左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

孟盼，趙洪慶，杜青，王宇紅，楊蕙，張秀麗，徐雅嵐.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 4008；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 40007

左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

孟盼1，趙洪慶1，杜青1，王宇紅1，楊蕙2，張秀麗1，徐雅嵐1
1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

目的 觀察左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及海馬 JNK、Bcl-2、Bax表達(dá)的影響，探討其對糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠海馬損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 采用高脂飼料灌胃聯(lián)合尾靜脈注射鏈脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型，繼續(xù)給予28 d慢性應(yīng)激建立糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型。實驗大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組及左歸降糖解郁方高、中、低劑量組。末次給藥后，采用Morris水迷宮測試大鼠逃避潛伏期時間，Western blot檢測海馬JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測JNK、Bcl-2、Bax基因表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01），JNK、Bax蛋白及基因表達(dá)明顯上升，Bcl-2表達(dá)明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01），JNK、Bax蛋白及基因表達(dá)均明顯下降，Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 左歸降糖解郁方能明顯改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與抑制海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

左歸降糖解郁方；糖尿病并發(fā)抑郁癥；神經(jīng)元凋亡；JNK；Bcl-2；Bax；大鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.019

糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為主要特征的代謝性疾病，易引發(fā)多種并發(fā)癥。其中，糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）是其危害最大、自殺率最高的慢性并發(fā)癥之一［1］。本課題組前期研究表明，DD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶部位主要位于大腦海馬區(qū)，表現(xiàn)為海馬神經(jīng)元萎縮、凋亡、可塑性降低［2-3］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的JNK可以通過磷酸化作用直接調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員，如B細(xì)胞淋巴瘤/Bcl-2、Bax等活性，從而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［4］。左歸降糖解郁方是以張仲景的左歸飲、左歸丸化裁而得的左歸降糖方為基本方，加入化瘀行氣、疏肝解郁的姜黃、貫葉連翹而得，全方共奏滋陰益氣、化瘀解郁的功效。研究表明，其能明顯改善DD大鼠的抑郁行為，并對海馬損傷起到保護(hù)作用［5］。本實驗采用Western blot和RT-PCR分別檢測JNK、Bcl-2、Bax蛋白及基因的表達(dá)，探討左歸降糖解郁方對DD大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響，為臨床防治DD提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1動物及飼料

7～8周齡雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量180～220 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實驗動物中心，室溫（25±1）℃、相對濕度（50±5）%。高脂乳劑配方：20%豬油、10%膽固醇、2%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、20%吐溫 80、20%丙二醇。

1.2藥物

左歸降糖解郁方由貫葉連翹、黃芪、姜黃、熟地黃、枸杞子、山萸肉、菟絲子、杜仲、牡丹皮、丹參、牛膝等組成，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。鹽酸二甲雙胍片，0.25 g/片，湖南湘雅制藥公司，批號1402115；鹽酸氟西汀膠囊，20 mg/粒，法國Patheon公司，批號2087A。

1.3主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國 Sigma公司；JNK、Bcl-2、Bax單克隆抗體，Abcam公司；NC膜，美國millipore公司；RIPA組織細(xì)胞快速裂解液，上海基爾頓生物科技有限公司；Trizol試劑，Life technolgies公司；SYBR MasterMix（Cat：CTB103）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat：CTB101），江蘇楚天生物科技有限公司。動物行為學(xué)習(xí)記憶系統(tǒng)（Viewpoint），DVP-W7顯微鏡圖像處理系統(tǒng)（南京長城信息系統(tǒng)公司），5417R冷凍離心機(jī)（Eppendorf），GS-6R離心機(jī)（Beckman），Lightcycler 480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR儀（Roche），Mini Protean 3 cell電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 實驗方法

2.1造模

75只正常大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為2組，其中10只作為空白組，其余65只大鼠進(jìn)行糖尿病造模。糖尿病模型制備方法為14 d高脂飼料（10 mg/kg）灌胃聯(lián)合小劑量STZ（38 mg/kg）尾靜脈注射，造模3 d后，大鼠禁食不禁水6 h，測定空腹血糖。剔除造模過程中死亡的大鼠，選取空腹血糖≥16.00 mmol/L者作為糖尿病模型大鼠，按血糖值隨機(jī)分為模型組、陽性藥組和左歸降糖解郁方高、中、低劑量組（簡稱中藥高、中、低劑量組）。其中模型組與陽性藥組各11只，其余3組各12只。繼續(xù)給予糖尿病模型大鼠慢性不可預(yù)見性應(yīng)激，應(yīng)激方法包括4 ℃冰水浴、45 ℃熱刺激、電擊、傾籠、噪音、潮濕墊料、晝夜顛倒、夾尾，每日采用1種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)28 d，期間大鼠均孤籠飼養(yǎng)［6］。

2.2給藥

實驗用藥均自行配制，取鹽酸二甲雙胍片8片和鹽酸氟西汀膠囊1粒溶于111 mL蒸餾水即得所需陽性藥物濃度，實驗所需復(fù)方中藥用所購飲片煮煎并濃縮至實驗濃度，高、中、低劑量（32.82、16.41、8.20 g/kg）分別相當(dāng)于原藥材4.56、2.28、1.14 g/mL。各組大鼠于造模同時灌胃給藥10 mL/kg，空白組和模型組給予等量蒸餾水。末次給藥結(jié)束后大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，取腦，剝離海馬，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮被均分為4個象限，平臺置于西南象限水下2 cm。給藥24 d后，對所有大鼠進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，訓(xùn)練時大鼠從平臺另側(cè)面向池壁放入，2 min內(nèi)找到平臺則訓(xùn)練結(jié)束，未找到平臺大鼠則將其引導(dǎo)至平臺，停留數(shù)秒。連續(xù)訓(xùn)練4 d，于第5日進(jìn)行水迷宮測試，記錄大鼠逃避潛伏期。

2.4Western blot檢測JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

取冷凍保存的海馬組織，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上勻漿，離心取上清液制備組織蛋白提取液，保存待用。檢測大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax的表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。應(yīng)用Image J圖像處理軟件對條帶進(jìn)行掃描，測定灰度值，計算各組目的蛋白的相對表達(dá)量。2.5 RT-PCR檢測JNK、Bcl-2、Bax基因表達(dá)

取-80 ℃冷凍保存的海馬組織，加入Trizol試劑，冰上勻漿，按RNA提取步驟提取海馬組織總RNA，抽提總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。42 ℃、1 h， 75℃、5 min以合成cDNA。PCR反應(yīng)擴(kuò)增JNK、Bcl-2、Bax基因產(chǎn)物，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，共45個循環(huán)。用2-??Ct法進(jìn)行基因表達(dá)差異數(shù)據(jù)分析，?Ct=Ct目標(biāo)基因-Ct參比基因，2-??C= 2-?Ct（待測組樣品基因）÷2-?Ct（對照組樣品基因）。引物自行設(shè)計，深圳華大基因公司合成，見表1。

表1　RT-PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1左歸降糖解郁方對模型大鼠逃避潛伏期的影響

與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較（±s，s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別 　只數(shù) 　 逃避潛伏期空白組 　10 　 23.56± 7.24模型組 　10 　 79.82±16.32**陽性藥組 　10 　 28.18±13.57##中藥高劑量組 　10 　 31.00±11.79##中藥中劑量組 　10 　 61.12±23.53中藥低劑量組 　10 　 74.40±16.42

4.2左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬JNK、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高劑量組大鼠海馬JNK、Bax蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖1。

表3　各組大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

表3　各組大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 　只數(shù) JNK 　 Bcl-2 　 Bax空白組 　8 0.07±0.01 　0.67±0.03 　0.09±0.04模型組 　8 1.14±0.30**0.25±0.01*0.74±0.12**陽性藥組 　8 0.19±0.06##　0.64±0.01#　0.16±0.06##中藥高劑量組　8 0.38±0.11#　0.63±0.05#　0.31±0.12#中藥中劑量組　8 0.52±0.25 　0.54±0.12 　0.46±0.06中藥低劑量組　8 1.10±0.28 　0.51±0.17 　0.54±0.03

圖1　各組大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

4.3左歸降糖解郁方對模型大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬JNK、Bax基因表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯下降（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和中藥高劑量組大鼠海馬JNK、Bax基因表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見表4。

表4　各組大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax基因表達(dá)比較（±s）

表4　各組大鼠海馬JNK、Bcl-2、Bax基因表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 　只數(shù) JNK 　 Bcl-2 　 Bax空白組 　8 1.00±0.00 　1.00±0.00 　1.00±0.00模型組 　8 2.42±0.25**　0.42±0.11**1.53±0.34**陽性藥組 　8 1.51±0.27##　0.81±0.07##　1.14±0.07#中藥高劑量組　8 1.52±0.07##　0.83±0.06##　1.08±0.13##中藥中劑量組　8 1.82±0.34 　0.72±0.13 　1.41±0.36中藥低劑量組　8 1.85±0.26 　0.62±0.08 　1.46±0.29

5 討論

Morris水迷宮主要用于考察實驗動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力，廣泛應(yīng)用于與大腦海馬組織病變相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。Morris水迷宮測試結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，表明DD狀態(tài)下大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能受到嚴(yán)重?fù)p害，予左歸降糖解郁方干預(yù)后，其逃避潛伏期明顯縮短，學(xué)習(xí)記憶能力得到改善。海馬組織作為大腦邊緣系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。本課題組前期研究表明，DD大鼠海馬萎縮嚴(yán)重，神經(jīng)元功能低下，胞體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒嚴(yán)重，線粒體內(nèi)嵴消失［2，7］。因此我們推測，左歸降糖解郁方改善DD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其保護(hù)海馬組織損傷密切相關(guān)。

JNK能介導(dǎo)多種疾病引發(fā)的神經(jīng)元凋亡，其能通過非轉(zhuǎn)錄依賴的方式直接調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)靶蛋白 Bax、Bcl-2等的活性而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［8］。Bcl-2是一種抗細(xì)胞凋亡因子，能阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，抑制細(xì)胞凋亡，并且還可以通過抗氧化作用或抑制氧自由基產(chǎn)生來阻止細(xì)胞凋亡，阻斷細(xì)胞死亡級聯(lián)［9］。有研究表明，Bcl-2在海馬神經(jīng)元凋亡損傷過程中起重要作用［10］。Bax是一種與Bcl-2功能相反的基因，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax之間的平衡能決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡［11］。Jafari等［12］研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海馬Bax/BcL-2表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡增加。Yang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，慢性不可預(yù)見性應(yīng)激大鼠海馬存在著Bax蛋白的上調(diào)和Bcl-2蛋白的下調(diào)。本實驗結(jié)果表明，DD大鼠JNK、Bax蛋白及基因表達(dá)明顯上升，Bcl-2表達(dá)下降，予左歸降糖解郁方干預(yù)后，JNK、Bax表達(dá)明顯下降，Bcl-2上升。上述結(jié)果表明，左歸降糖解郁方能通過抑制 JNK的表達(dá)，調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax之間的平衡，起到抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用。

DD繼發(fā)于糖尿病，其中醫(yī)病機(jī)可用“虛、瘀、郁”概括，表現(xiàn)為氣陰兩虛、瘀阻腦絡(luò)、血瘀肝郁、情志異常等。本研究結(jié)果表明，予左歸降糖解郁方干預(yù)后，DD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能改善，其治療作用可能與抑制海馬神經(jīng)元凋亡，保護(hù)海馬組織密切相關(guān)。

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（修回日期：2015-12-17；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on Hippocampal Neuronal Apoptosis in Diabetic Rats with Depression

MENG Pan1， ZHAO Hong-qing1， DU Qing1， WANG Yu-hong1， YANG Hui2， ZHANG Xu-li1，XU Ya-lan1（1. Hunan University of Chinese Medicine， Training Bases， Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Objective To observe the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula （ZJJF） on the ability of learning and memory and the expressions of JNK， Bcl-2 and Bax in hippocampus in diabetic rats with depression； To explore the protective mechanism of hippocampal damage in diabetic rats with depression. Methods High-fat gavage combined with intravenous injection of STZ was used to establish the model of diabetic rats. 28 days of chronic stress was given continuously and diabetic rats complicated with depression were built successfully. Then rats were randomly divided into 6 groups， including normal， model， positive medicine， high-， medium-， and low-dose of ZJJF groups. After the last administration， Morris water maze was used to detect escape latency time； Western blot was used to disclose the protein expressions of JNK， Bcl-2 and Bax in rat hippocampaus； RT-PCR was used to test the gene expressions of JNK and Bcl-2 and Bax. Results Compared with the normal group， escape latency time in model rats was significant longer （P＜0.01）， the protein and gene expression of JNK and Bax in rat hippocampaus significantly increased， Bcl-2 was markedly decreased （P＜0.05， P ＜0.01）； Compared with the model group， escape latency time in positive medicine group and high-dose of ZJJF group was significant shorter （P＜0.01）， the protein and gene expressions of JNK and Bax significantly decreased， and Bcl-2 markedly increased （P＜0.05， P＜0.01）. Conclusion ZJJF can significantly improve the ability of learning and memory in diabetic rats with depression， which might be associated with preventing neuronal apoptosis in hippocampus.

Zuogui Jiangtang Jieyu Formula； diabetes with depression； neuronal apoptosis； JNK； Bcl-2； Bax； rats

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0078-04

國家自然科學(xué)基金（81373578、81403379、81573965）

王宇紅，E-mail：573643177@qq.com

2015-11-30）