升清降濁方對MSG肥胖大鼠胰島素增敏作用的影響*

杜 娟，張德芹，文 靜，黃春麗，張青霞，周文龍，劉 花

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

Abstract:［Objective］To observe the effects of Huangdi Jixian decoction guided by “reinforcing and reducing，adjustment the balance”method on the FBG and HbA1c in type 2 diabetic rats.［Methods］Sixty male SD rats of clean grade，randomly selected 10 rats as the normal control group，the remaining 50 of given high fat diet add disposable small dose of intraperitoneal injection of STZ add stress to induce rat model of type 2 diabetes mellitus.After the success of modeling，50 rats were randomly divided into model group，western medicine group，Chinese medicine treatment of low，medium and high dose groups，10 rats in each group.All groups were treated 8 weeks，before and after administration of the body weight，the determination of FPG，HbA1c were administered.［Results］Western medicine treatment group，Chinese herbal medicine in high，medium and low dose group rats were improved in general condition after treatment.The weight in the high dosage group of Chinese medicine increased significantly than those in the other four groups（P＜0.05）.The FBG in the western medicine treatment group，Chinese medicine of high，middle dose group were decreased significantly than model group（P＜0.05 or 0.01）.Traditional Chinese medicine of high dose can significantly reduced HbA1c.［Conclusion］Huangdi Jixian decoction can obviously improve the diabetic rats in general condition，significantly reduced blood glucose and HbA1c.
Key words:Type 2 diabetes；Huangdi Jixian decoction；FBG；HbA1c

升清降濁方對MSG肥胖大鼠胰島素增敏作用的影響*

杜 娟，張德芹，文 靜，黃春麗，張青霞，周文龍，劉 花

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 300193）

［目的］研究升清降濁方（SQJZF）對L-谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠胰島素增敏作用的影響及其機制研究。［方法］復制MSG肥胖大鼠模型，隨機分為模型對照組、陽性藥羅格列酮組、陽性藥非諾貝特組、SQJZF高劑量組（含生藥6 g/kg）、SQJZF中劑量組（含生藥3 g/kg）、SQJZF低劑量組（含生藥1.5 g/kg），另取正常組大鼠8只。連續(xù)給藥50 d后，分別檢測大鼠血清瘦素和肌糖元含量；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測藥物對MSG大鼠骨骼肌過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）、瘦素（Leptin）、胰島素受體底物-1（IRS-1）、胰島素受體底物-2（IRS-2）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）的基因表達水平。［結(jié)果］模型組MSG大鼠肌糖元和血清瘦素含量顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），相關(guān)基因PPAR、Leptin、IRS-1、IRS-2、GLUT4的相對表達顯著降低（P＜0.01）；給藥50 d后，各給藥組肌糖元和血清胰島素含量均有降低，對相關(guān)基因的相對表達均有一定的調(diào)節(jié)作用。［結(jié)論］升清降濁方可能通過激活PPAR受體，調(diào)控Leptin基因的表達，增加胰島素的敏感性。

升清降濁方；MSG肥胖大鼠；胰島素抵抗

升清降濁方（SQJZF）來源于臨床經(jīng)驗方，由桑葉、荷葉、丹參等中藥組成，具有升清降濁，化瘀消痞的功效，是治療糖尿病前期糖脂代謝紊亂的有效方劑。已有實驗研究表明，升清降濁方對自發(fā)性2型糖尿病模型KK-Ay和實驗性2型糖尿病模型小鼠有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用［1-3］，對四氧嘧啶模型大鼠有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂的作用［4］，對高脂血癥家兔有降低血脂，提高脂解酶活性的作用［5-6］。有學者研究發(fā)現(xiàn)，噻唑烷二酮（TZD）類代表藥物羅格列酮主要作用機制是選擇性的激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），不僅能夠促進脂肪前體細胞分化為脂肪細胞，同時還能增加脂肪組織對胰島素的敏感性［7］，加速外周組織對葡萄糖的攝取和利用，并且還能夠抑制瘦素（Leptin）的過量表達，從而達到降低血糖，增加胰島素的敏感性，改善胰島素抵抗的作用［8］。本次實驗將通過復制L-谷氨酸鈉（MSG）肥胖大鼠，來進行升清降濁方胰島素增敏作用的機制研究。

1 材料

1.1 實驗動物 Wistar孕鼠24只，由天津?qū)嶒瀯游镏行奶峁?，合格證號SCXK（津）2010-0002。孕鼠單籠飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，屏障環(huán)境，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。

1.2 飼料 高脂飼料配方為：10%豬油，1.5%膽固醇，0.25%膽鹽，10%蔗糖，78.25%基礎(chǔ)飼料，由北京諾康源生物科技有限公司提供。

1.3 藥物 升清降濁方：棕色干膏粉，出膏率為100g生藥含11.11g干膏粉（1g干膏粉的生藥含量為9.00 g），批號2010911，由天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院藥學部提供。陽性對照藥羅格列酮［葛蘭素史克（天津）有限公司，批號10125188］。陽性對照藥非諾貝特（Laboratoires Fournire S.A.，批號15135），MSG（美國Sigma-Aldrich，批號BCBF3631V）。

1.4 試劑 Rat leptin RayBio@ELISA Kit（美國Ray-Biotech，Inc公司，批號20120312），肌糖元檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20120103），Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號l15596018），SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國Applied Biosystems公司，批號 4367659），High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit試劑盒（美國AppliedBiosystems公司，批號4368814），引物合成（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，批號201205）。

1.5 實驗儀器 ALLEGRA-64R高速離心機（美國Beckman Coulter有限公司），F(xiàn)lexStation3多功能微孔板分析儀（美國Molecular Devices公司），PC-1000 PCR逆轉(zhuǎn)錄儀（美國Perkin Elmer儀器公司），7500 Real-Time PCR system實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 模型的建立 取Wistar孕鼠24只，飼養(yǎng)于清潔級動物房。新生鼠于出生第2天起，皮下注射MSG，注射劑量3 g/kg［9］，正常組注射等量生理鹽水，每隔1 d注射1次，連續(xù)7次。21 d后斷乳，MSG組及正常組均按雌雄分籠飼養(yǎng)，正常組給予普通飼料，MSG模型組給予高脂飼料。定期記錄體質(zhì)量，觀察體型變化。第8周時，禁食不禁水8 h檢測空腹血脂的含量及糖耐量2 h后血糖，以血脂含量和糖耐量2 h血糖高于正常組為成模標準。

2.2 分組給藥 篩選成模雄性大鼠48只，采用隨機區(qū)組法隨機分為模型組、羅格列酮組、非諾貝特組、升清降濁方高、中、低劑量組（含生藥6、3、1.5 g/kg）6組，每組8只。另取Wstiar雄性大鼠8只為正常組。羅格列酮組給藥劑量為5 mg/kg［10］，非諾貝特組給藥劑量為100 mg/kg［11］，SQJZF高劑量組給藥劑量為含生藥6 g/kg，SQJZF中劑量組給藥劑量為含生藥3 g/kg，SQJZF低劑量組給藥劑量為含生藥

1.5 g/kg，灌胃體積為10 mL/kg，正常組和模型組灌胃同體積5%阿拉伯膠水溶液。每日上午灌胃1次，連續(xù)灌胃50 d。每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量。

2.3 標本采集 給藥8周后大鼠禁食（不禁水）8 h，

3.5 %水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血并離心取血清，迅速剖去肝臟和骨骼肌，液氮速凍后一并移入-80℃冰箱冷貯備用。

2.4 檢測方法

2.4.1 肌糖元的檢測 取骨骼肌組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干水分，準確稱重，加3倍量堿液煮沸20 min，制備組織水解液，采用蒽酮法檢測，讀取620 nm波長下吸光度（A），計算肌糖元含量。

2.4.2 血清瘦素含量的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），讀取450 nm波長下吸光度（A），計算血清瘦素含量。

2.4.3 實時熒光定量PCR檢測基因的表達 骨骼肌組織研磨后，Trizol法提取總RNA，檢測RNA樣品純度符合實驗要求。每10 μL體系2 000 ng總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：25℃，10 min；37℃，120 min；85℃，5 min，4℃，∞，-20℃保存。取2 μL cDNA進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內(nèi)參，加入上下游引物各0.5 μL，SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，無酶雙蒸水補足至總反應體系20 μL，于PCR儀中進行反應。用2-△△CT方法計算各基因的表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

2.5 統(tǒng)計方法 采用SPSS 18.0軟件，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），偏態(tài)分布組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對肌糖元含量的影響 模型組MSG大鼠肌糖元含量與正常組相比顯著升高（P＜0.01）；給藥50 d后，與模型組相比，各給藥組均顯著降低MSG大鼠肌糖元含量（P＜0.01）。見表2。

3.2 對血清瘦素的影響 模型組MSG大鼠血清瘦素含量與正常組相比顯著升高（P＜0.05）。給藥50 d后，與模型組相比，非諾貝特組顯著降低血清中瘦素含量（P＜0.05），其他各給藥組均降低血清瘦素含量，但差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

3.3 對相關(guān)基因表達的影響 模型組MSG大鼠骨骼肌相關(guān)基因PPARγ、胰島素受體底物-1（IRS－1）、胰島素受體底物-2（IRS-2）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4 （GLUT4）的相對表達量與正常組相比顯著降低（P＜0.01），Leptin的相對表達量與正常組相比顯著升高（P＜0.01）。給藥50 d后，與模型組相比羅格列酮組和SQJZF高、中、低劑量顯著升高PPARγ的基因相對表達量（P＜0.01），非諾貝特組和SQJZF高、中、低劑量顯著降低Leptin的基因的相對表達量（P＜0.01），羅格列酮組、非諾貝特組和SQJZF中、低劑量均顯著升高IRS-1的基因相對表達量（P＜0.01），羅格列酮組和SQJZF高、中、低劑量組顯著升高IRS-2的基因相對表達量（P＜0.01或P＜0.05），各給藥組均顯著升高GLUT4的基因相對表達量（P＜0.01）。見表3。

表2 SQJZF對MSG大鼠肌糖元和血清瘦素的影響（±s）

表2 SQJZF對MSG大鼠肌糖元和血清瘦素的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組模型組羅格列酮組非諾貝特組SQJZF高劑量組SQJZF中劑量組SQJZF低劑量組n 8888888瘦素（μg/L）- 1.85±0.11** 3.56±1.96*- 2.44±0.22 19.00±7.20 5 mg/kg 1.93±0.21** 9.45±5.25 100 mg/kg 1.80±0.13** 3.71±2.17*生藥6 g/kg 1.84±0.17** 10.28±5.05生藥3 g/kg 1.80±0.12** 10.99±6.80生藥1.5 g/kg 2.07±0.19** 12.43±8.44給藥劑量 肌糖元含量（mg/g）

4 討論

大量研究證明，2型糖尿病患者及肥胖癥患者體內(nèi)糖代謝紊亂，伴隨糖耐量異常，胰島素耐量異常，胰島素抵抗。胰島素抵抗的首要表現(xiàn)為脂肪酸代謝異常，可促進脂肪沉積，進一步導致胰島素抵抗［12-13］。其次，脂肪細胞肥大是導致胰島素抵抗的又一主要因素。脂肪細胞的增大，一方面會降低脂肪組織對外周組織胰島素的敏感性，另一方面造成了脂肪組織中特異性的脂肪酸結(jié)合蛋白（aP2）以及葡萄糖轉(zhuǎn)運體（GLUT4）的結(jié)合能力下降，因而造成胰島素抵抗［14］。此外，脂肪細胞因子紊亂也能夠?qū)е乱葝u素抵抗，這些細胞因子包括脂聯(lián)素（Adiponectin）、瘦素（Leptin）、腫瘤壞死因子（TNF-α）。

胰島素抵抗是機體對胰島素的反應減退，表現(xiàn)為外周組織尤其是肝臟和肌肉組織對葡萄糖的利用降低，2型糖尿病患者均有不同程度的胰島素抵抗。瘦素（Leptin）是能量平衡的一種關(guān)鍵因子，主要貯存于密度較低的分泌囊泡中，在調(diào)節(jié)因子等的作用下以胞吐的形式釋放出來。在2型糖尿病患者中，Leptin可能參與血糖平衡的調(diào)節(jié)。大量研究證明，PPARγ激動劑TZD類藥物可以降低 Leptin mRNA及蛋白的表達水平，改善胰島素所介導的葡萄糖的代謝作用［15］。

IRS蛋白在胞內(nèi)保持正常的水平和活性是胰島素發(fā)揮正常功能的重要條件。其中在葡萄糖轉(zhuǎn)運的調(diào)控中發(fā)揮重要作用的是IRS-1與IRS-2［16-17］。IRS表達的不正?？赡苁菍е乱葝u素信號轉(zhuǎn)導出現(xiàn)障礙進而引發(fā)胰島素抵抗的機制之一［18］。另外，機體內(nèi)靶組織GLUT4表達的減少及活性的降低，與胰島素抵抗的發(fā)生有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，GLUT4在2型糖尿病患者體內(nèi)脂肪細胞中的表達明顯減少，GLUT4水平下調(diào)并明顯抑制脂肪細胞GLUT4的轉(zhuǎn)位及對葡萄糖的攝取，表現(xiàn)為胰島素信號轉(zhuǎn)導減弱并最終導致胰島素抵抗［19-21］。

本次實驗顯示，給藥50 d后，MSG大鼠血清中瘦素水平和骨骼肌糖元含量都顯著降低。骨骼肌中PPARγ基因的表達水平顯著升高，并且Leptin表達水平顯著降低，IRS-1、IRS-2和GLUT4基因的表達水平均顯著升高。升清降濁方可能通過激活PPARγ受體，調(diào)控Leptin基因的表達，增加胰島素的敏感性。并為后期升清降濁方胰島素增敏作用的研究打下基礎(chǔ)。

表3 SQJZF對MSG大鼠骨骼肌相關(guān)基因表達的影響（±s）

表3 SQJZF對MSG大鼠骨骼肌相關(guān)基因表達的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 給藥劑量 PPARγ Leptin IRS-1 IRS-2 GLUT4正常組- 1.01±0.16** 1.08±0.44** 1.09±0.47** 1.02±0.20** 1.00±0.66**模型組- 0.40±0.18 8.52±0.34 0.28±0.02 0.33±0.03 0.76±0.07羅格列酮組 5 mg/kg 1.44±0.30** 2.40±0.39 0.57±0.10** 1.15±0.18** 2.24±0.09**非諾貝特組 100 mg/kg 0.31±0.11 0.33±0.21** 0.64±0.03** 0.34±0.23 1.64±0.08** SQJZF高劑量組 生藥6 g/kg 1.04±0.19** 0.88±0.48** 0.21±0.04 1.06±0.33* 2.06±0.09** SQJZF中劑量組 生藥3 g/kg 0.82±0.26** 2.12±0.66** 0.51±0.06** 1.60±0.10** 2.15±0.10** SQJZF低劑量組 生藥1.5 g/kg 1.41±0.27** 3.38±0.51** 0.87±0.08** 3.81±0.46** 2.82±0.16**

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Effects of shengqing Jiangzhuo prescription to improve the insulin sensitivity of MSG rats

DU Juan，ZHANG De-qin，WEN Jing，HUANG Chun-li，ZHANG Qing-xia，ZHOU Wen-long，LIU Hua
（TCM Research Institute，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

R587.1

A

1673－9043（2016）01－0027-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.08

國家自然科學基金資助項目（81173373）。

杜 娟（1987-），女，碩士研究生，從事中藥基本理論及臨床應用研究。

張德芹，E-mail：deqin123@163.com。

（2015-10-17）