白樺擴(kuò)展蛋白基因的克隆分析及植物表達(dá)載體構(gòu)建

王子劍　 孫　丹 　于　穎 　張　巖　 王　超

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

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白樺擴(kuò)展蛋白基因的克隆分析及植物表達(dá)載體構(gòu)建

王子劍 孫丹 于穎 張巖 王超

(林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，黑龍江 哈爾濱 150040)

從白樺中分離了4條擴(kuò)展蛋白家族基因全長cDNA序列和2條大于400 bp的部分cDNA序列，命名為BpEXP1～BpEXP5和BpEXPL，其中4個(gè)全長cDNA推導(dǎo)蛋白氨基酸殘基數(shù)為186～258個(gè)，編碼蛋白的分子量為20.07～27.80 kDa，理論等電點(diǎn)為5.57～9.20。氨基酸序列分析結(jié)果表明：5個(gè)alpha- expansin序列有共同的結(jié)構(gòu)特征，即在N-末端有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基的豐富域，C-末端有4個(gè)保守的色氨酸殘基的豐富域，中間有1個(gè)組氨酸功能域。利用Real time RT-PCR分析EXP家族基因在白樺不同器官和組織內(nèi)的表達(dá)模式，結(jié)果表明：6個(gè)EXP基因在白樺的不同器官和組織中有著不同的表達(dá)水平，其中BpEXP1在分生木質(zhì)部中表達(dá)量最高，推測其與木材形成過程的細(xì)胞壁修飾相關(guān)；BpEXP3在發(fā)育的蒴果中表達(dá)量最高，推測其與果實(shí)和種子發(fā)育過程中的細(xì)胞壁修飾相關(guān)。最后選擇BpEXP1和BpEXPL基因，構(gòu)建了pROKⅡ-BpEXP1和pROKⅡ-BpEXPL植物表達(dá)載體。

白樺；擴(kuò)展蛋白；序列分析；Real time RT-PCR；載體構(gòu)建

擴(kuò)展蛋白(expansin, EXP)是第1個(gè)被鑒定的細(xì)胞壁疏松蛋白，部分誘導(dǎo)pH 調(diào)控植物細(xì)胞壁的伸展和細(xì)胞的生長[1-2]。EXP是1個(gè)基因大家族，目前已發(fā)現(xiàn)的EXP被分為4個(gè)亞家族，即α、β、γ和δ亞家族[3-5]。與最早發(fā)現(xiàn)的黃瓜(Cucumissativus)EXP在系統(tǒng)發(fā)生上相似的EXP蛋白稱為α-expansin(EXPA)，而與禾本科花粉Ⅰ型過敏原在系統(tǒng)發(fā)生上相似的EXP蛋白稱為β- expansin(EXPB)，另外一些植物EXP蛋白，他們與EXPA和EXPB相似，這些蛋白被命名為EXP相似蛋白和相關(guān)蛋白(EXLA和EXLB)[6]。每個(gè)超家族都包含一些在不同細(xì)胞類型或者不同發(fā)育階段差異表達(dá)的成員，因此在植物發(fā)育過程中具有不同的作用[7]。特別是EXPA，幾乎參與了植物的整個(gè)生長發(fā)育進(jìn)程，包括種子萌發(fā)、根毛的起始和延長、莖和葉的生長發(fā)育、葉柄的脫落、花粉管的延長、果實(shí)的成熟和植物抗逆等。從在黃瓜子葉中首次分離純化后，該蛋白目前已在水稻(Oryzasativa)結(jié)間、番茄(Lycopersiconesculentum)葉片等多種植物組織中獲得分離和鑒定。一些EXP的表達(dá)表現(xiàn)出高度的組織、器官和細(xì)胞特異性[8]。近些年來，在木材形成過程中起重要作用的EXP蛋白逐漸被重視。木質(zhì)部細(xì)胞的分化通常經(jīng)過形成層區(qū)初生細(xì)胞壁的擴(kuò)展和次生細(xì)胞壁的沉積，EXP作為細(xì)胞壁修飾蛋白，能夠塑造初生細(xì)胞壁中纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)，EXP的活動(dòng)能夠影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組分，進(jìn)而影響纖維和導(dǎo)管的形態(tài)[7,9]。在木本植物中，提高纖維長度是遺傳育種的重要目標(biāo)，因此EXP蛋白成為利用生物技術(shù)手段調(diào)節(jié)細(xì)胞大小的重要研究目標(biāo)。在雜種山楊[7,9](Populustremula×Populustremuloides)和杉木[10-11](Cunninghamialanceolata)中相繼發(fā)現(xiàn)了木材形成相關(guān)組織特異表達(dá)的EXP蛋白，這些基因在次生細(xì)胞壁的形成和次生生長過程中起作用，如纖維素合成、纖維形態(tài)、導(dǎo)管形態(tài)和植株形態(tài)建成等。

白樺(Betulaplatyphylla)是東北地區(qū)主要的造林樹種之一，培育優(yōu)質(zhì)、速生的紙漿材新品種是白樺育種的重要目標(biāo)。目前，對于白樺木材形成過程的基因調(diào)節(jié)研究主要集中在纖維素和木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵調(diào)控基因上[12-16]，而對EXP基因的研究尚未深入。因此，本研究在鑒定白樺中EXP家族基因并分析其表達(dá)模式的同時(shí)，尋找在次生生長過程中特異表達(dá)的EXP基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體，為研究其在木材形成過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，以期利用該基因進(jìn)行白樺生長和材性的分子改良研究。

1　研究方法

1.1白樺EXP基因的克隆和序列分析

1.1.1白樺EXP基因的克隆本研究構(gòu)建了白樺形成層相關(guān)組織cDNA文庫和白樺芽轉(zhuǎn)錄組，對文庫和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，并對獲得的unigenes進(jìn)行BLASTX和BLASTN分析，根據(jù)功能注釋結(jié)果共獲得17個(gè)不同的EXPEST序列，通過ORF founder (http://www. ncbi. nlm. nih.gov/gorf. html)程序確定其開放讀碼框。對其中的4個(gè)全長序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，進(jìn)一步測序確定所獲得的EXP基因的序列，將4個(gè)全長序列提交到GenBank。2條大于400 bp的序列也參與了分析。1.1.2白樺EXP基因的序列分析對獲得的4個(gè)EXP全長基因用ProtParam (http://www.expasy.org/tools/ protparam. html) 軟件計(jì)算推導(dǎo)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及理論等電點(diǎn)。對4個(gè)EXP基因推導(dǎo)的蛋白序列通過Pfam(蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http://pfam. sanger. ac. uk/)推測其結(jié)構(gòu)域(E-value=1.0)。用信號肽預(yù)測程序SignalP 3.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測BpEXP1蛋白的信號肽。并利用ClustalX 1.83軟件對所有的6個(gè)EXP蛋白和58條已知EXP蛋白序列進(jìn)行多序列比對并繪制N-J分子進(jìn)化樹,進(jìn)化樹用 MEGA 3.1 (DNAstar software,DNAStar Inc,Madison, WI)軟件構(gòu)建，亞組的分類方法參照參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.26個(gè)EXP基因的表達(dá)模式研究

1.2.1植物材料于2011年6月，選取東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)2年生的健康白樺植株，分別采取其葉、葉柄，當(dāng)年新生莖、芽，發(fā)育中的果實(shí)和分生木質(zhì)部。人工模擬重力處理2年生白樺植株，使其與水平面彎曲45°，處理3周后，取應(yīng)拉木及對應(yīng)木分生木質(zhì)部，以上材料均經(jīng)液氮處理，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2Real time RT-PCR利用CTAB法提取白樺不同組織總RNA，經(jīng)DNase I (Promega)消化處理，去除DNA污染。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和操作參照Primer ScriptTM RT Reagent Kit (Perfect Real Time)(Takara)，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作Real time RT-PCR 的模板。選擇beta-tubulin和actin(GenBank Ac. Num.：HO112154 and HO112155)作為內(nèi)參基因。內(nèi)參和EXP基因的定量PCR引物見表1，為避免相近序列的干擾，定量PCR擴(kuò)增片段盡量選擇在序列間同源性較低的區(qū)段內(nèi)。

Real time RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括去離子水7 μL，模板2 μL，基因特異性引物1 μL和2×Power SYBR Green PCR master mix 10μL (Toyobo Co., Ltd, Osaka, Japan)，設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性12 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，78.4℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。反應(yīng)在Bio-Rad Hercules. CA. USA.上完成。利用2-ΔΔCT方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[17]。

表1　Real time RT-PCR引物序列

1.3植物表達(dá)載體構(gòu)建

以白樺cDNA為模板，設(shè)計(jì)BpEXP1和BpEXPL引物,見表2。

表2　BpEXP1和BpEXPL載體構(gòu)建引物序列

對BpEXP1和BpEXPL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其引物上游及下游分別引入了KpnI和XbaI酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括10×ExTaqbuffer 2 μL，模板2 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.4 μL，基因特異性引物(10 μmol/L)各1 μL和ExTaq(5 U/μL) 0.25 μL，超純水補(bǔ)足體積至20.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。使用PCR膠回收試劑盒對目的片段進(jìn)行回收，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并測定其濃度。利用質(zhì)粒提取試劑盒對pROKⅡ質(zhì)粒進(jìn)行提取，用KpnI和XbaI對提取的質(zhì)粒和擴(kuò)增的基因進(jìn)行雙酶切?；厥蘸蟮腂pEXP1和BpEXPL片段與pROKⅡ載體利用DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物(pROKⅡ-BpEXP1和pROKⅡ-BpEXPL)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆送上海生工測序驗(yàn)證。獲得的重組載體利用液氮轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌種，在終濃度為50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選后，進(jìn)行菌液PCR檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1白樺EXP基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過對白樺形成層相關(guān)組織及芽轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的比對查找，共獲得17個(gè)EXP基因序列，其中4個(gè)EXP基因具有完整的開放讀碼框(ORFs)，經(jīng)過重新測序確定其序列，推測為全長基因，2條大于400 bp 的部分cDNA序列，也參與了序列分析，共6條序列。其中5條屬于EXPA亞家族，命名為BpEXP1～BpEXP5(全長cDNA為BpEXP1～BpEXP3，GenBank 接收號為JN860428～JN860430)；1條全長cDNA屬于EXP-Like亞家族，因此命名為BpEXPL(GenBank 接收號為JN860431)。4個(gè)全長cDNA ORFs 編碼蛋白推測的氨基酸殘基數(shù)為186～258，預(yù)測的分子質(zhì)量數(shù)為20.07～27.80 kDa，理論等電點(diǎn)5.57～9.20(表3)。Pfam分析結(jié)果表明，每個(gè)推測蛋白的氨基酸序列中都具有典型的DPBB-1(Rare lipoprotein A (RlpA)-like double-psi beta-barrel)和Pollen_allerg_1結(jié)構(gòu)域，具有EXP超家族的多重結(jié)構(gòu)域，具有一段類似于葡聚糖內(nèi)切酶的1個(gè)小家族(family-45)的催化域(圖1)。以BpEXP1為例進(jìn)行信號肽分析顯示，其前22位氨基酸構(gòu)成了明顯的信號肽(圖2)。

利用ClustalX軟件對6個(gè)白樺EXP氨基酸和已知的58個(gè)EXP蛋白序列進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建進(jìn)化樹，研究白樺EXP基因的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BpEXP1和BpEXP5屬于EXPA亞家族A亞組，BpEXP2和BpEXP3分別屬于C和B，C亞組(圖3)。5個(gè)白樺EXPA蛋白序列與EXPA亞家族蛋白序列有共同的結(jié)構(gòu)特征，即在N-末端有8個(gè)保守的半胱氨酸殘基的豐富域，C-末端有4個(gè)保守的色氨酸殘基的豐富域，中間有一個(gè)組氨酸(His-Phe-Asp, HFD)功能域 (圖4)，確定其屬于EXPA亞家族。BpEXP1序列與A亞組成員的序列比對顯示(圖4)，BpEXP1在信號肽后有保守的RIPGV 氨基酸序列，在C-端有KNFRV保守序列，而BpEXPL蛋白與其結(jié)構(gòu)有所不同。

表3　白樺4個(gè)EXP蛋白特征

2.2白樺EXP家族基因在不同器官的表達(dá)

通過Real time RT-PCR分析白樺6個(gè)EXP基因在葉、葉柄、發(fā)育中的果實(shí)、當(dāng)年新生莖、芽、分生木質(zhì)部、應(yīng)拉木和對應(yīng)木分生木質(zhì)部的表達(dá)情況，從圖5可以看出：6個(gè)EXP基因在白樺的不同組織中表達(dá)模式不同，其中BpEXP1在未成熟的分生木質(zhì)部中表達(dá)量最高，其相對表達(dá)量是葉中的22倍，其次是葉柄、對應(yīng)木、當(dāng)年新生莖和應(yīng)拉木的分生木質(zhì)部部分；BpEXP3L在發(fā)育中的蒴果中表達(dá)量最高，是葉中的29倍，在其他器官和組織中表達(dá)量均較低。BpEXP2和BpEXPL主要在葉中表達(dá)，BpEXP4和BpEXP5在各組織中均有表達(dá)。

2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI對目的片段和pROKⅡ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，BpEXP1和BpEXPL基因的目的片段酶切后產(chǎn)物片段長度與全長基因長度一致(圖6)，載體經(jīng)酶切后，電泳結(jié)果顯示，酶切成功(圖6)。載體和目的基因純化產(chǎn)物分別用T4連接酶連接，然后將構(gòu)建的載體用熱激法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，在篩選平板上挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果為陽性的菌液，擴(kuò)增片段長度與基因編碼區(qū)長度一致，證明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4農(nóng)桿菌工程菌的獲得

將重組質(zhì)粒pROKⅡ-BpEXP1和pROKⅡ-BpEXPL用液氮轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，分別獲得過表達(dá)BpEXP1和BpEXPL基因的農(nóng)桿菌工程菌，隨機(jī)挑選進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果為陽性的菌液。擴(kuò)增片段長度與基因編碼區(qū)長度一致，證明成功獲得農(nóng)桿菌工程菌，可用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

3　結(jié)論與討論

EXP基因初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼的蛋白質(zhì)有3個(gè)主要的功能域，本研究對BpEXP1～BpEXP5的序列分析顯示這些蛋白具有EXP家族的典型特征：1)氨基末端1個(gè)信號肽(約22～25個(gè)氨基酸殘基，BpEXP1是前22個(gè)氨基酸)，其引導(dǎo)新生肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體，在成熟蛋白分泌前被切除，典型的成熟蛋白約為225個(gè)氨基酸，分子量為25～27 kDa，沒有糖基化位點(diǎn)[18]；2)除了預(yù)測的信號肽序列特征外，白樺EXPcDNA推導(dǎo)的氨基酸序列C-末端(大約10 kDa)有4個(gè)顯著的表面高度保守性且具有一定間距的色氨酸殘基的豐富域，類似于微生物中纖維素結(jié)合區(qū)域(CBD-like)的表面多糖結(jié)合部分，可能形成應(yīng)答EXP蛋白結(jié)合到細(xì)胞壁的區(qū)域[19]；3)2個(gè)區(qū)域間包含N-末端8個(gè)保守的半胱氨酸殘基的豐富域和中間的1個(gè)組氨酸(His-Phe-Asp，HFD)功能域，其中30%的序列類似于葡聚糖內(nèi)切酶的1個(gè)小家族(family-45)的催化域，可能具有催化特性，這個(gè)催化區(qū)域中的半胱氨酸很可能在二硫鍵的形成中起作用[20-21]。根據(jù)以上特征可以推測，這些保守的氨基酸在決定EXP多肽的空間結(jié)構(gòu)、促進(jìn)其與底物聚合物的結(jié)合或者影響EXP蛋白的活性等方面具有重要的作用[20,22]。在這6個(gè)蛋白中，5個(gè)EXP蛋白都具有典型的EXPA特征，也證明其屬于EXPA家族，因此本研究的命名合理。同時(shí)，BpEXP1～BpEXP5存在著一定的差異，而BpEXPL與其他蛋白差別較大，說明EXP基因的起源和進(jìn)化模式復(fù)雜，另一方面也說明EXP基因在功能上的多樣性，不同的EXP基因可能參與不同的代謝調(diào)控途徑。EXPA家族分為4個(gè)亞組[9-10]，聚類分析顯示BpEXP1蛋白屬于EXPA家族A亞組，A亞組的EXP一般在次生木質(zhì)部富集，序列特征在N端和C端具有保守性，即在信號肽后有保守的RIPGV氨基酸序列，在C-端有KNFRV保守序列。這一亞組的成員包括在次生生長相關(guān)組織特異表達(dá)的PttEXP1(AY435099)，OsEXP7(AF247164)，AtEXP4(AAB97125)，LeEXP1(U82123)和BnEXP1(AJ000885)。BpEXP1具有這2個(gè)保守的序列，因此，在序列特征上推測，BpEXP1與次生生長相關(guān)。

已有研究表明，每個(gè)擴(kuò)展蛋白基因在高度特定的位點(diǎn)和高度特定的細(xì)胞類型中表達(dá)，其表達(dá)在時(shí)間、空間上受到嚴(yán)格的調(diào)控且受到激素和環(huán)境因子的調(diào)控。這些蛋白作為細(xì)胞壁松弛和延伸的動(dòng)力，在植物組織中的表達(dá)模式與細(xì)胞和組織生長相一致[6]。白樺各器官和組織中的Real time RT-PCR分析顯示6個(gè)EXP基因在白樺的不同組織中具有不同的表達(dá)模式，也暗示了不同的白樺EXP具有不同的功能。木材細(xì)胞分化需要不同程度控制的細(xì)胞壁擴(kuò)展延伸，不同的細(xì)胞壁區(qū)域進(jìn)行各種程度和方向的伸展[23]。本研究顯示BpEXP1在分生木質(zhì)部、葉柄、當(dāng)年生莖、應(yīng)壓木和對應(yīng)木的分生木質(zhì)部中表達(dá)量較高，這些組織和器官主要進(jìn)行不同程度的次生細(xì)胞壁形成和次生木質(zhì)部生長。已有研究也顯示了一些EXP基因在木材形成相關(guān)組織特異表達(dá)，并對次生生長產(chǎn)生影響。雜種山楊PttEXP1在表現(xiàn)了次生生長的成熟莖中特異的表達(dá)，PttEXP5是發(fā)育中的應(yīng)拉木中主要表達(dá)的EXP[9]。中國山楊(P.davidiana)中過量表達(dá)PttEXP1能夠促進(jìn)莖間和葉的生長，木材纖維直徑增加[7]。杉木ClEXPA1和ClEXPA2主要在形成層區(qū)域表達(dá)，在煙草(Nicotianatabacum)中過表達(dá)這2個(gè)基因會(huì)導(dǎo)致植株高、徑生長增加、細(xì)胞壁纖維素含量增加和木質(zhì)部細(xì)胞壁增厚[10-11]。這些研究表明，EXP在調(diào)節(jié)維管分子分化過程中的細(xì)胞壁修飾中起作用。因此推測，BpEXP1也在調(diào)白樺木材形成過程中細(xì)胞壁修飾中起作用。應(yīng)拉木是在莖干響應(yīng)傾斜或者彎曲時(shí)的重力刺激產(chǎn)生的，從而導(dǎo)致了木材細(xì)胞形態(tài)和化學(xué)成分的變化，即膠狀纖維[24-25]。此外，木材的細(xì)胞組分也發(fā)生了變化，應(yīng)拉木導(dǎo)管分子變少，纖維細(xì)胞增加。因此，BpEXP1基因在正常木和應(yīng)拉木及對應(yīng)木中的表達(dá)方式有所不同。

根據(jù)序列分析和表達(dá)特性分析結(jié)果，BpEXP1基因可能參與白樺木質(zhì)部的發(fā)育，這種功能需要在轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。因此，本研究成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pROKⅡ-BpEXP1及pROKⅡ-BpEXPL，并制備了農(nóng)桿菌工程菌，為后續(xù)的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，可用于進(jìn)一步功能分析。

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(責(zé)任編輯張坤)

Gene Cloning and Construction of Plant Expression Vector of Expansin Genes inBetulaplatyphylla

Wang Zijian, Sun Dan, Yu Ying, Zhang Yan, Wang Chao

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding (Northeast Forestry University), Harbin Heilongjiang 150040，China)

Four full-length cDNAs and two partial cDNAs, designatedBpEXP1 toBpEXP5, andBpEXPL, encoding expansin homologues, were isolated fromBetulaplatyphylla. The open reading frames of four full-length cDNAs ranged from186 to 258 amino acids, with predicted molecular weights of 24.2 to 25.8 kDa and PI of 5.57 to 9.20.The deduced amino acid sequences of the five alpha-expansin include eight typical Cys residues in the N-termini of the proteins, four Trp residues near the C-termini and an HFD motif in the central region, which are all characteristic of expansins. Real time RT-PCR analyses in birch organs and tissues showed thatBpEXP1 was specifically expressed in developing xylem exhibiting secondary growth, and was presumed thatBpEXP1 was involved in the cell wall modification during the wood formation. By contrast,BpEXP3 was mostly expressed in developing capsule, and then was presumed thatBpEXP3 was involved in the cell wall modification during the seed development. Finally,BpEXP1 andBpEXPLwere chosen to construct the plant expression vector of pROKII-BpEXP1 and pROKII-BpEXPL.

Betulaplatyphylla; expansin; sequence analysis; Real time RT-PCR; vector construction

2015-06-29

國家自然科學(xué)基金 (31470671)資助；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)(DL12CA07)資助。

王超(1979—)，女，博士，副教授。研究方向：林木基因工程。Email:：23628621@qq.com。

10.11929/j.issn.2095-1914.2016.01.001

S718.46

A

2095-1914(2016)01-0001-08

第1作者：王子劍(1991—)，女，碩士生。研究方向：林木基因工程。Email：693718177@qq.com。