH of the bacterial cytoplasm[J]. Journal of biological chemistry,1985,260(1):72-76.

[24]曹喻. 耐酸調(diào)控雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因的初步篩選[D]. 哈爾濱哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué),2013.

[25]喬磊,崔艷華,曲曉軍. 乳酸菌的適酸性調(diào)節(jié)[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(12):24-26.

[26]黃桂東. Lactobacillus brevis NCL912的耐酸特性及其酸脅迫下差異表達(dá)蛋白的研究[D]. 南昌：南昌大學(xué),2011.

[27]Nomura M,Kobayashi M,Ohmomo S,et al. Inactivation of the Glutamate Decarboxylase Gene in Lactococcus lactis subsp. cremoris[J]. Applied and environmental microbiology,2000,66(5):2235-2237.

Response reaction of enzyme regulation byLactobacillusacidophiluscell on acid-stress

ZHAO Rui-xiang,WANG Ying,YUAN Zheng,LIANG Xin-hong,NIU Sheng-yang

(College of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The response reaction ofLactobacillusacidophiluscell on acid-stress through the related enzyme regulation in extremely acidic environment were studied. The result showed that the enzymatic activity of intracellular arginine deiminase of test strains,LactobacillusacidophilusInd-1(La-XH1)andLactobacillusacidophilusLakcid(La-XH2),was increased to 4.55 μg/min·mL and 4.13 μg/min·mL respectively at pH1.5.The intracellular urease activity of La-XH1 and La-XH2 was 1.33 U and 1.26 U,which were increased slightly. By analyzing the enzyme activity related to proton pump,the result showed that the H+-ATPase activity of La-XH1 was increased with the decrease of pH,and enzyme activity was 5.49 μmol/min·L at pH1.5. However,the H+-ATPase activity of La-XH2 had no significant change,which indicated La-XH1 and La-XH2 had strain differences. Meanwhile,the enzyme activity of glutamate decarboxylase had an increasing tendency with the decrease of pH,and the enzyme activity of La-XH1and La-XH2 was 0.336 mmol/h·L and 0.229 mmol/h·L respectively at pH1.5. The study indicated thatLactobacillusacidophiluscould activate the enzyme activity related to improve its acid-resistant ability on acid-stress condition,in order to maintain the normal physiological function of cells in extreme environment.

Lactobacillusacidophilus;acid-stress;enzyme regulation;response reaction

2015-07-09

趙瑞香(1966-)，女，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：zrx338@163.com。

河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(12A550004)；河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(122102110117)；新鄉(xiāng)市科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(CP1310)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)03-0181-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.030