BALB/c小鼠陰虛型過(guò)敏性哮喘模型的建立與評(píng)價(jià)

王志旺，妥海燕，任遠(yuǎn)，李榮科，劉雪楓，程小麗.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

BALB/c小鼠陰虛型過(guò)敏性哮喘模型的建立與評(píng)價(jià)

王志旺1，2，妥海燕1，任遠(yuǎn)1，2，李榮科1，劉雪楓1，程小麗1
1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

目的 建立BALB/c小鼠陰虛型過(guò)敏性哮喘模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 采用腹腔注射與皮下注射卵清白蛋白（OVA）致敏、霧化吸入OVA激發(fā)的方法復(fù)制過(guò)敏性哮喘BALB/c小鼠模型，激發(fā)后期合并灌胃甲狀腺素復(fù)制陰虛型過(guò)敏性哮喘模型。在監(jiān)測(cè)飲食、飲水及體質(zhì)量的基礎(chǔ)上，對(duì)支氣管激發(fā)過(guò)程中哮喘行為學(xué)、肺功能及肺組織病理學(xué)等哮喘相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行觀測(cè)，同時(shí)對(duì)cAMP、cGMP及肺液清除功能等陰虛證相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行考察。結(jié)果 陰虛哮喘模型組小鼠出現(xiàn)明顯的哮喘癥狀，哮喘行為學(xué)綜合評(píng)分明顯升高，吸氣峰流量、呼氣峰流量、潮氣量明顯下降，呼吸頻率增加，肺組織病理學(xué)可見(jiàn)明顯的炎癥反應(yīng)；同時(shí)，陰虛哮喘模型組小鼠進(jìn)食與飲水量明顯增加，而體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，肺組織濕重/干重比值下降，血清cAMP及cAMP/cGMP升高，cGMP下降，顯示小鼠處于陰虛而陽(yáng)相對(duì)亢盛的狀態(tài)。結(jié)論 在OVA致敏、激發(fā)的基礎(chǔ)上給予甲狀腺素，可成功復(fù)制BALB/c小鼠陰虛型過(guò)敏性哮喘模型。

陰虛型過(guò)敏性哮喘；動(dòng)物模型；BALB/c小鼠

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.015

近年來(lái)，隨著環(huán)境污染與過(guò)敏體質(zhì)人群的增加，過(guò)敏性哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“哮喘”）的發(fā)病率明顯增加［1］；另一方面，隨著社會(huì)觀念的變化，偏瘦體質(zhì)的人（特別是女性）越來(lái)越多，導(dǎo)致陰虛質(zhì)偏頗體質(zhì)人群迅速增加［2］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)陰虛型過(guò)敏性哮喘模型展開(kāi)研究，為該動(dòng)物模型的建立及其評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量 16～20 g，蘭州獸醫(yī)研究所，動(dòng)物許可證號(hào)62000600000082。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施使用號(hào)00000115。

1.2藥物、試劑與儀器

甲狀腺片，山東中泰藥業(yè)有限公司，批號(hào)14080303。卵清白蛋白（OVA）、氯化乙酰膽堿、組胺，Sigma公司；cAMP、cGMP ELISA測(cè)試盒，成都光?？萍加邢薰荆粴溲趸X，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。402AI型超聲霧化器，江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；鼻部暴露/全身暴露吸入染毒系統(tǒng)，CH Technologies；EMKA型動(dòng)物肺功能檢測(cè)系統(tǒng)，北京廣源達(dá)科技發(fā)展有限公司；TGL-16G型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722型分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；BI-2000型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1分組、造模與給藥

實(shí)驗(yàn)小鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組、陰虛模型組、哮喘模型組和陰虛哮喘模型組，每組12只。自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

實(shí)驗(yàn)第1日開(kāi)始致敏，即哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠每只腹腔注射配制的新鮮致敏液（OVA 100 μg+氫氧化鋁3 mg生理鹽水混懸液）0.2 mL，同時(shí)背部皮下注射等量致敏液，正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替致敏液；第8日同法再致敏1次。第15日開(kāi)始激發(fā)，將小鼠置于暴露系統(tǒng)中，加入激發(fā)液（1%OVA），調(diào)節(jié)霧化速度至2 mL/min，使小鼠均勻吸入激發(fā)液20 min，隔日1次，連續(xù)28 d，正常組與陰虛模型組以生理鹽水代替激發(fā)液［3-4］。第29日開(kāi)始，陰虛模型組與陰虛哮喘模型組小鼠給予甲狀腺片藥液120 mg/kg（用0.5%黃原膠助懸）灌胃，正常組與哮喘模型組給予生理鹽水20 mL/kg灌胃，1次/d，連續(xù)14 d［5］。

2.2指標(biāo)觀察

2.2.1一般狀況 觀測(cè)動(dòng)物體質(zhì)量、呼吸、飲食、飲水等。

2.2.2支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第28、42日進(jìn)行支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)。配制含0.2%組胺與2%乙酰膽堿的混合激發(fā)液，在暴露系統(tǒng)中按2 mL/min霧化，小鼠吸入120 s。從霧化吸入開(kāi)始觀察10 min內(nèi)小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)指標(biāo)并評(píng)分：無(wú)抓鼻或撓癢動(dòng)作計(jì)0分，抓鼻或撓癢出現(xiàn)1～3次計(jì)1分，4～6次計(jì)2分，7次及以上計(jì)3分；小鼠無(wú)哮喘癥狀計(jì)0分，出現(xiàn)輕微哮喘癥狀計(jì)3分，出現(xiàn)呼吸急促、或呼吸頻率明顯加快或焦躁不安等哮喘癥狀計(jì)6分，出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難如急促點(diǎn)頭、腹式呼吸等哮喘癥狀計(jì)9分［6］。

2.2.3肺功能檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)第42日，將小鼠置于肺功能檢測(cè)系統(tǒng)中，啟動(dòng)系統(tǒng)，在時(shí)間與事件模式下測(cè)定小鼠肺功能。

2.2.4離體指標(biāo)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第43日，麻醉小鼠，摘眼球取血，分離血清，測(cè)定cAMP、cGMP水平。斷頸處死，小鼠摘取肺臟，于固定位置取肺組織2份。第1份經(jīng)固定、切片、HE染色，鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，對(duì)支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度進(jìn)行半定量分析［7-8］；第2份準(zhǔn)確稱(chēng)量濕重，充分干燥至衡重后稱(chēng)取干重，計(jì)算濕重/干重比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1陰虛哮喘小鼠進(jìn)食量、飲水量及體質(zhì)量變化

正常組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飲食飲水無(wú)明顯變化，體質(zhì)量正常增長(zhǎng)；與正常組比較，陰虛模型組和陰虛哮喘模型組小鼠第42日進(jìn)食量、飲水量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01），但體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，顯示出多飲多食、代謝水平升高等陰虛證的癥狀；哮喘模型組小鼠飲水量明顯增加（P＜0.05）；提示陰虛與哮喘均可使飲水量增加，哮喘模型小鼠飲水量增加的原因可能與哮喘咳嗽、咽干口燥而致飲水增加有關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1　各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

表1　各組小鼠體質(zhì)量比較（±s，g）

注：與正常組比較，**P＜0.05

組別 　只數(shù)　第1日 　第42日正常組 　12　17.3±1.1 　21.9±1.8陰虛模型組 　12　17.0±1.2 　18.7±1.4**哮喘模型組 　12　17.7±1.3 　19.6±1.6**陰虛哮喘模型組　12　17.1±1.2 　18.5±1.5**

表2　各組小鼠第42日進(jìn)食量、飲水量比較（±s）

表2　各組小鼠第42日進(jìn)食量、飲水量比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陰虛哮喘模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01（下同）

組別 　只數(shù)　進(jìn)食量/g 　飲水量/mL正常組 　12　3.9±0.6 　6.1±0.9陰虛模型組 　12　5.1±0.9**　8.5±1.4**△哮喘模型組 　12　3.5±0.5 　7.1±1.2*△△陰虛哮喘模型組　12　4.6±0.7*　10.1±1.6**

4.2陰虛哮喘小鼠血清cAMP、cGMP及其比值變化

與正常組比較，陰虛模型組、陰虛哮喘模型組小鼠血清cAMP及cAMP/cGMP顯著升高，cGMP明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　各組小鼠血清cAMP、cGMP和cAMP/cGMP比較（±s）

表3　各組小鼠血清cAMP、cGMP和cAMP/cGMP比較（±s）

組別 　只數(shù) cAMP/（pmol/L） cGMP/（pmol/L） cAMP/cGMP正常組 　12 40.57±5.16 　12.20±1.80 　3.39±0.67陰虛模型組 　12 55.85±5.46**10.77±1.19*　5.26±0.91**哮喘模型組 　12 44.70±5.49 　11.76±1.48 　3.87±0.73陰虛哮喘模型組 　12 58.09±6.79**10.32±1.06**5.68±0.86**

4.3陰虛哮喘小鼠支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)哮喘行為學(xué)變化

與正常組比較，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組吸入混合激發(fā)液后哮喘行為學(xué)綜合評(píng)分顯著升高，哮喘動(dòng)物數(shù)明顯增加（P＜0.01），而陰虛模型組未出現(xiàn)明顯異常。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　各組小鼠支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)哮喘行為學(xué)比較（±s）

表4　各組小鼠支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)哮喘行為學(xué)比較（±s）

第28日 　　第42日組別 　只數(shù)哮喘只數(shù) 綜合評(píng)分 哮喘只數(shù) 綜合評(píng)分正常組 　12　 0 　1.8±0.8 　 0 　1.9±0.7陰虛模型組 　12　 1 　1.9±1.0 　 1 　2.1±1.2哮喘模型組 　12　 7**　3.8±1.4**9**　5.4±1.9**陰虛哮喘模型組　12　 8**　4.1±1.7**11**　5.9±2.3**

4.4陰虛哮喘小鼠肺通氣變化

結(jié)合動(dòng)物肺功能儀檢測(cè)指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)哮喘小鼠吸氣峰流量（PIF）、呼氣峰流量（PEF）、潮氣量（TV）與呼吸頻率（F）等肺功能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。與正常組比較，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠PIF、PEF、TV顯著下降，而F顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　各組小鼠肺通氣指標(biāo)比較（±s）

表5　各組小鼠肺通氣指標(biāo)比較（±s）

組別 　只數(shù) 　 PIF/（mL/s） 　 PEF/（mL/s） 　TV/μL 　 F/bpm正常組 　12 　 67.10±8.46 　112.94±29.92 　123±22 　117.78±15.24陰虛模型組 　12 　 63.65±8.45 　116.75±31.47 　128±19 　121.25±15.47哮喘模型組 　12 　 46.95±5.65**　 62.98±12.90**　89±12**　168.84±21.78**陰虛哮喘模型組 　12 　 43.83±4.66**　 68.13± 8.90**　91±13**　174.65±24.07**

4.5陰虛哮喘小鼠肺液清除功能變化

本實(shí)驗(yàn)在復(fù)制慢性哮喘模型過(guò)程中，哮喘模型組、陰虛哮喘模型組小鼠肺組織濕重/干重比值顯著下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），陰虛模型組小鼠肺組織濕重/干重比值有一定的下降趨勢(shì)，但與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6　各組小鼠肺液清除功能比較（±s）

組別 　只數(shù) 　 濕重/干重正常組 　12 　 5.29±0.90陰虛模型組 　12 　 4.83±0.93哮喘模型組 　12 　 4.08±0.76**陰虛哮喘模型組 　12 　 3.82±0.66**

4.6陰虛哮喘小鼠肺組織病理學(xué)變化

正常組和陰虛模型組炎癥反應(yīng)不明顯，哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠肺組織可見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞腫脹、部分脫落，基底膜增生、變厚，支氣管壁充血、腫脹并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。小鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度結(jié)果顯示，與正常組比較，哮喘模型組和陰虛哮喘模型組小鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯加重（P＜0.01），見(jiàn)表7。

圖1　各組小鼠肺組織病理形態(tài)（HE染色，×20）

表7　各組小鼠支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度比較

5 討論

中醫(yī)陰虛模型的復(fù)制方法比較多，但造模簡(jiǎn)單可控的當(dāng)屬甲狀腺素法與糖皮質(zhì)激素法［9］，而糖皮質(zhì)激素屬于常用的治療哮喘的藥物，因此，在復(fù)制陰虛哮喘模型時(shí)，甲狀腺素法是復(fù)制陰虛證較適宜的方法。目前，國(guó)內(nèi)外復(fù)制哮喘模型最常用的方法為OVA法，即采用OVA通過(guò)致敏與激發(fā)兩步來(lái)復(fù)制哮喘動(dòng)物模型［10］。本實(shí)驗(yàn)基于文獻(xiàn)及前期研究，采用腹腔注射與皮下注射OVA致敏2周、超聲霧化吸入OVA激發(fā)4周復(fù)制哮喘模型，在此基礎(chǔ)上采用甲狀腺素灌胃復(fù)制陰虛哮喘小鼠模型。造模藥物劑量選擇方面，OVA采用最適宜的劑量，復(fù)制出典型的哮喘模型；但考慮到動(dòng)物的承受能力，特別是陰虛哮喘小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、死亡率明顯上升等因素，甲狀腺素劑量降為120 mg/kg。

中西醫(yī)結(jié)合病證模型的評(píng)價(jià)方面，既要考慮基于病理學(xué)對(duì)疾病全過(guò)程認(rèn)識(shí)的病，又要考慮基于癥候群對(duì)疾病現(xiàn)階段認(rèn)識(shí)的證，同時(shí)要結(jié)合現(xiàn)代研究的最新成果［11］。三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與水液代謝是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，陰虛是指機(jī)體精血津液（物質(zhì)）不足與陽(yáng)（功能）相對(duì)亢盛的病理狀態(tài)。本研究從小鼠的進(jìn)食量與飲水量、體質(zhì)量、肺液清除功能等方面評(píng)價(jià)陰虛證模型的物質(zhì)代謝水平，從cAMP、cGMP及其平衡方面評(píng)價(jià)機(jī)體機(jī)能虛性亢奮的病理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，陰虛哮喘小鼠進(jìn)食量、飲水量明顯增加，而體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，提示模型小鼠基礎(chǔ)代謝率明顯上升，出現(xiàn)“多飲、多食、少肉”的典型陰虛癥狀；血清 cAMP及cAMP/cGMP升高、cGMP下降表明機(jī)體處于陰虛而陽(yáng)相對(duì)亢盛的狀態(tài)；而肺組織濕重/干重比值下降顯示肺臟處于精血津液不足的虛損狀態(tài)。

藥理學(xué)評(píng)價(jià)主要由藥理作用與作用機(jī)制2個(gè)方面組成，而對(duì)動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)則更應(yīng)側(cè)重于藥理作用，即對(duì)病證癥狀的影響。作為哮喘病，痰、咳、喘是臨床最常見(jiàn)的癥狀，也是評(píng)價(jià)哮喘模型的最基礎(chǔ)指標(biāo)，但小鼠咳嗽聲音太小而不易察覺(jué)，痰液難以量化，唯有哮喘引起的癥狀有明顯特征而易于量化。哮喘可引發(fā)呼吸異常，如呼吸急促甚至呼吸伴有點(diǎn)頭、腹式呼吸等，以及缺氧而引發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀如焦躁不安、直立靜坐或急促爬刨墊料等異常行為。采用OVA復(fù)制的哮喘屬于過(guò)敏性哮喘，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)鼻腔與皮膚發(fā)癢。因此，抓鼻、撓癢也屬于易量化的指標(biāo)。本研究對(duì)小鼠抓鼻、撓癢及哮喘發(fā)作癥狀等哮喘行為學(xué)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示陰虛哮喘模型小鼠哮喘等行為學(xué)指標(biāo)評(píng)分出現(xiàn)明顯的變化。肺功能與肺組織病理學(xué)是反映肺臟功能與結(jié)構(gòu)的最直接指標(biāo)，本研究對(duì)肺功能指標(biāo)PIF、PEF、TV與F進(jìn)行考察，結(jié)果提示陰虛哮喘小鼠的肺功能明顯下降；病理結(jié)果顯示，陰虛哮喘小鼠肺組織出現(xiàn)一定的病理學(xué)變化，而支氣管壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯加重。

綜上，在OVA復(fù)制哮喘模型的基礎(chǔ)上，采用甲狀腺素復(fù)制陰虛哮喘BALB/c小鼠模型，該造模方法簡(jiǎn)便、觀測(cè)指標(biāo)變化明顯且符合西醫(yī)對(duì)病的診斷和中醫(yī)對(duì)證候的認(rèn)識(shí)特點(diǎn)，為研究陰虛哮喘的本質(zhì)及平喘藥物的作用機(jī)制提供了較為理想的動(dòng)物模型。

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（修回日期：2015-11-06；編輯：華強(qiáng)）

Establishment and Evaluation of BALB/c Mouse Model of Anaphylactic Asthma with Yin-deficiency Syndrome

WANG Zhi-wang1，2， TUO Hai-yan1， REN Yuan1，2， LI Rong-ke1， LIU Xue-feng1，CHENG Xiao-li1（1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Objective To establish and evaluate a BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome. Methods Ovalbumin （OVA） was injected to sensitize and was inhaled to stimulate to replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma. Thyroxin was used for gavage during late stimulation to replicate the BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome. On the basis of monitoring food and water intake and body weight， asthma related indexes， such as asthmatic behaviors， respiratory function， lung histopathology， were detected， and yin-deficiency syndrome related indexes， such as cAMP and cGMP， and pulmonary fluid clearance were examined. Results The BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome showed obvious asthma symptoms； comprehensive scores of asthmatic behaviors increased significantly；inhaling peak flow， exsufflation peak flow， and tidal volume decreased significantly； lung tissue histopathology showed obvious inflammatory response. Meanwhile， food and water intake of BALB/c mouse model of asthma with yin-deficiency syndrome increased significantly； body weight increased slowly； wet/dry ratio of lung tissue decreased；cAMP and cAMP/cGMP increased， while cGMP decreased， which showed that the mice were in the condition of yin-deficiency and yang-excess. Conclusion Combining thyroxin at the basis of sensitivity induced by OVA is a good pattern to successfully replicate the BALB/c mouse model of anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome.

anaphylactic asthma with yin-deficiency syndrome； animal model； BALB/c mice

R228；R259.622.5；R332

A

1005-5304（2016）09-0061-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81460668）；甘肅省自然科學(xué)基金（1310RJZA086）

2015-10-02）