分枝桿菌核糖體的制備與初步結(jié)構(gòu)研究

孫銳，孫玉凡，張曉丹，陳剛，劉夢(mèng)杰，李潔，張加，吳晶，張文宏，張穎，張文

1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200032； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 上海 200031

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·論著·

分枝桿菌核糖體的制備與初步結(jié)構(gòu)研究

孫銳1,*，孫玉凡1,*，張曉丹1,*，陳剛2，劉夢(mèng)杰1，李潔1，張加2，吳晶2，張文宏2，張穎2，張文1

1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院, 上海 200032； 2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 上海 200031

核糖體是抗生素的主要靶點(diǎn)，而獲得足量高純度的核糖體是進(jìn)行結(jié)構(gòu)和藥物研究的基礎(chǔ)。結(jié)核分枝桿菌壁厚且生長(zhǎng)緩慢，制備足量高純度的核糖體具有挑戰(zhàn)性。本研究改進(jìn)并優(yōu)化了核糖體純化制備方法，通過大量培養(yǎng)和安全處理致病菌，應(yīng)用高效破碎厚壁革蘭陽性菌的技術(shù)，結(jié)合傳統(tǒng)的蔗糖密度離心分離和蛋白液相色譜純化技術(shù)，經(jīng)多步純化和分離，獲得了高純度和較高產(chǎn)率的恥垢分枝桿菌與結(jié)核分枝桿菌的核糖體樣品，為后續(xù)生化實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供了保證。該分枝桿菌核糖體制備方法也可應(yīng)用于其他革蘭陽性致病菌復(fù)合物樣品的直接提純，以及復(fù)合物特異性的進(jìn)一步研究，特別是利用晶體學(xué)與冷凍電鏡結(jié)合的高精度復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究，有助于揭示細(xì)菌耐藥性機(jī)制及用于新型抗生素的研發(fā)。

分枝桿菌；核糖體純化；結(jié)構(gòu)生物學(xué)；抗生素耐藥性

目前結(jié)核病呈高發(fā)趨勢(shì)，全球每年有900 多萬新發(fā)病例，死亡病例約150萬。迄今已有約20億人被結(jié)核分枝桿菌感染，而我國(guó)高達(dá)44.5%的感染率和日益嚴(yán)重的耐藥性問題，已成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題[1-2]。因此，有必要對(duì)抗生素作用機(jī)制及耐藥性分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

蛋白質(zhì)翻譯是生物中心法則的重要環(huán)節(jié)，而核糖體是蛋白質(zhì)翻譯的分子機(jī)器。目前多達(dá)半數(shù)的抗生素以核糖體為作用靶點(diǎn)，因此針對(duì)蛋白質(zhì)翻譯及核糖體結(jié)構(gòu)的研究不僅具有生物學(xué)意義，還具有重要醫(yī)藥研發(fā)價(jià)值[3]。自2000年以來，高精度的核糖體結(jié)構(gòu)功能研究取得了一系列重要成就，但針對(duì)大多數(shù)致病菌核糖體結(jié)構(gòu)的特異性研究不多[4-5]。通過X線晶體學(xué)，特別是最近1年的冷凍電鏡技術(shù)(cryo-electron microscopy，Cryo-EM)，核糖體及其蛋白結(jié)構(gòu)的研究取得了革命性突破，多種核糖體的高精度結(jié)構(gòu)不斷被國(guó)際頂級(jí)雜志報(bào)道[6]。本課題組利用冷凍電鏡技術(shù)對(duì)多種致病菌的核糖體進(jìn)行研究，旨在揭示核糖體與抗生素的特異作用機(jī)制，從而有利于開發(fā)新型窄譜抗生素。

結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)引起，Mtb對(duì)大部分針對(duì)核糖體的抗生素(如鏈霉素等)已產(chǎn)生耐藥性，因此有必要針對(duì)Mtb核糖體結(jié)構(gòu)，研究抗生素的特異性和作用機(jī)制[7]。恥垢分枝桿菌是Mtb的近緣細(xì)菌，因?yàn)樯L(zhǎng)較快常作為Mtb研究的替代模型，兩者核糖體的同源性較高，但部分序列和抗生素譜存在差異，如吡嗪酰胺對(duì)Mtb核糖體蛋白R(shí)psA的特異作用[8]。

Mtb培養(yǎng)約4周才能獲得足量的核糖體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。即使研究減毒株H37Ra，大量培養(yǎng)和處理也需在滿足生物安全的專門實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。傳統(tǒng)核糖體提純主要是將破菌后的樣品經(jīng)歷幾次密度梯度離心；而Mtb的細(xì)胞壁非常致密，很難充分破碎，且破碎的大量細(xì)胞壁殘?jiān)旌显跇悠分薪o后續(xù)純化造成困難。因此，如何獲得大量高純度的Mtb核糖體是具有挑戰(zhàn)性的問題，也是生化和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的關(guān)鍵[9]。

最近報(bào)道放線菌和結(jié)核分枝桿菌核糖體可獲得10 ?左右低分辨率的電鏡結(jié)構(gòu)[10-11]，其中應(yīng)用了密度梯度離心和疏水柱純化方法，但存在不足。本研究改進(jìn)了Mtb和恥垢分枝桿菌核糖體的純化與制備方法，獲得了純度較高的樣品，并用于進(jìn)一步的高精度結(jié)構(gòu)研究。下面主要以Mtb為例，對(duì)分枝桿菌的核糖體純化制備進(jìn)行闡述。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和培養(yǎng)基Mtb減毒株H37Ra由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科保存。ADC增菌液由50 g牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、20 g右旋葡萄糖(dextrose)、0.04 g過氧化氫酶(catalase)、 8.5 g NaCl配制。7H11固體培養(yǎng)基由10.5 g Difco Middlebrook 7H11 瓊脂、450 mL H2O、5.0 mL 50%甘油配制。

1.1.2主要試劑溶菌酶購(gòu)自Sigma，DNase Ⅰ購(gòu)自NEB，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)和TCEP均購(gòu)自Sigma。緩沖液A：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、100 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)；緩沖液AS：緩沖液A、5%蔗糖；緩沖液BS：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、500 mmol/L NH4Cl、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、0.5 mol/L蔗糖； 緩沖液CS：20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、60 mmol/L NH4Cl、6 mmol/L MgCl2、2 mmol/L EDTA、0.7 mol/L蔗糖。

◎布洛芬 39oC以上使用，常見的就是強(qiáng)生的美林，小兒退熱的首選。經(jīng)腎臟代謝，腹瀉時(shí)身體本身就容易脫水，禁用。

1.2核糖體樣品的純化

核糖體的提純與傳統(tǒng)方法類似[9,12]，先經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、破碎、離心、純化，然后通過改進(jìn)的AKTA純化，最后進(jìn)行濃縮、緩沖液更換等，有時(shí)還需后續(xù)密度梯度離心。

1.2.1H37Ra的培養(yǎng)保種菌液按1%～4%接種至300 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)4周。復(fù)蘇后的菌液按4%接種至300 mL 7H9液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)2周。每瓶(300 mL)加入20%甘氨酸22.5 mL，37 ℃ 100 r/min震蕩離心，再培養(yǎng)1～2周。離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌，離心3次，于-80 ℃保存[13]。

1.2.2H37Ra的破碎與離心H37Ra的破碎和處理需在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。將培養(yǎng)的3 L菌液經(jīng)離心收集，取沉淀中的菌體5～10 g(濕重)，用緩沖液A洗2～3次并重懸，加入終濃度為2～5 mg/mL的溶菌酶、2 mmol/L PMSF、100 μL DNase Ⅰ(1 000 u/mL)和緩沖液AS。用改裝的Beadbeater破碎儀分幾次破碎，注意檢查破菌瓶的密封性，并將儀器密封，防止菌液泄漏(避免風(fēng)扇吹出可能形成危險(xiǎn)的氣溶膠)，破菌過程中用干冰冷卻保持低溫。以上操作需在生物安全柜中操作。裝樣品的離心管在拿出安全柜前需檢查密封情況，并用乙醇噴涂進(jìn)行徹底消毒。

破菌后用臺(tái)式離心機(jī)(Beckman)以6 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液呈棕黃色。將上清液繼續(xù)用高速離心機(jī)(Beckman)以20 000 r/min離心1～2次，每次60～90 min，直至看不到明顯的棕黑色沉淀，此時(shí)上清液呈淡黃色，約100 mL。用注射器抽取上清液，以0.22 μm的一次性濾膜(Millipore)過濾，取新濾膜重復(fù)過濾一次，確保上清液中無菌體殘留。對(duì)使用過的濾膜用大腸埃希菌菌液進(jìn)行抽濾以驗(yàn)證完好性，并將過濾液體涂平板過夜，如果無菌斑生長(zhǎng)，樣品方可在普通實(shí)驗(yàn)室中處理。

對(duì)抽濾的上清液進(jìn)行蔗糖密度梯度離心。將樣品分裝至6支離心管(Beckman)中，下層分別加入緩沖液BS、緩沖液CS。用超速離心機(jī)(Beckman XL100)以28 000 r/min 離心過夜，次日棄上清液。如沉淀中覆蓋有少量黃色雜質(zhì)，需小心洗2次。最后將沉淀用緩沖液 C(無蔗糖的緩沖液CS)重懸備用。

1.2.3AKTA液相色譜純化利用AKTA Purifier進(jìn)行離子交換層析，使用SourceQ 10/10陰離子交換柱進(jìn)行樣品純化。先用緩沖液C將樣品稀釋至20 mL，上樣并平衡后，用NH4Cl溶液進(jìn)行線性洗脫(將洗脫液濃度從0至75%線性提高)。洗脫液A為緩沖液C；洗脫液B為將緩沖液C的NH4Cl含量提高至1.0 mol。在幾個(gè)紫外高峰附近收集樣品，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核糖體RNA，確認(rèn)后的核糖體樣品用銀染蛋白膠檢測(cè)蛋白純度和條帶。

1.3核糖體樣品的檢測(cè)

1.3.2電鏡負(fù)染檢測(cè)將負(fù)染銅網(wǎng)進(jìn)行親水化處理后，吸取10 μL核糖體樣品(約50 μg/mL)加至銅網(wǎng)上，靜置1 min，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣小心吸去樣品。吸取2～3 μL乙酸鈾(2%)，從銅網(wǎng)一側(cè)小心加上并同時(shí)從另一側(cè)用濾紙小心吸去，以達(dá)到清洗樣品的目的，重復(fù)一次。待兩次清洗完畢，立即加6～8 μL乙酸鈾，靜置1 min。小心吸去所有染液，于干燥環(huán)境中晾干或快速烤干，然后在120 kV電鏡(Tecnai G2 Spirit 120 kV)下觀察。

2　結(jié)果

2.1AKTA液相色譜純化結(jié)果

核糖體樣品經(jīng)密度梯度離心粗提后，仍存在淡黃色雜質(zhì)，需進(jìn)行陰離子交換柱純化以提高純度。粗提的核糖體經(jīng)線性陰離子交換柱純化，首先洗脫的是常見的雜蛋白和破碎的細(xì)胞壁，洗脫液B達(dá)55%～63%(對(duì)應(yīng)電導(dǎo)70～78 mS/cm)時(shí)的洗脫峰為核糖體的洗脫峰，其后還有一個(gè)核酸雜質(zhì)的洗脫峰。將樣品分管收集后，分別鑒定其中的核酸與蛋白(圖1)。

2.2核糖體樣品的rRNA與蛋白檢測(cè)結(jié)果

從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)可看出，第2個(gè)條帶B11存在明顯的23S和16S條帶，對(duì)應(yīng)圖1的第3個(gè)紫外峰；條帶3的核酸量很少；條帶4和5為雜質(zhì)(核糖體前的兩個(gè)小峰為常見雜質(zhì)，鑒定圖示略)；條帶6和7分別為大腸埃希菌和恥垢分枝桿菌核糖體樣品，恥垢分枝桿菌核糖體上樣明顯過量。膠圖下部顯色較淡，與染色不均勻有關(guān)。所用的15 kb DNA Marker對(duì)rRNA只有相對(duì)參考作用，故分子量標(biāo)注略去。

將純化后的核糖體樣品通過Millipore濃縮管進(jìn)行離心濃縮，并換為緩沖液C，與恥垢分枝桿菌和大腸埃希菌的樣品進(jìn)行銀染膠比較(圖3)。盡管Mtb與恥垢分枝桿菌的同源性較高，但從膠圖上可觀察到3種核糖體的部分蛋白大小有差別。對(duì)圖中部分條帶進(jìn)行質(zhì)譜驗(yàn)證，并將Mtb和恥垢分枝桿菌的基因組抽提后對(duì)核糖體序列進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證同樣正確。

The ribosome is detected in peak 3 (around tube B11), and the other peaks are contaminations, which are identified by RNA and protein gel.

圖1Mtb核糖體陰離子交換柱分析

Fig.1Analysis of Mtb ribosome by ChromatographySource Q

M: 15 kb DNA Marker; Lanes 1-7: Input/B11/B10/B9/B8/Ec70S/MS70S, in which lanes 2-5 are Mtb samples labeled with tubes from ChromatographySource Q, Ec and MS areE.coliandM.smegmatissamples, respectively.

圖2Mtb核糖體的瓊脂糖凝膠分析

Fig.2Agarose gel of Mtb ribosome samples from Chro-matographySource Q

2.3核糖體的電鏡負(fù)染結(jié)果

圖4為Mtb核糖體的電鏡負(fù)染結(jié)果，可看到清晰的核糖體，還可看到雜質(zhì)顆粒，在銅網(wǎng)的不同區(qū)域背景中顆粒有多有少。最近通過高分辨冷凍電鏡(FEI Titan Krios 300 kV)并未觀察到類似的雜質(zhì)顆粒， 完全滿足高精度數(shù)據(jù)處理的要求。負(fù)染背景

中可能混入制樣時(shí)產(chǎn)生的部分雜質(zhì)。樣品存在部分分離的亞基，電鏡可將其完全分開。對(duì)產(chǎn)量較大的恥垢分枝桿菌核糖體，可通過密度梯度離心將30S、50S和70S分開，且純化的70S生長(zhǎng)晶體可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。而電鏡可在30S、50S和70S混合情況下收集數(shù)據(jù)，通過分類解析所有結(jié)構(gòu)。

M: Marker; Lane 1: Buffer C as control; Lane 2:M.smegmatis; Lanes 3 and 4:E.coli; Lane 5: Mtb. TheOD260value is about 8.0 for lanes 2, 4, 5, and about 4.0 for lane 3.

圖3Mtb核糖體的銀染凝膠圖

Fig.3Silver staining of ribosome samples

The major particles are identified as Mtb ribosome 70S.

圖4Mtb核糖體的負(fù)染圖

Fig.4Negative staining of Mtb ribosome samples

3　討論

隨著細(xì)菌耐藥性問題的日益嚴(yán)重，新型抗生素研發(fā)的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的速度，有的新藥在臨床試驗(yàn)期間就出現(xiàn)了耐藥性。因?yàn)橹委熃Y(jié)核病時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月以上，長(zhǎng)期服藥可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的廣譜耐藥?；诩?xì)菌耐藥性的危險(xiǎn)，美國(guó)和歐洲積極推進(jìn)相關(guān)研究和新型抗生素的研發(fā)[14-15]，基于結(jié)構(gòu)的抗生素研發(fā)也得到重視并取得進(jìn)展[3]。

經(jīng)過10多年的努力，核糖體高精度的結(jié)構(gòu)研究逐漸揭開了多種抗生素對(duì)核糖體翻譯的抑制機(jī)制。因?yàn)槭购颂求w結(jié)晶的難度很大，核糖體結(jié)構(gòu)研究主要局限于大腸埃希菌、嗜熱菌等少數(shù)物種，對(duì)抗生素的物種特異性或?qū)χ虏【目股刈V還不很清楚。最近1年多來，隨著電鏡技術(shù)在高精度結(jié)構(gòu)解析中取得的突破，使致病菌核糖體不需結(jié)晶即可獲得高精度的結(jié)構(gòu)。結(jié)核病為全球第二大致命流行傳染病，但由于Mtb核糖體純化困難，目前還未獲得高精度結(jié)構(gòu)。因此，如何制備Mtb核糖體并提高純度和獲得足夠樣品，對(duì)研究Mtb的耐藥性具有重要意義。

以往核糖體純化結(jié)構(gòu)研究主要運(yùn)用密度梯度離心和疏水柱的方法。但密度梯度離心不能完全除去細(xì)胞殘?jiān)?、大片段降解的核酸雜質(zhì)等；疏水柱的高鹽條件會(huì)使一部分核糖體蛋白、結(jié)合因子解離，除嗜熱菌等非常穩(wěn)定的核糖體，核糖體易變得不完整[10-11]。

傳統(tǒng)的核糖體制備過程中，在蔗糖密度梯度離心、濃縮并更換緩沖液后，樣品存在明顯損失，進(jìn)行多個(gè)步驟的離心后，最終獲得的核糖體很少，5 g菌體只能獲得約0.1 mg核糖體。為提高核糖體產(chǎn)率，本研究采取大量培養(yǎng)(3～5 L Mtb)，提高破壁效率，減少密度梯度離心次數(shù)，并利用陰離子交換柱實(shí)現(xiàn)高效、快速純化。為提高破壁效率，還在收菌前2 d加入甘氨酸使菌體細(xì)胞壁變脆[13]。另外，在破菌時(shí)使用適量溶菌酶幫助破壁，并采用破壁效果較好的石英砂代替玻璃珠，少量多次破菌，從而有效提高了核糖體粗提產(chǎn)量。最終8 g菌體獲得約1 mg核糖體，產(chǎn)量提高近10倍。從rRNA和蛋白膠圖及電鏡負(fù)染圖可看出，經(jīng)過陰離子交換柱純化，核糖體純度大大提高。雖然其中還存在少量分離的大小亞基，但一般不影響電鏡研究。

恥垢分枝桿菌與Mtb的核糖體純化方法類似，因?yàn)閻u垢分枝桿菌的核糖體含量高，經(jīng)上述優(yōu)化后產(chǎn)量提高，一般可考慮后續(xù)的密度梯度離心，進(jìn)一步分離核糖體30S、50S和70S。用改進(jìn)方法獲得的70S最終產(chǎn)量可由0.5 mg提高至近10 mg，足夠進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。目前，恥垢分枝桿菌核糖體晶體已篩選到較小的微晶，還需進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)晶條件，才能進(jìn)行下一步的晶體衍射實(shí)驗(yàn)。

核糖體是蛋白質(zhì)翻譯的大分子機(jī)器，翻譯過程含有多個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程。近年來對(duì)其延伸過程的研究取得了很大進(jìn)展，同時(shí)揭示了抗生素抑制翻譯的新機(jī)制?？股乜赡芙Y(jié)合于核糖體的多個(gè)作用位點(diǎn)，參與并影響多個(gè)翻譯步驟中的動(dòng)態(tài)過程，如氨基糖苷類抗生素對(duì)翻譯識(shí)別、延伸、循環(huán)回收的抑制和影響[16]。其對(duì)研究致病菌高精度動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)、抗生素作用機(jī)制和耐藥機(jī)制具有重要意義，與深入研究翻譯機(jī)制也相輔相成[17]。

本研究改進(jìn)了Mtb核糖體提純方法，該方法也可用于一般的革蘭陽性菌研究。目前，除了對(duì)大腸埃希菌和嗜熱菌等少數(shù)物種的核糖體可進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)研究和藥物篩選外，對(duì)其他重要的致病菌核糖體可利用電鏡進(jìn)行高精度快速解析。近1年多來，電鏡結(jié)構(gòu)解析技術(shù)取得突破性進(jìn)展。由于照相機(jī)和軟件處理技術(shù)的進(jìn)步，冷凍電鏡可快速解析高精度的大型復(fù)合物，《科學(xué)》雜志將電鏡技術(shù)的進(jìn)步稱為分子生物學(xué)上重要的“精度革命”，為致病菌核糖體研究提供了可靠保證[18]。短短1年多，通過電鏡技術(shù)已解析了多個(gè)重要的大型復(fù)合物，如剪接體結(jié)構(gòu)、線粒體核糖體結(jié)構(gòu)和人核糖體結(jié)構(gòu)等[6]。目前核糖體結(jié)構(gòu)電鏡分辨率已達(dá)2.6～2.9 ?，核心部位能直接觀察到甲基化[19]，這對(duì)理解抗生素與核糖體作用的物種特異性及突變和甲基化引起的耐藥性非常重要。特別是冷凍電鏡可直接研究核糖體的溶液構(gòu)象，解析生理?xiàng)l件下核糖體與抗生素等小分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和多種動(dòng)態(tài)構(gòu)象。將來所有物種的核糖體都能很快得到解析，對(duì)研究重要致病菌的核糖體特異性藥譜和新型窄譜抗生素研發(fā)具有重要意義，以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的抗生素研發(fā)也有望得到飛速發(fā)展[20-21]。

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Ribosome preparation fromMycobacteria

SUN Rui1,*, SUN Yufan1,*, ZHANG Xiaodan1,*, CHEN Gang2, LIU Mengjie1, LI Jie1, ZHANG Jia2, WU Jing2, ZHANG Wenhong2, ZHANG Ying2, ZHANG Wen1

1. Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200031, China

Ribosomes of pathogenic bacteria are major targets for antibiotics, and how to prepare ribosome samples with quality and quantity is a key step for structure and antibiotic studies. In particular, it is a challenge to purify enough ribosome from slow-growingMycobacteriumsuch asMycobacteriumtuberculosisdue to slow growth rate and thick cell wall. With the optimized steps, including growing and processing bulk culture with biosafety measures, breaking the thick cell wall of Gram-positive bacteria with effective techniques, and purification methods to combine the fast protein liquid chromatography (FPLC) and sucrose gradient separation, enough ribosome samples with high purity were obtained fromMycobacterium. The prepared samples could be subjected to complex specificity studies, such as high-resolution structure studies with X-ray crystallography and cryo-electron microscopy (cryo-EM), and shed light on the mechanism of antibiotics. This improved method is applicable in other Gram-positive bacteria.

Mycobacterium; Ribosome preparation; Structural biology; Antibiotic resistance

國(guó)家自然科學(xué)基金(11179012)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2011CB710801)

張文，張穎

Corresponding authors. ZHANG Wen, E-mail: wenz@fudan.edu.cn; ZHANG Ying, E-mail: yzhang5@jhu.edu

2015-03-13)

*同為第一作者