煙曲霉Asp f3和Asp f4線性B細(xì)胞抗原表位最小基序鑒定

石晶，高巖，霍克克，季朝能,2，唐海平，徐萬祥，謝毅,2，顧少華,2

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438; 2. 上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438； 3. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

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·論著·

煙曲霉Asp f3和Asp f4線性B細(xì)胞抗原表位最小基序鑒定

石晶1，2，高巖1，2，霍克克1，季朝能1,2，唐海平3，徐萬祥3，謝毅1,2，顧少華1,2

1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438; 2. 上海市工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海 200438； 3. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所，國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種廣泛存在于自然界中的條件致病菌，其產(chǎn)生的分生孢子被易感人群吸入后定植于肺部，引起3種曲霉?。褐驴┭那鼓[、致肺纖維化的變應(yīng)性支氣管肺曲霉病、致較高死亡率的侵襲性曲霉病。目前臨床上用于診斷煙曲霉感染的血清免疫學(xué)指標(biāo)有半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖，但特異度和靈敏度方面存在一定的局限性。Asp f3 和Asp f4為煙曲霉主要抗原，在感染者血清中存在相應(yīng)的循環(huán)抗體。本研究分別用兔抗Asp f3 和Asp f4抗血清對(duì)其進(jìn)行抗原表位掃描，鑒定了8個(gè)Asp f3和6個(gè)Asp f4最小表位基序肽。用所鑒定的最小表位基序與煙曲霉其他抗原的最小表位基序構(gòu)建嵌合肽，可能有助于提高煙曲霉感染診斷的特異度和靈敏度。

煙曲霉；Asp f3；Asp f4；線性B細(xì)胞表位；最小基序

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種廣泛存在于自然界中的條件致病菌，其孢子被易感人群吸入后定植于肺部，可引起3種曲霉?。褐驴┭那鼓[(aspergilloma)、致肺纖維化的變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA)和致高死亡率的侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)[1]。

曲霉腫由前期定植于空腔、囊腫、肺大泡或擴(kuò)張性支氣管的非侵襲性曲霉造成[1]，常見于肺結(jié)核、肉狀瘤病和擴(kuò)張性支氣管炎患者中[2]。變應(yīng)性支氣管肺曲霉病表現(xiàn)為長(zhǎng)期哮喘病和囊包性纖維癥患者對(duì)煙曲霉的過敏性反應(yīng)[2]。而侵襲性曲霉病則以煙曲霉在肺部定植、侵襲為主。變應(yīng)性支氣管肺曲霉病與侵襲性曲霉病的不同之處在于，前者引起過敏性反應(yīng)的煙曲霉或嗜酸性粒細(xì)胞繼續(xù)留存于支氣管腔內(nèi)[2]。

血清免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)曲霉病的診斷非常重要[3]。半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)和1,3-β-D-葡聚糖(1,3-β-D-glucan，BG)是煙曲霉細(xì)胞壁的多糖成分，隨孢子萌發(fā)和菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)入宿主血循環(huán)。因此，可分別用GM和BG單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)檢測(cè)血清中的相應(yīng)循環(huán)抗原，目前常用于臨床診斷煙曲霉感染，但特異度和靈敏度方面存在一定的局限性[3]。已有研究表明，利用煙曲霉免疫原性強(qiáng)的體外重組蛋白，可檢測(cè)感染者血清中的相應(yīng)循環(huán)抗體，但單個(gè)重組蛋白同樣在特異度和靈敏度方面存在一定的局限性[4]。一個(gè)蛋白抗原的長(zhǎng)表位肽可能與其他蛋白抗原的抗體起交叉反應(yīng)，因此鑒定蛋白抗原表位的最小基序可提高檢測(cè)的特異度；將多個(gè)蛋白抗原表位的最小基序組成嵌合肽可提高檢測(cè)的靈敏度。Asp f3作為變應(yīng)原，由世界衛(wèi)生組織和國(guó)際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)變應(yīng)原命名分委員會(huì)(World Health Organization and International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclature Sub-committee)命名，為過氧化物酶體蛋白。Asp f4也是煙曲霉的主要免疫原，生物學(xué)功能未知[5]。人體感染煙曲霉會(huì)產(chǎn)生抗Asp f3和Asp f4的IgG、IgE和IgA抗體[6]。

本研究制備Asp f3和Asp f4重組蛋白，免疫新西蘭白兔，獲得相應(yīng)的兔抗血清[7]。用兔抗Asp f3和Asp f4抗血清進(jìn)行抗原表位掃描，鑒定出8個(gè)Asp f3和6個(gè)Asp f4最小基序。將所鑒定的最小基序與煙曲霉其他抗原的最小基序構(gòu)建嵌合肽，可能有助于提高煙曲霉感染診斷的特異度和靈敏度。

根據(jù)基本局部比對(duì)檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)及文獻(xiàn)閱讀結(jié)果，應(yīng)用http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustal和http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi這兩個(gè)網(wǎng)站的同源蛋白分析工具，將煙曲霉Asp f3 和Asp f4分別與黃曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)和土曲霉(Aspergillusterreus)同源蛋白的序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)煙曲霉與另外3種曲霉的相關(guān)同源蛋白高度一致，故將獲得的最小基序與這些同源序列進(jìn)行比對(duì)，得到曲霉種屬的擬保守序列。

1　材料與方法

1.1材料

菌株與質(zhì)粒：大腸埃希菌BL21(DE3)、DH5α及質(zhì)粒pXXGST-1、pXXGST-2為本實(shí)驗(yàn)室保存。

主要試劑和酶：限制性內(nèi)切酶SalⅠ-HF和BamHⅠ-HF購(gòu)自New England Biolabs公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo-Fermentas公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，12.5%和15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)預(yù)制膠購(gòu)自上海熠晨生物科技有限公司。

主要耗材：聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購(gòu)自Millipore公司

1.2方法

1.2.1重組蛋白Asp f3和Asp f4 18肽克隆構(gòu)建與表達(dá)鑒定

1.2.1.1Asp f3和Asp f4 18肽上下游引物設(shè)計(jì)根據(jù)煙曲霉Af293菌株的Asp f3(NCBI accession No：XP_747849)和Asp f4(NCBI accession No：XP_749515)的蛋白序列，設(shè)計(jì)覆蓋重組蛋白Asp f3(168個(gè)氨基酸)和Asp f4(322個(gè)氨基酸)全長(zhǎng)的前后相互重疊9個(gè)氨基酸的18肽，最終將Asp f3拆分為18個(gè)覆蓋此蛋白全長(zhǎng)且前后相互重疊9個(gè)氨基酸的18肽，Asp f4拆分為34個(gè)覆蓋此蛋白全長(zhǎng)且前后相互重疊9個(gè)氨基酸的18肽。在每個(gè)肽段的正鏈編碼5′端加入“GATCC”序列，3′端加入“TAAG”序列；負(fù)鏈編碼5′端加入“TCGACTTA”序列，3′端加入“G”序列[8]。根據(jù)SignalP軟件預(yù)測(cè)，Asp f4的信號(hào)肽為第1～14位氨基酸，故pET-22(b)-Asp f4重組質(zhì)粒中，Asp f4的序列為第15～322位氨基酸，用Asp f415-322表示。

1.2.1.2引物退火、體系連接(10 μL)、構(gòu)建克隆、測(cè)序驗(yàn)證95 ℃使上下游引物退火，T4連接酶將退火所得引物與目的片段連接，然后按常規(guī)方法構(gòu)建克隆。

1.2.1.3重組蛋白Asp f3和Asp f4 18肽的高溫誘導(dǎo)表達(dá)將測(cè)序成功(NCBI BLAST 系統(tǒng)比對(duì)完全匹配)的重組18肽保種菌于30 ℃過夜培養(yǎng)至一定密度(OD600值為0.6～0.8)后，42 ℃誘導(dǎo)4 h(pXXGST質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)為熱誘導(dǎo)表達(dá))，對(duì)表達(dá)蛋白制樣保存。

1.2.1.4重組蛋白Asp f3和Asp f4 18肽的蛋白免疫印跡鑒定對(duì)SDS-PAGE確定表達(dá)了的樣品進(jìn)行蛋白免疫印跡鑒定。鑒定Asp f3所用一抗兔抗血清濃度為1∶10 000，而鑒定Asp f4所用一抗兔抗血清濃度為1∶100 000。二抗全部用羊抗兔IgG，濃度為1∶5 000。通過色差分析軟件調(diào)整蛋白上樣量，以確保每一短肽的上樣量統(tǒng)一，盡量消除后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn)中因蛋白量不同而可能引起的誤差。

1.2.2重組蛋白 Asp f3 和 Asp f4 9肽克隆構(gòu)建與表達(dá)鑒定將表達(dá)陽性的12條Asp f3 18肽和13條Asp f4 18肽分別合成前后相互重疊8個(gè)氨基酸的9肽。但由于前一條18肽的最后一條9肽與相鄰的后一條18肽的第一條9肽重合，故進(jìn)行表達(dá)免疫時(shí)每條18肽只選取9條9肽來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并按1～9編號(hào)。例如：1號(hào)18肽分成的9條9肽分別為1-1～1-9。其他克隆構(gòu)建與表達(dá)鑒定方法均同18肽，并根據(jù)9肽蛋白免疫印跡鑒定圖分析兩個(gè)蛋白的最小基序。

1.2.3Asp f3和Asp f4最小基序的比對(duì)分析將煙曲霉Asp f3、Aspf4最小基序與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉的相關(guān)同源序列通過Bioedit 軟件比對(duì)分析以獲得擬保守表位。

2　結(jié)果

2.1Asp f3 18肽表達(dá)鑒定

Asp f3 18個(gè)18肽免疫兔抗血清的結(jié)果顯示，陽性18肽有12個(gè)：Asp f31-18、Asp f39-26、Asp f317-34、Asp f325-42、Asp f349-66、Asp f357-74、Asp f365-82、Asp f389-106、Asp f397-114、 Asp f3105-122、Asp f3121-138、Asp f3129-146，在圖1中分別以1、2、3、4、7、8、9、12、13、14、16、17標(biāo)出。

2.2Asp f4 18肽表達(dá)鑒定

Asp f4 34個(gè)18肽免疫兔抗血清結(jié)果顯示，陽性18肽共13個(gè)：Asp f447-64、Asp f455-72、 Asp f463-80、Asp f487-104、 Asp f495-112、 Asp f4111-128、 Asp f4119-136、

Column 0: protein pXXGST-2 as blank control; Columns 1-18: Asp f3 18mer peptides 1-18; Row 1: SDS-PAGE of Asp f3 18mer peptides; Row 2: immunogenicity identification of Asp f3 18mer peptides 1-18 using rabbit antisera as the first antibody.

圖1Asp f3 18肽的免疫原性鑒定

Fig.1Immunogenicity identification of Asp f3 18mer peptides

Column 0: protein pXXGST-2 as blank control; Columns 1-34: Asp f4 18mer peptides 1-34; Row 1: SDS-PAGE of Asp f4 18mer peptides; Row 2: immunogenicity identification of Asp f4 18mer peptides 1-34 using rabbit antisera as the first antibody.

圖2Asp f4 18肽的免疫原性鑒定

Fig.2Immunogenicity identification of Asp f4 18mer peptides

Asp f4127-144、Asp f4177-194、Asp f4185-202、Asp f4201-218、Asp f4225-242、Asp f4241-258，在圖2中分別以5、6、7、10、11、13、14、15、23、24、26、29、31標(biāo)出。將這13條18肽繼續(xù)合成前后相互重疊8個(gè)氨基酸的9肽。

2.3Asp f3最小基序分析

鑒定出的8條最小基序分別為Asp f35-9、Asp f312-17、Asp f316-23、Asp f335-41、Asp f367-72、Asp f372-78、Asp f3123-127、Asp f3141-148(圖3)。

2.4Asp f4 最小基序分析

鑒定出的6條最小基序分別為Asp f456-61、Asp f4104-109、Asp f4130-134、Asp f4136-141、Asp f4219-226、Asp f4226-232(圖4)。

A: Minimal motif KAGDS of Asp f3. B: Minimal motif SDVVFS of Asp f3. C: Minimal motif FSYIPWSE of Asp f3. D: Minimal motif INYNASK of Asp f3. E: Minimal motif PEYIEK of Asp f3. F: Minimal motif KLPEIRA of Asp f3. G: Minimal motif IGWAD of Asp f3. H: Minimal motif HGKITYAA of Asp f3.

圖3Asp f3蛋白最小基序

Fig.3The minimal motifs of Asp f3

A: Minimal motif NEWSGE of Asp f4. B: Minimal motif SADWTN of Asp f4. C: Minimal motif SGIFY of Asp f4. D: Minimal motif GNVGKP of Asp f4. E: Minimal motif AKGDELPK of Asp f4. F: Minimal motif KDQFGGY of Asp f4.

圖4Asp f4蛋白最小基序

Fig.4The minimal motifs of Asp f4

2.5Asp f3最小基序同源比對(duì)分析

將鑒定出的煙曲霉Aspf3最小基序與黃曲霉同源蛋白TR|A0A0D9MXZ2、TR|B8N6G4，黑曲霉同源蛋白TR|G3XWC6、TR|A2R0G9、TR|G3Y523、TR|A2R6R3，土曲霉同源蛋白TR|Q0CGH0、TR|Q0C982的相關(guān)同源序列(圖5中所示TR號(hào)均為該菌在UniProtKB中的對(duì)應(yīng)編號(hào))通過Bioedit 軟件比對(duì)，結(jié)果如下。

A: Comparison of minimal motifs KAGDS, SDVVFS, FSYIPWSE, INYNASK and PEYIEK of Asp f3 with homology sequences ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus. B: Comparison of minimal motifs IGWAD, DEEGRTKRY and HGKITYAA of Asp f3 with homology sequences ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus.

圖5Asp f3蛋白最小基序與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉相關(guān)同源序列的比對(duì)

Fig.5Comparison of minimal motifs of Asp f3 with homology sequences ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus

鑒定出的最小基序中，表位Asp f35-9、Asp f312-17、Asp f335-41、Asp f367-72、Asp f372-78、Asp f3141-148與黃曲霉同源蛋白TR|A0A0D9MXZ2、TR|B8N6G4，黑曲霉同源蛋白TR|G3XWC6、TR|A2R0G9 、TR|G3Y523、TR|A2R6R3，土曲霉同源蛋白TR|Q0CGH0、TR|Q0C982的相關(guān)同源序列匹配較多，可作為重點(diǎn)鑒定對(duì)象，為總結(jié)保守性表位及進(jìn)行后續(xù)廣譜性嵌合肽檢測(cè)抗原的研制提供基礎(chǔ)。

2.6Asp f4最小基序同源比對(duì)分析

將鑒定出的煙曲霉Aspf4最小基序與黃曲霉同源蛋白TR|B8N0A2、TR|A0A0D9MQD1、TR|B8NS76、TR|A0A0D9NBG0、TR|A0A0D9ND49、TR|B8NKD2，黑曲霉同源蛋白TR|Q1ZZ48、TR|G3XZE6、TR|A2QP69、TR|G3Y854、TR|A2QFU1、TR|G3XTJ1，土曲霉同源蛋白TR|Q0C9X7、TR|Q0CB03的相關(guān)同源序列(圖6中所示TR號(hào)均為該菌在UniProtKB中的對(duì)應(yīng)編號(hào))通過Bioedit 軟件比對(duì)，結(jié)果如下。

最小基序中，表位Asp f4219-226、Asp f4226-232與黃曲霉同源蛋白TR|A0A0D9MQD1、TR|B8N0A2，黑曲霉同源蛋白TR|G3XZE6、TR|A2QP69、TR|G3Y854、TR|A2QFU1，土曲霉同源蛋白TR|Q0C9X7、TR|Q0CB03的相關(guān)同源序列匹配較多，可作為重點(diǎn)鑒定對(duì)象，為總結(jié)該蛋白的保守性表位及進(jìn)行后續(xù)廣譜性嵌合肽檢測(cè)抗原的研制提供基礎(chǔ)。

A: Comparison of minimal motif SADWTN of Asp f4 with homology sequence ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus；B: Comparison of minimal motifs AKGDELPK, KDQFGGY and MKICNHAGE of Asp f4 with homology sequence ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus.

圖6Asp f4蛋白最小基序與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉相關(guān)同源序列的比對(duì)

Fig.6Comparison of minimal motifs of Asp f4 with homology sequences ofAspergillusflavus,AspergillusnigerandAspergillusterreus

3　討論

對(duì)于任何一種疾病，早期、快速診斷能大大降低其致死率[9-10]。真菌感染引起的疾病中，曲霉腫、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病和侵襲性曲霉病尤為如此，關(guān)鍵免疫原的表位篩選在疾病確診中非常重要。例如，侵襲性曲霉病病死率為50%～95%, 約90%由煙曲霉感染引起，很多患者往往在尸檢時(shí)才能明確診斷，因此早期診斷和及時(shí)使用抗真菌藥物能大大提高生存率。

有研究發(fā)現(xiàn)，所有曲霉變應(yīng)原能在致敏患者中引起Ⅰ型超敏反應(yīng)，并產(chǎn)生高水平的IgG、IgE抗體[11]。本研究選取煙曲霉變應(yīng)原中的Asp f3和Asp f4進(jìn)行線性B細(xì)胞表位最小基序的篩選。在蛋白免疫印跡鑒定中對(duì)兩種抗體的比例進(jìn)行摸索與嘗試，結(jié)合蛋白表達(dá)量，最終確定Asp f3鑒定實(shí)驗(yàn)中所用一抗兔抗血清濃度為1∶10 000，而Asp f4鑒定實(shí)驗(yàn)中所用一抗兔抗血清濃度為1∶100 000； 二抗全部用羊抗兔IgG，濃度為1∶5 000。

本研究的局限性在于，煙曲霉為真菌，真菌蛋白易被糖基化，可能影響對(duì)疾病的判斷。因此，在以后相應(yīng)試劑盒研發(fā)過程中要注意規(guī)避此缺陷。

本研究發(fā)現(xiàn)，Asp f4第55號(hào)9肽在考馬斯亮藍(lán)染色鑒定表達(dá)圖和蛋白免疫印跡鑒定圖中位置均比正常條帶偏上，這是基因工程中目的蛋白表達(dá)的常見現(xiàn)象，由重組蛋白的氨基酸電荷導(dǎo)致[12]。

靶蛋白抗原性的基礎(chǔ)是表位[13]。在獲得最小基序后，應(yīng)將其用兔抗血清和志愿者血清進(jìn)一步檢驗(yàn)，以利于后續(xù)廣譜性嵌合肽的合成和相應(yīng)檢測(cè)疾病試劑盒的研發(fā)。

在9肽鑒定中，有10個(gè)連續(xù)陽性條帶出現(xiàn)，可能是對(duì)應(yīng)的18肽中有不止一個(gè)最小基序存在，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)將其拆分為8肽進(jìn)一步行最小基序鑒定。本研究還將鑒定出的Asp f3和Asp f4兩個(gè)重組蛋白的最小基序分別與黃曲霉、黑曲霉和土曲霉的同源蛋白進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Asp f3的8條較小基序中，表位Asp f35-9、Asp f312-17、Asp f335-41、Asp f367-72、Asp f372-78、Asp f3141-148與其他同源序列匹配較多；而Asp f4的6條最小基序中，表位Asp f4219-226、Asp f4226-232與其他同源序列匹配較多。對(duì)于這些匹配較多的擬保守表位，替換其中少數(shù)不同氨基酸可研發(fā)相關(guān)疾病的廣譜性表位。

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Identification of minimal motifs of linear B cell epitope on Asp f3 and Asp f4 ofAspergillusfumigatus

SHI Jing1,2, GAO Yan1,2, HUO Keke1, JI Chaoneng1,2, TANG Haiping3, XU Wanxiang3, XIE Yi1,2, GU Shaohua1,2

1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China; 2. Shanghai Engineering Research Center of Industrial Microorganisms, Shanghai 200438, China; 3. National Population and Family Planning Key Laboratory of Contraceptive Drugs and Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China

Aspergillusfumigatus(A.fumigatus) is a widespread opportunistic pathogen. The conidia produced byA.fumigatusare colonized in lungs after inhalation, leading to aspergilloma, allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA) and invasive aspergillosis (IA). Currently, 1,3-β-D-glucan and galactomannan are used as serum immunological indexes for clinical diagnosis ofA.fumigatusinfection. Asp f3 and Asp f4 are two of the major antigens ofA.fumigatus, and the corresponding circulating antibodies are present in the sera of infected persons. In this study, anti-Asp f3 and anti-Asp f4 rabbit sera were used to carry out antigen epitope scanning. Eight Asp f3 and six Asp f4 minimal motifs were identified. These identified minimal motifs can be used for constructing chimera antigens to improve the specificity and sensitivity of the diagnosis forA.fumigatusinfection.

Aspergillusfumigatus; Asp f3; Asp f4; Linear B cell epitope; Minimal motif

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2013CB531603)，上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目(13DZ2252000)

顧少華

Corresponding author. GU Shaohua, E-mail: shaohuagu@fudan.edu.cn

2016-05-06)