新疆野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位抗氧化活性研究

劉　偉,李紫薇,陳文強,朱　燕,歐陽艷

(伊犁師范學院 新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產物化學與應用重點實驗,新疆伊寧 835000)

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新疆野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位抗氧化活性研究

劉偉,李紫薇,陳文強,朱燕,歐陽艷*

(伊犁師范學院 新疆維吾爾自治區(qū)普通高校天然產物化學與應用重點實驗,新疆伊寧 835000)

采用系統(tǒng)溶劑萃取野生櫻桃李枝、葉甲醇提取物,分別得到其石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相,采用分光光度法測定其總酚含量,并通過清除DPPH自由基能力、還原能力、總抗氧化能力等化學模型對各部位的抗氧化活性進行測定。結果表明,野生櫻桃李枝、葉提取物抗氧化活性與其總酚含量呈正相關性,提示酚類化合物為影響其抗氧化活性的主要因素。在三種抗氧化模型下,枝、葉各萃取相均表現(xiàn)一定的抗氧化活性,且具有相似的抗氧化活性規(guī)律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,說明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生櫻桃李枝、葉抗氧化成分,其中樹枝乙酸乙酯相抗氧化活性著高于BHA。說明野生櫻桃李枝、葉提取物具有作為天然抗氧化劑的開發(fā)價值。

野生櫻桃李，抗氧化活性，總酚，高效液相色譜

野生櫻桃李(PrunusdivaricataLdb.),俗稱野酸梅,薔薇科李屬,落枝灌木或小喬木[1]。植株高1.5～8.0 m,多分枝,枝條細長,開展形,枝繁茂,深綠色[2],主要分布于中亞天山、高加索、小亞細亞及巴爾干半島,在我國僅分布于新疆伊犁霍城縣的大西溝和小西溝[3]。本地哈薩克牧民長期食用櫻桃李果醬或將果實曬干泡茶飲用,被譽為“雪域珍果”[4],具有天然的保健功能和開發(fā)前景。大量研究表明,具有抗氧化活性的物質可以有效的降低心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生概率,并可以有效的延緩衰老[5-6]。國內學者對野生櫻桃李的研究多集中在生態(tài)、栽培及果實營養(yǎng)成分等方面[7-8]。對其有效成分的提取與活性研究近年來才逐步開展,其中野生櫻桃李果皮色素和果肉總酚提取物均表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性[9-10],對于野生櫻桃李枝、葉提取物抗氧化活性的研究鮮有報道。實驗采用系統(tǒng)溶劑法分別萃取野生櫻桃李枝、葉的甲醇提取物,得到相應的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取相,采用分光光度法測定各萃取相中總酚的含量,通過清除DPPH自由基能力、還原能力、總抗氧化能力等化學模型對各部位的抗氧化活性進行了評價,分析其總酚含量與抗氧化活性之間的相關性,并對活性較好的部位進行HPLC分析,為該植物的綜合開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生櫻桃李枝、葉于新疆伊犁霍城縣大西溝10月采摘,經伊犁師范學院資源與生態(tài)研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李枝與葉,洗凈后自然晾干、粉碎過60目篩備用。

1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)長城生物化學工程有限公司;VC、BHA、福林酚試劑Sigma公司;沒食子酸中國藥品生物制品檢定所;山奈酚標準品分析標準品(≥98%,國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鋁、三氯乙酸、氯化鐵、濃硫酸、鉬酸銨、磷酸鈉等均為分析純。

LC-20A高效液相色譜儀日本島津公司;UV-2550紫外可見分光光度計日本島津分析儀器廠;FA2104電子天平上海舜宇恒平科學儀器有限公司;DD-5M型低速離心機湘儀離心機有限公司;SY-2000旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵上海亞榮生化儀器廠;BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1野生櫻桃李枝、葉不同萃取部位提取工藝參照翁文江等方法[11],分別稱取備用野生櫻桃李枝(2.0 kg)與葉(1.0 kg),以甲醇室溫下浸提3次(每次7 d),合并濾液減壓濃縮得樹枝總浸膏176 g,樹葉總浸膏193 g。分別將浸膏懸浮于300 mL蒸餾水中,加入等量的石油醚,搖勻3 min,放氣后靜置1 h,收集上層石油醚萃取物。下層水相同法萃取2次,合并萃取液,剩余水相按照上述方法依次用等量的乙酸乙酯、正丁醇萃取。將所得濾液濃縮、冷凍干燥至恒重,得樹枝石油醚萃取物(PBPE,7.73 g)、樹枝乙酸乙酯萃取物(PBEA,9.88 g)、樹枝正丁醇萃取物(PBBU,8.27 g);樹葉石油醚萃取物(PLPE,8.36 g)、樹葉乙酸乙酯萃取物(PLEA,5.52 g)、樹葉正丁醇萃取物(PLBU,3.45 g),保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2總酚含量的測定參照張毛莉等方法[12]制作標準曲線。分別取不同濃度的各萃取相溶液1 mL于25 mL比色管中,加入1.0 mL福林酚試劑,搖勻靜置4 min,加入2 mL 7.5 g/L碳酸鈉溶液,蒸餾水定容。將上述溶液避光室溫放置2 h,以蒸餾水為空白參比,在760 nm波長處測定吸光度。取吸光度在線性范圍內的數(shù)據(jù),根據(jù)標準曲線測定各組分的總酚含量(以沒食子酸計)。

1.2.3清除DPPH自由基實驗參照陳乃東等方法[13]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、VC與BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,分別加入0.5 mL濃度0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液,將混合液用乙醇定容到5 mL,取0.5 mL DPPH緩沖液用乙醇定容到5 mL做對照實驗。室溫下避光放置30 min,以乙醇溶液做空白實驗,測定混合物在517 nm處的吸光度,每組樣品進行三次平行實驗。DPPH自由基清除率按如下公式計算:

式中:A1為DPPH緩沖液的吸光度,A2為加入受試樣品后DPPH混合液的吸光度。

1.2.4還原能力測定參照文獻方法[14]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.05,0.1,0.15,0.2,0.25 mg/mL)的各萃取物、BHA 2.5 mL于10 mL比色皿中,分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀(1%)。將混合物放置到50 ℃的水浴中保溫20 min后,加2.5 mL三氯乙酸,3000 r/min離心10 min,取2.5 mL上清液分別加入2.0 mL蒸餾水和0.5 mL氯化鐵溶液(0.1%),以乙醇溶液做空白實驗,測定混合物在700 nm處的吸光度,每組樣品進行三次平行實驗。

1.2.5總抗氧化能力的測定參照周壽然等方法[15]并稍加修改:分別量取系列濃度(0.15,0.2,0.25,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL)的各萃取物、BHA 0.5 mL于10 mL比色皿中,加入4.5 mL磷鉬酸緩沖溶液,取0.5 mL乙醇和4.5 mL試劑溶液做空白對照,混勻后在95 ℃水浴中保溫1.5 h,在695 nm處測定吸光度,每組樣品進行三次平行實驗。

1.2.6PLEA水解條件參考張英等[16]方法,將10 mg的PLEA溶于10 mL甲醇,加入2 mL 4 moL/mL的鹽酸水溶液,70 ℃水浴下低速攪拌1.5 h,停止反應。

1.2.7色譜條件InertSustain C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫25 ℃;流動相水(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～10 min,40%～45% B,10～30 min,45%～80% B,30～50 min,80%～60% B),流速0.8 mL/min,檢測波長254 nm,進樣量20 μL。

2　結果與分析

2.1野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量

按照1.2.2的方法,以質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程:Y=0.01272+0.01069X(R2=0.9990),表明樣品檢測濃度在19.75～69.25 μg/mL內線性關系良好。根據(jù)標準曲線計算野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量列于表1。

由表1可知,各萃取相均含有酚類物質,其中野生櫻桃李枝與葉的乙酸乙酯萃取物中總酚含量最高,分別為(263.76±3.08) mg/g和(220.48±4.86) mg/g,正丁醇相次之,提示野生櫻桃李枝與葉萃取物中富含中等極性酚類物質。石油醚萃取物中總酚含量較少,各萃取相總酚含量存在顯著性差異。

2.2野生櫻桃李枝、葉各萃取相抗氧化實驗結果

表1　野生櫻桃李枝、葉各萃取相的總酚含量Table 1　Contents of total phenols in the extracts from Prunus divaricata Ldb Branches and Leaves

注:同行字母不同表示數(shù)據(jù)存在差異(p<0.05)。

2.2.1清除DPPH自由基活性在多種快速評估抗氧化活性的方法中,清除DPPH自由基模型與其它方法相比更為廣泛使用。由圖1可知,在測定濃度范圍內,各受試樣清除DPPH自由基活性差異顯著。當供試質量濃度小于0.6 mg/mL時,各萃取相活性與濃度量效關系明顯,其中活性較好的萃取相為PBEA、PBBU、PLEA。在質量濃度為0.6 mg/mL時,三者對DPPH清除率分別為91.9%、90.7%、82.1%,遠高于BHA活性(34.7%),與VC活性(96.2%)接近,此后三者活性呈濃度飽和型特征。其余萃取相在測試濃度內,呈現(xiàn)出濃度依賴性。在同等供測質量濃度下,PLBU活性較BHA活性好,PBPE活性與BHA活性相近,PLPE活性最差,在質量濃度為1.0 mg/mL時最高清除率僅為33.5%。

圖1　待測物清除DPPH活性Fig.1　DPPH scavenging activity of the test compounds

2.2.2還原能力大多數(shù)化合物的還原能力可以看作是其潛在抗氧化活性的重要指標。由圖2可知,在測定濃度范圍內,PBEA和PBBU表現(xiàn)出較強的還原能力,顯著高于其它萃取物與BHA。PLEA和PLBU表現(xiàn)出與BHA相近的還原能力,且還原能力隨著濃度的增大而不斷增大,量效關系較為明顯。樹枝與樹葉石油醚相還原能力較差,推測其含有的酚類化合物極性較小,還原能力較弱;乙酸乙酯相與正丁醇相含有中等極性的酚類化合物,具有較好的還原能力。

圖2　待測物的還原能力Fig.2　 Reducing power of the test compounds

2.2.3總抗氧化活性由圖3可知,各萃取相之間總抗氧化活性差異顯著。在測定質量濃度下,PLPE總抗氧化活性最差,PLBU、PBPE與BHA總抗氧化活性相近;其余萃取相總抗氧化活性均高于BHA,強弱順序為PBBU

圖3　待測物的總抗氧化能力Fig.3　Total antioxidant capacity of the test compounds

2.3野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與抗氧化相關性分析

有研究表明,櫻桃李等核果中的抗氧化活性與總酚含量緊密相關[10]。本研究參考邱高翔等[17]方法,考察了不同萃取相的抗氧化活性與其所含總酚的相關性。野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與DPPH自由基清除活性、總抗氧化活性之間存在顯著的相關性,相關系數(shù)均大于0.9,說明總酚為野生櫻桃李枝、葉抗氧化作用的主要活性成分,且總酚含量越高其活性越好。野生櫻桃李枝、葉各萃取相總酚含量與還原能力之間的相關系數(shù)分別為0.783和0.705,推測是各萃取相酚類化合物構成差異大,導致總酚含量與還原能力相關性不顯著。

2.4野生櫻桃李枝、葉乙酸乙酯相化學成分HPLC初步分析

基于活性實驗篩選結果,實驗選取活性較優(yōu)的PBEA與PLEA為研究對象,利用HPLC-DAD法對其化學成分進行了初步的分析,結果如圖4、圖5所示。

圖4　PBEA(A)和PLEA(B)的HPLC譜圖Fig.4　HPLC spectrum of PBEA(A)and PLEA(B)

圖5　乙酸乙酯萃取物典型紫外吸收譜圖Fig.5　The typical UV spectrum of ethyl acetate extract

在相同的HPLC色譜條件下,由圖4可知樹枝與樹葉乙酸乙酯萃取物化學成分構成差異顯著,PBEA極性相對較大,圖4A中峰1～峰6紫外吸收譜圖相似,表現(xiàn)為圖5所示紫外譜圖,最大吸收峰出現(xiàn)在230 nm與280 nm附近,推測為一類物質。圖4A中峰7與圖4B峰1～峰5紫外吸收譜圖相似,表現(xiàn)為圖5所示紫外譜圖,最大吸收峰出現(xiàn)在265 nm與347 nm附近,為山奈酚糖苷類化合物的典型紫外吸收波長[18-19]。按照1.2.6實驗方法將PLEA水解產物與山奈酚標準品經TLC和HPLC比對,證實PLEA水解產物以山奈酚為主要成分。各萃取相成分分析還需進一步分離純化與鑒定。

3　結論

實驗結果表明野生櫻桃李枝、葉提取物均具有一定的抗氧化活性,且呈濃度依賴性。枝、葉各萃取相抗氧化活性呈現(xiàn)相似的規(guī)律:乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相,說明乙酸乙酯和正丁醇可以有效地富集野生櫻桃李枝、葉抗氧化成分。不同萃取相的DPPH自由基清除活性、總抗氧化活性與其所含總酚量呈顯著相關性,但還原能力與總酚含量相關系數(shù)小于0.9,推測不同萃取相酚類化合物構成差異較大,結構存在差異的物質對不同體系的抗氧化作用可能不同。樹枝各萃取相抗氧化活性較相應的葉萃取相高,其中樹枝乙酸乙酯相抗氧化活性最好,顯著高于BHA。經HPLC初步分析,樹枝與樹葉乙酸乙酯萃取物化學成分構成差異顯著,且各自所含化合物的極性相近,因此分離純化過程會相對復雜。關于野生櫻桃李枝、葉提取物成分分離純化、活性構效關系還有待進一步研究。

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Study on antioxidant activity of different parts partitioned fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves in Xinjiang

LIU Wei,LI Zi-wei,CHEN Wen-qiang,ZHU Yan,OUYANG Yan*

(University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang,Yili Normal University,Xinjiang Yining 835000,China)

The petroleum extract,ethyl acetate extract and n-butanol extract ofPrunusdivaricataLdb branches and leaves were obtained by systematic solvent extraction,and their antioxidant activities were evaluated by scavenging activity of DPPH radicals,reducing power and total antioxidant activity. The total phenolic content in the obtained extracts were measured. The results showed that the antioxidant activities of the extracts were positively correlated to their total phenolic content,it showed that total phenolic content were main factors for the antioxidant activities. Each part of extracts had antioxidant activities and similar tendency,the ethyl acetate extract displayed the strongest activity,followed by n-butanol extract and the petroleum extract. This indicated that the ethyl acetate extract and n-butanol extract were rich in antioxidant components. The ethyl acetate extract of branches had the strongest activity,remarkably higher than that of BHA. The total phenolic content fromPrunusdivaricataLdb branches and leaves could be produced as natural antioxidants.

PrunusdivaricataLdb;antioxidant activity;total phenolic content;HPLC

2015-06-05

劉偉(1985-)，碩士，實驗師，研究方向：天然產物化學，E-mail:nculiuwei@126.com。

歐陽艷(1965-)，博士，教授，研究方向：天然產物研究、有機合成，E-mail:ylsyoyy@126.com。

新疆維吾爾自治區(qū)高?？蒲杏媱澷Y助(XJEDU2014S061)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)03-0119-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.016