重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化

李曉紅,柳　倩,王　蓓,梅曉宏,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

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重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑發(fā)酵條件優(yōu)化

李曉紅1,2,柳倩1,王蓓1,梅曉宏1,*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

在獲得含高拷貝獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑基因的重組菌株GS115基礎(chǔ)上,通過分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇與甲醇添加比例、誘導(dǎo)初始pH、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)基類型對重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑(kwPMEI1)表達(dá)量的影響,優(yōu)化了搖瓶發(fā)酵條件。結(jié)果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析純)以體積比為1∶1的比例添加、pH5.5、在BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)5 d為最佳條件。該重組蛋白kwPMEI1的表達(dá)量最高可達(dá)700.302 mg/L。

果膠甲酯酶抑制劑,畢赤酵母GS115,發(fā)酵條件,優(yōu)化

天然的新鮮果蔬汁一般會呈現(xiàn)出均一穩(wěn)定、分散良好的渾濁態(tài)。渾濁態(tài)物質(zhì)在果蔬汁的顏色、風(fēng)味及質(zhì)地等感官品質(zhì)方面起著非常重要的作用。因此,在果蔬汁的儲運(yùn)過程中,保持其渾濁態(tài)是很必要的。但是,隨著儲存時(shí)間的延長,果蔬汁易出現(xiàn)渾濁態(tài)消失的現(xiàn)象,這主要是由于果蔬汁中內(nèi)源性果膠甲酯酶對果膠的脫甲酯化作用而造成的[1]。為了避免渾濁態(tài)消失,果蔬汁加工業(yè)通常用熱處理的方法鈍化果膠甲酯酶(PME)。但是這一過程在很大程度上會破壞果蔬汁的營養(yǎng)成份和感官品質(zhì)。獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑的發(fā)現(xiàn)為解決果蔬汁渾濁態(tài)消失問題提供了一個(gè)嶄新的途徑。它能夠與果膠甲酯酶的活性部位以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合形成復(fù)合物,從而完全抑制PME的活性[2-3]。相對于熱處理來說,這種方法能更好的保持果蔬汁的風(fēng)味和維生素含量[4]。Casstaldo等將獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑加入橙汁中,其渾濁態(tài)在5 ℃下保持了9個(gè)月[5]。此外,經(jīng)過純化的果膠甲酯酶抑制劑(PMEI)還可以用來檢測果蔬汁中殘余PME的活力[6-7]。但是從獼猴桃果實(shí)中直接提取PMEI非常困難,并且產(chǎn)量很低,難以滿足果蔬汁加工業(yè)發(fā)展的需求。如果利用基因工程技術(shù),在體外實(shí)現(xiàn)PMEI的大量表達(dá),就能有效突破其提取困難、產(chǎn)量低的瓶頸,從而促進(jìn)果蔬汁工業(yè)的快速發(fā)展。巴斯德畢赤酵母是一個(gè)高效表達(dá)系統(tǒng),許多外源蛋白已在該系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)。梅曉宏[8]等已將獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑基因轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母菌KM71中成功獲得了重組菌株,其重組PMEI蛋白最高表達(dá)量為0.2 g/L。該研究成果提供了果蔬汁加工業(yè)所面臨的渾濁態(tài)消失問題的解決方法。畢赤酵母KM71菌株為Muts型,利用甲醇速度較慢,而畢赤酵母GS115菌株為Mut+型,利用甲醇能力強(qiáng),在以甲醇為碳源時(shí)生長較快,蛋白表達(dá)量相對更高[9-10]。與KM71相比,GS115更適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。基于以上實(shí)際情況,本論文通過構(gòu)建含高拷貝kwpmei(獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑基因)重組菌株 GS115,研究了不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對重組果膠甲酯酶抑制劑菌株表達(dá)量的影響,最終確定單因素發(fā)酵條件的最佳配方。本研究為重組果膠甲酯酶抑制劑應(yīng)用到果蔬汁工業(yè)化生產(chǎn)中將起到積極的推進(jìn)作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌DH5a，蛋白質(zhì) Marker天根生化科技(北京)公司;重組質(zhì)粒pPIC9k/PMEI本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存;畢赤酵母菌株GS115和KM71Invitrogen公司,于甘油中-80 ℃保存。限制性內(nèi)切酶 SacⅠTaKaRa生物工程(大連)有限公司;生物素北京暢華志城科技有限公司;丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、G418Amresco公司產(chǎn)品,北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒碧云天生物技術(shù)研究所;其他試劑國產(chǎn)分析純。

HQL150C恒溫?fù)u床中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器研究所;LRH-150B型生化培養(yǎng)箱廣東省醫(yī)療器械廠;超凈工作臺北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠;高速臺式冷凍離心機(jī)(型號20G)上海安亭科學(xué)儀器廠;DY24A型垂直板電泳槽、DYY-10型(ECP3000)三恒電泳儀北京六一儀器廠;WD-9405B型水平搖床北京六一儀器廠;BioDoc-It? Imager System型UVP凝膠成像儀美國UVP公司;799 GPD Titrono型自動(dòng)電位滴定儀瑞士萬通;UV-2102PC型紫外可見分光光度計(jì)上海尤尼柯有限公司。

1.2培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖,若制備斜面或平板培養(yǎng)基則需加入2%瓊脂粉;MD培養(yǎng)基平板:1.34% YNB、2%葡萄糖、4×10-5%生物素,2%瓊脂粉;BMGY培養(yǎng)基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甘油;BMMY培養(yǎng)基:1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甲醇。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1畢赤酵母GS115電轉(zhuǎn)化

1.3.1.1GS115感受態(tài)細(xì)胞的制備參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊[11]。

1.3.1.2GS115感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/PMEI,經(jīng)雙酶切鑒定正確后,用SacⅠ進(jìn)行線性化,并將其與GS115感受態(tài)細(xì)胞及0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯置于冰上,預(yù)冷10 min。在0.2 cm電轉(zhuǎn)化杯內(nèi)將80 μL感受態(tài)細(xì)胞和10 μg線性重組質(zhì)粒立即混合均勻,冰浴5 min后,擦干電轉(zhuǎn)化杯,并迅速置于電轉(zhuǎn)儀上電擊1次,然后立即加入1 mL冰預(yù)冷1 mol/L的無菌山梨醇溶液,混勻后,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,重新置于冰上。取0.4 mL電轉(zhuǎn)化物均勻涂布于MD平板上。同法以空質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化菌株GS115,作為表達(dá)的陰性對照。將His+轉(zhuǎn)化子點(diǎn)接在新鮮MD平板上,于30 ℃進(jìn)行培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。

1.3.2轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性鑒定利用無菌操作技術(shù),在細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中分別加入200 μL YPD培養(yǎng)基。用無菌牙簽將MD平板上的His+轉(zhuǎn)化子分別接入各孔中,并攪拌均勻。蓋好細(xì)胞培養(yǎng)板的上蓋,將第一批His+轉(zhuǎn)化于30 ℃靜置培養(yǎng)2 d后,取另一塊新的細(xì)胞培養(yǎng)板,并在每孔內(nèi)分別加入190 μL YPD培養(yǎng)基。依照次序分別向各孔內(nèi)加入10 μL第一批His+轉(zhuǎn)化子,并用移液器將其充分混勻。蓋好細(xì)胞培養(yǎng)板的上蓋,將第二批His+轉(zhuǎn)化于30 ℃靜置培養(yǎng)1 d。重復(fù)上兩步操作,蓋好細(xì)胞培養(yǎng)板的上蓋,將第三批His+轉(zhuǎn)化子于30 ℃靜置培養(yǎng)1 d。用100 μL移液器上下反復(fù)吹吸畢赤酵母細(xì)胞培養(yǎng)物,使第三批His+轉(zhuǎn)化子獲得充分懸浮,以便于后續(xù)的高拷貝菌株的篩選。

1.3.3篩選高拷貝菌株在不同的YPD/G418平板上(G418的終濃度分別為 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL),分別點(diǎn)接2 μL相同的第三批His+轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物。靜置30 min,待菌懸液被吸干后,將YPD/G418平板于30 ℃倒置培養(yǎng),并分別在第2、3、4、5 d觀察G418抗性轉(zhuǎn)化子。

1.3.4 高拷貝菌株的誘導(dǎo)表達(dá)將用4.0 mg/mL G418篩選得到的高拷貝重組菌株于新鮮YPD平板上劃線,30 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取一單菌落接種于接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。按1%接種量取2.5 mL菌液接種于25 mL BMGY培養(yǎng)基中,用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng),在搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min、溫度為30 ℃條件下培養(yǎng)至菌體密度OD600=2～6,1500～3000×g條件下離心5 min,收集菌體棄去上清液,用20 mL BMMY培養(yǎng)基重懸菌體細(xì)胞,搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min、30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h。每天補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為1%,誘導(dǎo)表達(dá)4 d后,4 ℃、15000×g離心5 min,收集上清。

1.3.5 表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1的SDS-PAGE分析取60 μL上清液和15 μL樣品緩沖液充分混合。沸水浴中煮7～8 min。電泳所用濃縮膠和分離膠濃度分別為4%和15%,上樣量為每孔30 μL。電泳條件:樣品在濃縮膠時(shí)電壓為80 V,當(dāng)進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V。待樣品跑至凝膠底部時(shí),將凝膠取出進(jìn)行染色和脫色至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶,放入凝膠成像儀拍攝成像。根據(jù)條帶深淺即可大致判斷蛋白表達(dá)量的多少。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化Table 1　Optimization of fermentation conditions

表2　各培養(yǎng)基配方Table 2　Culture medium and its components

1.3.6kwPMEI1抑制活性檢測按照Giovane等人敘述的方法[12],制備番茄PME的粗提液,將其pH調(diào)至7.5;將20 mL 0.1%的果膠溶液的pH調(diào)至7.5,并使溶液溫度恒定在25 ℃;取250 μL番茄粗提液以體積比為1∶1的比例與3株高拷貝菌株誘導(dǎo)表達(dá)的上清液混合,在25 ℃條件下作用15 min。將上述混合溶液分別加入到等量的果膠溶液中,同時(shí)將番茄PME粗提液加入到果膠溶液中作為陰性對照;應(yīng)用pH自動(dòng)電位滴定儀,分別測定上述溶液與果膠作用后pH的變化情況。

1.3.7 重組kwPMEI1蛋白表達(dá)量測定將發(fā)酵液在4 ℃下離心(15000×g,5 min),取其上清液稀釋到合適的倍數(shù)。按照BCA蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度的方法[13],用酶標(biāo)儀于562 nm處測定反應(yīng)液的OD值。kwPMEI1的濃度用BandScan軟件結(jié)合蛋白總濃度進(jìn)行計(jì)算。

1.3.8 發(fā)酵條件優(yōu)化以YPD作為種子活化培養(yǎng)基,BMGY為生長培養(yǎng)基,BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,分別觀察甘油加入量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%)、甲醇(分析純)添加量(0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%)、甲醇與山梨醇溶液(100%,w/v)混合添加的比例、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的初始pH及誘導(dǎo)時(shí)間對kwPMEI1表達(dá)量的影響(如表1),同時(shí)研究了BMGY、YPD、MGY、FBSH等不同培養(yǎng)基類型(如表2)對于kwPMEI1表達(dá)量的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1高拷貝菌株的篩選

將2 μL相同的His+轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物分別點(diǎn)接到不同的YPD/G418平板上(G418的終濃度分別為 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL),結(jié)果如圖1。研究表明,異源基因插入整合的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)化子對G418的抗性存在一定的正相關(guān)性。一般來講,基因拷貝數(shù)的增加可提高分泌蛋白的表達(dá)量[14]。在本實(shí)驗(yàn)中,通過篩選,在G418濃度為4.00 mg/mL的平板上,獲得了3株含高拷貝的重組菌株(編號為1,2,3)。

圖1　高拷貝菌株的篩選Fig.1　Selection of multiple copies注:按照從左到右、從上到下的順序G418的 終濃度依次為 0.50、1.00、2.00、4.00 mg/mL。

2.2高拷貝菌株的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

含高拷貝的重組畢赤酵母菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,通過SDS-PAGE檢測其目的蛋白表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1的表達(dá)情況。結(jié)果如圖2所示。由圖可見,約16 ku(據(jù)蛋白Marker分子量和圖距比例計(jì)算)處有一條明顯的蛋白條帶,與天然的獼猴桃PMEI分子量相近[3],此條帶即為目的蛋白kwPMEI1;并且通過BandScan軟件對目的蛋白和總蛋白灰度值進(jìn)行測算發(fā)現(xiàn)發(fā)酵上清液中目的蛋白含量約占總蛋白的80%,雜蛋白較少,這將非常有利于目的蛋白kwPMEI1的純化。

圖2　高拷貝菌株表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1的 SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of kWPMEI1 from multiple copies注:M為蛋白質(zhì)Marker;1～3分別為 1號、2號和3號高拷貝菌株的表達(dá)產(chǎn)物。

2.3kwPMEI1抑制活性分析

本實(shí)驗(yàn)中對3株含高拷貝的重組菌株(編號為1,2,3)的表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1蛋白的抑制活性進(jìn)行了測定,結(jié)果如表3所示。

表3　kwPMEI1的抑制活性測定Table 3　Mensuration of the kwPMEI1 inhibition activity

分析各溶液的pH,發(fā)現(xiàn)三種混合液加入到果膠溶液中作用一段時(shí)間后,溶液的pH變化不大,而對照(混合液中無發(fā)酵上清液)的pH明顯降低。說明1號、2號和3號菌株發(fā)酵上清液中的表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1對果膠甲酯酶具有生物抑制活性。

2.4發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1甘油加入量對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響不同甘油加入量對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的分析結(jié)果(圖3)表明:當(dāng)甘油加入量為3%時(shí),kwPMEI1表達(dá)量最高,為660.962 mg/L。這是因?yàn)榧?xì)胞密度隨甘油加入量的升高而增大(具體數(shù)值未列出),一定程度下,蛋白表達(dá)量同細(xì)胞密度成正比[15]。但是,當(dāng)甘油加入量從3.0%上升至4.0%時(shí),細(xì)胞密度雖有所增加,蛋白表達(dá)量卻下降至536.185 mg/L。原因是較高的甘油濃度在酵母發(fā)酵過程中會導(dǎo)致乙醇積累,乙醇是aox1啟動(dòng)子的阻遏物,因而導(dǎo)致蛋白表達(dá)量的降低[15]。

2.4.2甲醇添加量對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響畢赤酵母GS115是Mut+型,利用甲醇速度較快。在誘導(dǎo)階段,GS115利用甲醇作為唯一碳源,因此,甲醇添加量是kwPMEI1表達(dá)量的決定性因素之一。由圖4可知,甲醇添加量為1.0%時(shí),kwPMEI1表達(dá)量最高,達(dá)694.189 mg/L。當(dāng)甲醇添加量高于1.0%時(shí),kwPMEI1表達(dá)量下降,這是因?yàn)檩^高的甲醇濃度易造成甲醇氧化產(chǎn)物的積累,對酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[16]。

圖3　甘油加入量對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響Fig.3　The influence of glycerol concentration on kwPMEI1 production

2.4.3山梨醇與甲醇添加比例對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響山梨醇對aox1啟動(dòng)子無抑制作用,且山梨醇和甲醇混合添加,能夠提供充足的碳源和能源,降低甲醇對細(xì)胞的毒害作用。Carmen Jungo[17]指出,山梨醇與甲醇混合補(bǔ)料會增加細(xì)胞密度,提高蛋白表達(dá)量。因此研究山梨醇與甲醇添加比例對于重組蛋白kwPMEI1表達(dá)量的影響是很有意義的。圖5表明,當(dāng)山梨醇溶液(100%,w/v)與甲醇以體積比為1∶1的比例添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí),kwPMEI1表達(dá)量最高,達(dá)到646.919 mg/L,比單獨(dú)以甲醇作為唯一碳源補(bǔ)料發(fā)酵所得到的kwPMEI1蛋白量要高很多。

圖5　甲醇和山梨醇添加比例 對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響Fig.5　The influence of methanol and sorbitol co-feeding on kwPMEI1 production

2.4.4誘導(dǎo)初始pH對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響畢赤酵母可以在pH為4～7的范圍內(nèi)生長,但是培養(yǎng)基的pH對kwPMEI1蛋白表達(dá)量仍然有一定的影響。圖6表明,kwPMEI1表達(dá)量最高時(shí)的pH為5.5,誘導(dǎo)表達(dá)4 d后其表達(dá)量高達(dá)572.235 mg/L。在較低溫度下,蛋白酶的活力較弱,對kwPMEI1的降解較少。但從整個(gè)的趨勢來看,在此pH范圍內(nèi),kwPMEI1表達(dá)量沒有明顯的變化,再次證明畢赤酵母對pH的適應(yīng)能力是很強(qiáng)的。在pH越接近7.0時(shí),蛋白含量越低,可能是由于在pH接近中性時(shí),蛋白酶的活力增強(qiáng),對目的蛋白的降解作用增大。

圖6　誘導(dǎo)初始pH對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響Fig.6　The influence of initial pH on kwPMEI1 production

將以上獲得的發(fā)酵產(chǎn)物放于-20 ℃冰箱中保存兩個(gè)月,蛋白含量明顯下降。這與蛋白酶的降解作用有很大關(guān)系。所以在保存時(shí)可以采取低溫保存(如-80 ℃),培養(yǎng)基中添加蛋白酶抑制劑,改變培養(yǎng)基的pH以及離心后將菌種和上清液分開保存等措施。

2.4.5誘導(dǎo)時(shí)間對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響對畢赤酵母GS115進(jìn)行連續(xù)12 d的誘導(dǎo)表達(dá),每隔24 h取樣0.5 mL用于測定總蛋白和kwPMEI1表達(dá)量。且每隔24 h補(bǔ)充甲醇至其終濃度為1%(v/v)。由圖7可知,在第3～5 d時(shí),表達(dá)量升高很快,在第5 d時(shí),kwPMEI1表達(dá)量達(dá)到最高,為576.649 mg/L,之后由于蛋白酶的降解作用[18],蛋白含量有所下降,但是總體趨勢比較平穩(wěn)。

圖7　誘導(dǎo)時(shí)間對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響Fig.7　The influence of induction time on kwPMEI1 production

2.4.6不同類型的培養(yǎng)基對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響重組菌株分別在上述培養(yǎng)基(如表2)中誘導(dǎo)表達(dá)96 h后,測得的蛋白表達(dá)量如圖8所示。誘導(dǎo)過程按兩種方式進(jìn)行,第一種是菌種分別在YPD和BMGY培養(yǎng)基中生長12 h后,離心(7000 r/min,5 min)并轉(zhuǎn)入新鮮的YPD(加入1%甲醇)和BMMY培養(yǎng)基中每隔24 h補(bǔ)加1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(如圖8中YPD和BMMY);第二種是菌種分別在YPD和BMGY培養(yǎng)基中生長12 h后,直接向原有培養(yǎng)基中加入1%甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),每隔24 h補(bǔ)加1%甲醇(如圖8中YPD*和BMMY*);MMY表示菌種在MGY中培養(yǎng)12 h后,離心收集菌體轉(zhuǎn)入MMY進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá);FBSH表示菌種在BMGY中培養(yǎng)12 h后,離心收集菌體轉(zhuǎn)入FBSH進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。由圖8可知,菌株在BMMY中按第一種誘導(dǎo)表達(dá)方式表達(dá)的kwPMEI1蛋白量最高,為676.385 mg/L;在FBSH中的kwPMEI1產(chǎn)量最低,為302.414 mg/L。

圖8　不同培養(yǎng)基對kwPMEI1蛋白表達(dá)量的影響Fig.8　The influence of different induction media on kwPMEI1 production

重組蛋白kwPMEI1在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),即在誘導(dǎo)開始時(shí)添加3%甘油,以BMGY為生長培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,然后添加1%甲醇(分析純)和1%山梨醇溶液(100%,w/v),以初始pH為5.5的BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,誘導(dǎo)培養(yǎng)5 d,kwPMEI1產(chǎn)量達(dá)到700.302 mg/L。

3　討論

質(zhì)粒pPIC9K擁有細(xì)菌的卡那霉素抗性基因(Kan來自于Tn903),因此當(dāng)該質(zhì)粒存在于畢赤酵母細(xì)胞中,Kan基因可傳遞抗性給酵母細(xì)胞從而使其對抗生素G418產(chǎn)生抗性。研究表明異源基因插入整合的拷貝數(shù)與轉(zhuǎn)化子對G418的抗性存在一定的正相關(guān)性,即單拷貝異源基因的整合可使轉(zhuǎn)化子對約0.25 mg/mL劑量的G418產(chǎn)生抗性,而含多個(gè)拷貝異源基因的整合可提高轉(zhuǎn)化子對G418的抗性,如含1～2個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化子可對0.5 mg/mL劑量的G418產(chǎn)生抗性,而含7～12個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化子可對4 mg/mL劑量的G418產(chǎn)生抗性。從一般意義上來講,基因的拷貝數(shù)增加可提高分泌蛋白的表達(dá)量,這主要取決于目的蛋白自身的特性。本研究中,G418濃度達(dá)到4.0 mg/mL的濃度下篩選出3株重組菌株,這些菌株有可能含有高拷貝轉(zhuǎn)化子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這3株重組菌株能夠高效表達(dá)出重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑。

畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白,加上畢赤酵母生長和發(fā)酵培養(yǎng)基中都只有少量的蛋白,而且質(zhì)粒pPIC9K具有信號肽序列,該序列所編碼的多肽可引導(dǎo)外源蛋白分泌到酵母細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,因此分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要組成成分,這給目的蛋白的分離和純化帶來很大方便。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果完全證明了以上觀點(diǎn)。與釀酒酵母相比,畢赤酵母對外源蛋白的糖基化程度不是很高。本研究中,畢赤酵母表達(dá)的重組kwPMEI1與天然的PMEI蛋白分子量非常接近。

信號肽對異源蛋白的有效引導(dǎo)可能成為影響其產(chǎn)量的最主要因素。除此之外,誘導(dǎo)表達(dá)條件也會對外源蛋白的表達(dá)量產(chǎn)生很大影響。本實(shí)驗(yàn)通過對搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)果膠甲酯酶抑制劑的各影響因素進(jìn)行了分析,為后面進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。

重組P.pastoris是一種甲醇誘導(dǎo)型工程菌,攜帶的外源基因只有在以甲醇為唯一碳源的環(huán)境里才能高效表達(dá)。甲醇代謝的第一步是:醇氧化酶利用氧分子將甲醇氧化為甲醛,還有過氧化氫。由于醇氧化酶與O2的結(jié)合率較低,因而畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶。而調(diào)控產(chǎn)生醇過氧化物酶的啟動(dòng)子也正是驅(qū)動(dòng)外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子。細(xì)胞中大多數(shù)的醇氧化酶是aox1基因產(chǎn)物。甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)aox1基因的高水平表達(dá)代謝,也影響了外源基因的表達(dá)情況。因此,發(fā)酵過程中甲醇濃度是影響目的蛋白表達(dá)量的重要因素。pH決定營養(yǎng)物的解離狀態(tài),制約著微生物細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用速率;而且在較低的pH下,蛋白酶的活力較低,對目的蛋白的降解力較弱。研究誘導(dǎo)時(shí)間對目的蛋白表達(dá)量的影響,有利于掌握收獲目的蛋白的最佳時(shí)間,增強(qiáng)畢赤酵母對底物的利用率(節(jié)約能源)和獲得較高的生產(chǎn)強(qiáng)度(縮短生產(chǎn)周期),從而利于工業(yè)化生產(chǎn)的順利進(jìn)行。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在生長培養(yǎng)基中直接添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)法比將生長培養(yǎng)基離心后再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)法所得到的蛋白表達(dá)量略低。這可能是由于在生長培養(yǎng)基中直接添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)法的培養(yǎng)基中有殘余的甘油,在一定程度上抑制了aox1的表達(dá);同時(shí),酵母利用甘油代謝所產(chǎn)生的乙醇和乙酸可能沒有從培養(yǎng)基中除去[19],也會在一定程度上抑制重組蛋白的表達(dá);酵母生長代謝所消耗的營養(yǎng)成分未得到及時(shí)補(bǔ)充,導(dǎo)致營養(yǎng)成分的缺乏和生長代謝環(huán)境的惡化,因而在生長培養(yǎng)基中直接添加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)法的蛋白表達(dá)量偏低。但是,菌株按這兩種方式所表達(dá)的蛋白量相差不大。而且直接加甲醇誘導(dǎo)表達(dá)法簡化了實(shí)驗(yàn)步驟,降低染菌幾率并節(jié)省試劑;而且以YPD為誘導(dǎo)培養(yǎng)基按第二種方式表達(dá)重組蛋白,成本比BMMY低,所以綜合成本、操作步驟和產(chǎn)量等因素,以YPD為誘導(dǎo)培養(yǎng)基按第二種方式表達(dá)蛋白更方便實(shí)用。MGY培養(yǎng)基比BMGY少了生物素,蛋白表達(dá)量有所下降,但在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中表達(dá)量下降不是很大。FBSH是無機(jī)培養(yǎng)基,雖然其誘導(dǎo)表達(dá)效果不如有機(jī)培養(yǎng)基,但是價(jià)格低廉,從投入和產(chǎn)出的角度來考慮,是高密度發(fā)酵培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)從碳源添加量、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH、誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、不同類型培養(yǎng)基等方面研究了環(huán)境因素對于目的蛋白表達(dá)量的影響,并通過研究發(fā)現(xiàn),BMMY是適合實(shí)驗(yàn)室條件獲得kwPMEI1的培養(yǎng)基,FBSH是適合大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵獲得kwPMEI1的理想培養(yǎng)基。

果膠甲酯酶可催化果膠主鏈脫甲酯化作用,從而產(chǎn)生自由的羧基基團(tuán),同時(shí)釋放出甲醇和氫離子,這將導(dǎo)致細(xì)胞壁周圍環(huán)境pH的下降。由于PMEI與果膠甲酯酶之間可形成1∶1非共價(jià)型可逆的復(fù)合物[2],在pH為3.5～7.5范圍能有效地抑制果膠甲酯酶的活性。將發(fā)酵培養(yǎng)基的上清液和果膠甲酯酶粗提液(調(diào)至pH7.5)以一定比例相互混合作用一段時(shí)間后,再將上述混合溶液加入到一定濃度的果膠溶液(調(diào)至pH7.5)中,觀察溶液pH的變化。如果溶液的pH基本保持不變,則說明發(fā)酵培養(yǎng)基上清液中的果膠甲酯酶抑制劑對果膠甲酯酶的活性起到了一定的抑制作用,因此可以用這種方法來判斷表達(dá)產(chǎn)物是否對果膠甲酯酶具有抑制活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明表達(dá)產(chǎn)物kwPMEI1具有果膠甲酯酶抑制活性。果膠甲酯酶活性和果膠甲酯酶抑制劑的抑制活性以及二者結(jié)合而成的復(fù)合物的穩(wěn)定性,受多種因素的影響[19]。因此,我們后續(xù)將對kwPEMI1的抑制活性特點(diǎn)進(jìn)行研究。

4　結(jié)論

產(chǎn)kwPMEI1畢赤酵母工程菌GS115在搖瓶中的最佳發(fā)酵條件為:3%甘油、1%甲醇、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析純)以體積比為1∶1的比例添加、pH為5.5,誘導(dǎo)時(shí)間為5 d,以BMGY為生長培養(yǎng)基,BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

本研究中獼猴桃的果膠甲酯酶抑制劑基因在巴斯德畢赤酵母GS115中獲得了成功高效表達(dá),在最優(yōu)發(fā)酵條件下kwPMEI1蛋白最高表達(dá)量為700.302 mg/L,說明工程菌GS115產(chǎn)果膠甲酯酶抑制劑具有很大的潛力。同時(shí)研究結(jié)果對該抑制劑的后續(xù)高密度發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)作用。因發(fā)酵罐具有通氣量充足和自動(dòng)控制等優(yōu)勢,一般情況下表達(dá)水平會高于搖瓶,所以在發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)該抑制劑,表達(dá)量有望進(jìn)一步提高。這為利用基因工程技術(shù)大量獲取有生物抑制活性的果膠甲酯酶抑制劑,解決果蔬加工業(yè)面臨的果蔬汁渾濁態(tài)消失的難題打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions for the recombinant kiwi pectin methylesterase inhibitor

LI Xiao-hong1,2,LIU Qian1,WANG Bei1,MEI Xiao-hong1,*

(1.College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China;2.Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442,China)

The recombinant strains GS115 were acquired,which contained multiple copies of kiwi pectin methylesterase inhibitor gene. The effects of concentration of glycerol,the methanol-sorbitol ratio in the feed medium,initial pH,introduction time and the types of culture medium on the yield of kwPMEI1 were analyzed. The optimal conditions were finally established as follows:BMMY medium,five days fermentation with 3%(v/v)glycerol,1%(v/v)methanol,and pH5.5,at the same time,the mixed feeds of sorbitol solution(100%,w/v)and methanol(the volume ratio)was 1∶1. The highest yield of kwPMEI1 was 700.302 mg/L in the above conditions.

pectin methylesterase inhibitor;PichiapastorisGS115;fermentation conditions;optimization

2015-02-09

李曉紅(1987-),女,博士研究生,研究方向:營養(yǎng)與食品安全,E-mail:lixiaohongXHL@163.com。

梅曉宏(1971-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:mxh@cau.edu.cn。

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2010JS079)。

TS202.3

B

1002-0306(2016)03-0160-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.026